基因�、�型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用
葛胜祥, 郭清顺,李少伟, 张军, 夏宁邵
(福建省医学分子病毒学研究中心,厦门大学 � 361005)
摘要 :设计针对国内流行的戊型肝炎病毒( HEV )基因�、�型,在这两型序列的保守区域设计了一套 RT-PCR引物
� � � E引物, 并将 E 引物与目前较常用的 3 对通用引物( Meng、ConORF1 和 ConORF2 引物)比较了
基因�、�
型HEV 的灵敏度。对基因�型HEV, E 引物能检出的稀释度为 105 ,参考引物能检出的稀释度为 102~ 104; 对基因
�型HEV, E 引物能检出的稀释度为 102,参考引物能检出的稀释度为101~ 102。在 17 份HEV-IgM 阳性血清中, E
引物检出 5 份,检出率为 29. 4% ; 参考引物只能检出 1 份或 2 份,检出率最高为 11. 8%。E 引物在 33 份 HEV-IgM
阳性的隐性感染血清中检出 6 份,阳性率 18. 2% ;在 79份 HEV-IgM 阳性的临床肝炎血清中检出 36 份,阳性率45.
6%。以上结果初步
明, 对于在国内流行的基因�、�型 HEV, E 引物的检测灵敏度要高于目前常用的通用引物。
关键词:戊型肝炎病毒; 基因 I 型;基因 IV 型;聚合酶链反应; 通用引物
中图分类号: Q78 � � 文献标识码: A � � 文章编号: 1000- 8721( 2005) 03- 0181- 08
收稿日期: 2004- 09- 07;修回日期: 2004- 12- 14
基金项目:福建省科技重大专项( 2004YZ01)。
作者简介:葛胜祥( 1976- ) ,男,博士研究生。
通讯作者:夏宁邵, 361005厦门大学福建省医学分子病毒学研
究中心。( E-mail: nsxia@ jingxian. xmu. edu. cn)
� � 戊型肝炎病毒( Hepatitis E virus, HEV)是经肠
道传播的非甲非乙型肝炎的主要病原体之一[ 1] , 既
可以引起大规模的暴发和流行[ 2- 5] ,也可以引起散
发型病例[ 6- 8]。RT-PCR 是 HEV 感染确诊的重要
手段之一。HEV 为单链 RNA 病毒, 其基因虽说相
对稳定,同一次暴发不同毒株间同一性高,在猕猴中
多次传代基因不易漂移[ 9] , 但不同地域分离株间基
因变异较大,因此保守引物的选择成了 PCR诊断灵
敏度的关键。
检测临床标本中HEV RNA的通用引物已有一
些报道,扩增的目的片段主要集中于 ORF1的 5�端
和ORF2中部这两个保守区域。Meng 等[ 10]于缅甸
株 5 687~ 6 319nt 的位置设计了一套套式 PCR
( nPCR)引物, 并于美国猪中分离出首株动物源性
HEV RNA。尔后, Wang 等[ 11]用该引物于中国家
畜中检出多株 HEV RNA。Li等[ 12]用该引物分析
了中国 14个城市戊型肝炎(戊肝)患者 HEV 基因
的变异。Wang 等[ 13]于两个保守区域设计了另两套
通用引物 � � � ConORF1 和 ConORF2, 这是目前应
用最广的引物之一[ 14- 20]。笔者为了检测中国不同
地区戊肝散发病例和隐性感染者,分别合成了上述
3套引物,但在实际应用中检出率不尽如人意。因
此,笔者针对目前国内只报道过基因 �型和�型的
事实,设计和评价了一套以 �、�型为主兼顾 II、III
型的通用引物, 并初步应用于临床标本中 HEV
RNA的检测。
与方法
1 � 血清标本 � 收集抗HEV-IgM [ 21]阳性的健康献血员血清
33 份, 临床急性戊肝血清 79 份。健康献血员血清来源于湖
州血站。79 份临床急性戊肝血清中, 43 份来自广西疾病预
防与控制中心肝炎室, 15 份来自北京地坛医院, 21 份来自北
京佑安医院。
2 � 粪便标本 � 基因�、�型粪便均来自广西疾病预防控制
中心试验感染猴。
3 � 引物合成 � 根据文献报道的通用引物序列( Meng 等[ 10] :
引物 3156、3157、3158、3159; Wang 等[ 13] : 引物 ConORF1s1、
ConORF1a1、ConORF1s2、ConORF1a2; 引 物 ConORF2s1、
ConORF2a1、ConORF2s2、ConORF2a2) , 由上海博亚公司合
成 3 套套式 PCR 引物, 分别由 2 条正向引物和 2 条反向引
物组成。将 33条全长的 HEV 序列用MegAlign 中 Clustal算
法同源列队后, 于�、�型保守处设计出一套 nPCR 的引物,
并命名为 E(表 1)。为了避免一条引物内出现太多的简并碱
基,将引物 E4 分成两条设计, 这两条引物位置相同, 但针对
的变异株不同, 前一条主要针对基因�型, 后一条主要针对
基因�型。使用时将这两条引物等量混合作为 nPCR 的内
侧反向引物。
4 � RT-PCR 检测和测序 � 取 250�l 血清, 用 T rizol 试剂
(G IBCO 公司 ) 按其操作说明提取, 20�l 体积反转录。
Meng、ConORF1和 ConORF2 引物按参考文献提供的方法操
作[ 10, 11]。E引物 RT-PCR程序为: 用 E5 作反转录引物,
第 21卷 � 第 3期
2 0 0 5 年 5 月 � � � � � � � � � � � �
病 � � 毒 � � 学 � � 报
CHINESE JOURNAL OF VIROLOGY
� � � � � � � � � � � � Vol. 21 � � No. 3
May � 2 0 0 5
表 1 � HEV RT-PCR 引物序列
Table 1 � The primers� sequences for HEV RT-PCR
Primer S equence# Site*
E1 CT GTT TAAYCTTGCTGACAC 6260-6279nt
E2 GACAGAATT GATTT CGTCG 6298-6316nt
E4-1 T GTT GGTT RTCATAATCCTG 6486-6467nt
E4-4 T GCTGGT TATCGT AATCCTG 6486-6467nt
E5 WGARAGCCAAAGCACAT C 6568-6551nt
� � # . Y= C/T , R= A/ G, W= A/ T.
* . Sites on the genom e of Burma strain ( GeneBank accession
number: D10330) .
AMV 反转录酶 42 � 反转录 40min。第一轮 PCR 引物为
E1、E5, 反转录模板加 2�l, 总体积为 20�l; 94� 预变性 5min;
94 � 变性 30s, 53� 复性 30s, 72� 延伸 40s, 35 个循环; 72�
延伸 5min。第二轮 PCR 引物为 E2、E4, 加 2�l第一轮产物
为模板, 总体积为 20�l; 94 � 预变性 5min; 94� 变性 30s,
53 � 复性 30s, 72� 延伸 40s, 35 个循环; 72 � 延伸 5min。E
引物扩增片段用胶回收试剂盒(上海华舜公司)回收纯化, 连
接入 pMT-18载体(大连宝生物公司) ,由上海博亚公司进行
序列测定。从湖州地区无偿献血员中分离出的毒株片段的
命名以� hz�开始;从南宁地区戊肝患者中分离出的毒株命名
以� n�或� NN�开始; 从北京地坛医院或北京佑安医院戊肝患
者中分离出的毒株命名分别以� DT�或� YA�开始。
5 � 同源性分析与进化树生成 � 同源性分析参比的 33 株
HEV 全长序列如下: 缅 甸株 ( B1, GenBank 录入号为
D10330; B2, M73218 ) , 巴 基 斯坦 株 ( P1, M80581; P2,
AF185822) , 印度株 ( I1, X98292; I2, X99441; I3, AF076239;
I4, AF459438 ) , 中国 株 ( C1, D11092; C2, D11093; C3,
L08816; C4, L25547; C5, M94177; Cv1, AB108537; Cv2,
AJ272108) , 乍得株 ( Chad1, AY204877) , 墨西哥株 ( M1,
M74506) ,美国株( U s1, AF060668; Us2, AF060669) , 日本株
( J1, AB074918; J2, AB074920; J3, AP003430; J4, AB099347;
J5, AB091394; J6, AB097812; J7, AB080575; J8, AB074917;
J9, AB074915) , 美国猪株 ( swUS1, AF082843) , 加拿大猪株
( swCa1, AY115488) , 日本猪株 ( swJa1, AB073912; swJa2,
AB097811)。各序列采用 MegAlign( Laser gene软件包, Dnas-
tar Inc)进行同源列队。同源队列用 MEGA 软件包( 3. 0 Beta
version, ww w. megasoft ware. net ) 中的 Neighbor- Joining 法
( Kimura-2-parameter 模型) 生成进化树, 并用 Bootstrap 法
( Replication 值为 250)验证。Bootstrap 值大于 70%的系统进
化分组被认为有足够的支持证据。
结 � � 果
1 � 引物分析
1. 1 � E 引物的同源性和特异性分析 � E1引物第 9
位的兼并碱基,是 15条基因 �型全长序列和 8条基
因�型全长序列的主要变异位点(图 1)。就全部 4
图 1� E 引物与 33 条 HEV 全基因序列的同源比较
F igure 1 � The homologous compar ison of E pr imer set w ith the genomes of thirty- three HEV strains
�182� 病 � � 毒 � � 学 � � 报 � � � � � � � � � � � � � � � � � 21 卷 �
个基因型而言, E1 3�端的第 3个碱基也是一个高变
位点。E1在基因�、�、�型序列中保守, 但与 �型
同源性较差。E2引物除了第 10位G有零星突变为
A外,在 4个基因型中均保守。E4引物 3�端第 6个
碱基在少数序列中有突变外, 其余的 4个基因型序
列均能与此混合引物很好配对。E5 引物能与全部
23条 �、�型序列配对,但其 3�端在 �、�型中变异
大。因此, E引物适合于检测�、�型HEV 序列。
同时,为了检验引物的特异性,将此四条引物于
GenBank数据库进行 BLAST 分析, 并未发现能配
对非 HEV序列,表明此引物的特异性较好。
1. 2 � E引物的基本参数分析 � 为了解 E 引物的基
本理化性质, 用软件 Oligo6. 0分析了引物的解链温
度( T m)、Loop 值( Loop Tm )以及 GC 含量(表 2)。
可见各引物的 GC 含量和 Tm 值适中, 且在配对的
两条引物间相差无几; 各引物均未有明显的Loop结
构。同时, P rimer 软件分析结果显示, 各引物自身
和引物间二聚体的形成不明显。
表 2 � E引物的 Tm值、Loop值和 GC含量
Table 2 � Tm, Loop Tm and GC% of E pr imers
Primer
Length
( bp)
Tm
( � )
Loop Tm
( � ) GC%
E1 20 54. 9- 57. 6 � 40- 45
E5 18 55. 9- 56. 8 � 44. 4- 50
E2 19 57. 7 3 42. 1
E4 20 58. 0- 60. 9 � 35- 45
1. 3 � 目的片段的同源性分析 � 为了确定 E 引物扩
增出来的片段能否用于基因分型,我们将上述 33株
全长HEV 序列 ORF2的相应区段( 6 317~ 6 466nt,
共 150bp)进行同源性分析, 绘制进化树, 并与根据
全长序列生成的进化树进行比较。
图 2� E 引物扩增片段绘制的进化树( A )与 HEV基因组进化树( B)的比较
F igur e 2 � Compar ison of nucleotide phylo genetic trees protracted by the amplified fragments o f E primer set ( A)
and by the complete genomes of HEV ( B)
Details and accession numbers for the sequences used for comparison are provided in Materials and M ethods.
� � 从图 2可以看出, E 引物扩增的目的片段与全
基因组绘制的系统树不完全一致,但分型结果完全
一致。Schlauder 等[ 22]曾将与 E 引物扩增片段几近
相同的 148bp 的 ORF2片段( 6 322~ 6 469nt )用于
�183�� 3 期 � � � � � � � � 葛胜祥等: 基因�、�型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用
HEV各分离株的同源性分析, 也得出同样的结果。
此外,一个包含于 E 引物目的片段中的更小片段
( 6 369~ 6 466nt , 98bp)也常用于 HEV 的序列分
析[ 13]。
2 � 与已报道引物的比较
为了遴选更适合于诊断中国境内的临床戊型肝
炎(以基因 �型和基因�型为主)的引物,比较了 E
引物和目前被广泛应用的、已报道的通用引物
( Meng 引物, ConORF1引物和 ConORF2引物)对已
知�型和�型 HEV 的扩增效率, 并同时评价这些
引物在 17份抗-HEV IgM 抗体阳性的随机血清中
的检出率。
2. 1 � 扩增效率比较 � 将两份分别含基因 �型和�
型HEV的猕猴粪便,用 PBS( 20mmol/ L , pH7. 2)制
成 10%的粪悬液上清, 再梯度稀释 101~ 106 倍, 分
别用上述四种引物检测梯度稀释液中的 HEV,结果
如表 3。对基因�型HEV 的检测, E 引物的灵敏度
均要高于其它 3对引物;对基因�型 HEV 的检测,
E 引物的灵敏度与 Meng 引物和 ConORF1 引物持
平,要高于 ConORF2引物。
表 3� 不同引物对基因�、�型 HEV的扩增灵敏度比较
Table 3 � Compar ison of t he sensitivity o f differ ent primer
sets on PCR detecting of genotype I or IV HEV
HEV
Primer
Meng ConORF1 ConORF2 E
Genotype I 104 104 102 105
Genotype IV 102 102 101 102
2. 2 � 检出率的比较 � 从广西省疾病预防控制中心
提供的HEV-IgM 阳性临床肝炎血清中随机选取 17
份标本,并用上述 4对引物平行检测其中的 HEV
RNA。E引物检出了其中 5份, 分别为 n3、n6、n7、
n8和 n9;其它引物的检出数均要少于 E 引物,且阳
性标本均在 E引物检出的 5份标本之内。现将这 5
份标本各引物检测的结果列于表 4。E 引物的阳性
率为 29. 4%,要明显高于其它 3对引物, 同时也要
高于 ORF1和 ORF2保守区引物联用方案。将 5份
标本用 E引物扩增的 PCR产物测序,并将其序列进
行进化树分析, 其中有 4 份为基因�型,仅标本 n9
为基因�型。可见, E 引物比目前所发表的通用引
物更适合于对基因 �、�型 HEV的检测。
表 4 � 四种引物对 17 份 HEV-IgM 阳性临床肝炎标本的检
出情况
Table 4 � The PCR results of 17 HEV- IgM reactive clinical
serum samples amplified w ith four primer sets
Primer set
Tested
no.
Posit ive sample
n3 n6 n7 n8 n9
Posit ive
rate ( % )
Meng 17 - + - - - 5. 9
ConORF1 17 - + - + - 11. 8
ConORF2 17 - - - + - 5. 9
E 17 + + + + + 29. 4
3 � E引物的初步临床应用
共收集了 HEV- IgM 阳性的 79份散发型肝炎
的临床血清和 33份 ALT 正常的献血员血清(隐性
感染者) ,并用 E引物对这些标本做 PCR 筛查并将
PCR产物测序并做进化树分析,结果如表 5、图 3。
在 33 份 HEV- IgM 阳性的隐性感染标本中有 6份
HEV PCR阳性, 阳性率 18. 2%。在不同次收集的
临床肝炎标本中, PCR阳性率从 33. 3% ~ 85. 7%不
等,平均达 45. 6%。在总共36份 HEV PCR阳性的
临床标本中, 33份为基因�型,占 90%以上。
表 5� 不同来源抗 HEV-IgM阳性血清中的 E引物 PCR 结果
Table 5 � The PCR result using E pr imer set on different clinical sera with ant-i HEV IgM
Source
of sera
Clinical status
T ested
no.
Positive no.
Total Genotype I Genotype IV
Posit ive
rate ( % )
Blood bank Subclinical 33 6 4 2 18. 2
Hospital A Acute h epat it is 36 12 1 11 33. 3
Hospital B Acute h epat it is 7 6 0 6 85. 7
H ospital C Acute h epat it is 15 9 2 7 60. 0
Hospital D Acute h epat it is 21 9 0 9 42. 9
Total
Subclinical 33 6 4 2 18. 2
Acute h epat it is 79 36 3 33 45. 6
� � 7个基因 �型的序列分别来源于北京(医院 C
和D)、浙江(血站)和广西(医院 A) ,相互间同源性
为96. 7% ~ 100%, 表明在各地引起隐性感染和临
床散发病例的�型分离株变异不大,与HEV 4个基
因型中 �型最为保守的看法一致。而属于基因�型
的 35 个序列变异大, 相互间同源性为 84% ~
100%,并有一定的地域性:来自北京(医院 C和 D)
的分离株相互接近, 而来自广西(医院 A 和 B)的分
�184� 病 � � 毒 � � 学 � � 报 � � � � � � � � � � � � � � � � � 21 卷 �
离株也相互聚集(图 3)。大体可以将基因�型分离
株分为两个群, Group1和 Group2,但 Bootst rap分析
只支持 Group 1 的分群 ( Group1 的 Bootst rap 值为
100% )。Group 1包括 7株分离自北京的毒株和参
考序列 Cv1, 群内同源性为 92. 7% ~ 100%; Group 2
群内序列变异较大,同源性从 88. 6%到 100%不等,
并且 Bootst rap分析不支持其分群,但因其群内序列
与 Group 1 群内序列的差异较大, 群间同源性为
84%~ 90. 7%,因此与 Group 1对应, 将其定义为一
个群。
图 3 � 42 份 E 引物阳性标本的进化树分析
Figure 3 � Phylogenetic analysis of fourt y- two E primer set detected samples
� represent the reference sequences, their details and accession numbers are provided in Materials and Methods.
讨 � � 论
目前, 一般将HEV 分为 4个主要的基因型: 基
因�型流行于亚非多数国家, 以缅甸株为原型株; 墨
西哥株为基因�型, 此外还包括尼日利亚株[ 23]和新
近于纳米比亚发现的两株[ 24] ; 从美国、部分欧洲国
家(意大利、希腊、西班牙等)和阿根廷的急性戊肝患
者中分离的 HEV 株[ 14- 16, 25, 26]是为基因 �型; 基
因�型由最近在中国发现的新的分离株组成[ 13] , 包
括中国台湾株[ 27]和部分日本株[ 7]。4 个基因型间
的HEV 序列的同源性小于 81%, 而在各基因型内
部,除了基因 �型各序列间的同源性高于 90%外,
其它各型变异均较大[ 22]。基因 �型的纳米比亚株、
墨西哥株、尼日利亚株三者间的同源性为 80% ~
90%
[ 23, 24]
; Schlauder 等[ 22]将 2001 年前发表的基
因 �型序列分为 5个亚型,各亚型间的同源性小于
88%;基因�型与基因 �型一样,目前只报道过散发
型病例, 其变异度也较大, 一些日本的分离株与
Wang 等报道的�型原型株(中国变异株)的同源性
小于 90%。
目前较多报道的 HEV PCR 引物有 Meng、
ConORF1 和 ConORF2。Meng 引物是 Meng 等[ 10]
于 1997年为了克隆美国本土 ant-i HEV 抗体阳性的
猪中的HEV 序列设计的通用引物。由于当时基因
�型还未发现,其设计引物的参考序列主要为基因
�型、�型和少量的�型。通过与上述的 33条全长
序列对比,此套引物中的某些引物的 3�端与几乎全
�185�� 3 期 � � � � � � � � 葛胜祥等: 基因�、�型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用
部8 条 �型序列出现了不匹配。1999 年, Wang
等[ 13]为了检测多份采集于国内的非甲-戊型临床散
发型急性肝炎标本, 分别在HEV ORF1和 ORF2的
两个保守区设计了 ConORF1 和 ConORF2 两套引
物。此次试验首次发现了 HEV 基因 �型序列, 但
在设计引物时没有也不可能考虑到基因�型。与
33条全长序列的同源性分析表明, ConORF1 的两
条正向引物同源性较高, 在 4个基因型中变异不大,
但两条反向引物的 3�端在几乎所有的�型序列中
出现了 1~ 2个碱基的突变。ConORF2的外侧反向
引物 3�端的第 6个碱基在 8个�型序列中有5株出
现突变,其内侧反向引物在外侧反向引物的基础上
仅有 3个碱基的位移,不仅同样有不匹配的问题, 还
会导致一定的假阳性。
本研究设计的 E 引物的扩增区段与 ConORF2
大致相同,且有两条引物的位置相同。但 E引物在
设计时参考了大量的�型序列并放弃了与众多�型
序列的匹配,虽然降低了引物的通用性,但在以流行
HEV 基因�型和�型为主的区域应用时拥有更大
的优势。这一优势在平行检测 17 份 HEV-IgM 阳
性血清时, E引物比其它引物明显要高的阳性率得
到了验证。
在以往的报道中[ 12, 13, 28] , 国内散发性临床戊
型肝炎中基因�型所占的比率从 9%到 62. 5%不
等,总体上基因 �型和�型的比例大致相当。在本
研究中,基因�型比率达到了 91. 7%( 33/ 36) , 明显
要比以往报道的要高。其原因可能与选择的样本有
关,也可能是 E引物进一步提升了对基因�型的检
出率。
本研究从北京地区戊肝患者中分离出的 18 株
HEV 中, 16株属于基因 IV 型; 广西地区戊肝患者
中分离的 18株 HEV 中, 17 株属于基因 IV 型。最
近,郑玲等[ 29]用 E 引物检测了福州市传染病医院自
2000年 1 月到 2003 年 12 月收集的 158 份 HEV-
IgM 阳性的临床肝炎血清,共检出 81份 PCR阳性,
阳性率 51. 27%,与本研究接近。这 81 株均属于基
因 IV型。但本研究从湖州地区献血员中分离出的
6株序列中, 仅 2株属于基因 IV 型, 而 4 株属于基
因 I型。这是由于湖州地区毒株基因型分布的特殊
性,还是有其它原因? 这一问题值得进一步深入研
究。
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Design and Preliminary Application of a Set of Highly Sensitive Universal RT-
PCR Primers for Detecting Genotype I/ IV Hepatitis E Virus
GE Sheng-x iang, GU O Qing-shun, LI Shao-w ei, ZHANG Jun, XIA Ning-shao
( Research Center f or Med ical Molecular Virology of Fuj ian Province , Xiamen Univ ersit y, X iamen 361005, China)
Abstract: Genomic sequences of genotypes I, II, I II and IV of hepat it is E virus w ere aligned and the conserved
region w as selected for designing a set of reverse- transcript ion polymerase chain react ion ( RT-PCR) primers,
w hich were denom inated as E primers. The sensit ivity of E primers and three sets of reported primers ( Meng,
ConORF1 and ConORF2) w ere compared by using HEV genotypes I and IV challenged monkeys� stools and sera
of hepatit is E patients. The detect ion limit of E primers for genotype I HEV in monkey stools w as 10 to 1000
times lower than that of reference primers, and the same or 10 t imes low er than that of reference primers for
g enotype IV HEV. When amplified by RT-PCR using E primers, five out of seventeen ( 29. 4% ) ant-i HEV
IgM posit ive pat ients� sera were posit ive, and just 1 or 2 samples w ere posit ive w hen RT-PCR were performed
using reference primers. T hus, the E primers w ould be a bet ter choice for detect ion of HEV RNA in samples
from China, where only g enotype IV and genotype I HEV were reported.
Key words: hepatit is E virus; Genotype I; Genotype IV; polymerase chain reaction; universal primer
Cor responding author : XI A N ing-shao, E-mai l : nsxia@ j ing xian , x mu . ed u . cn
�187�� 3 期 � � � � � � � � 葛胜祥等: 基因�、�型戊型肝炎病毒高灵敏度通用引物的设计和初步应用