食品微生物学实验技术

食品微生物学实验技术实验1食品中细菌菌落总数的测定1　目的要求（1）掌握食品中菌落总数测定。（2）了解食品清洁程度(被污染程度)及观察细菌在食品中繁殖的动态,从而为被检样品进行卫生学评价时提供依据。２基本原理菌落（coｌony）是指细菌在某一种固体培养基上克隆增殖发育成肉眼可见的细菌集团。菌落总数是指食品检样经过处理,在一定条件下培养后(如培养成分，培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1ｍL（g，cｍ２)检样中所含菌落总数。通常以cｆｕ/g(mL，cm2)表示,ｃｆu代表的coloｎyforningunit。菌落总数是作为判定食品的清洁程度(被污染程度)的标记,通常越干净的食品，单位样品菌落总数越低。反之，菌落总数就越高。菌落总数的测定是以每个活细菌能克隆增殖形成一个可见的单独菌落为基础的,但是在实践中除了单个细胞形成菌落外，二个或两个以上相连的同种细胞也同样可形成菌落，所以现在均以菌落总数(而不是活细菌数)或菌落形成单位数表达。由于菌落总数的测定是在37℃有氧条件下培养的结果,对于厌氧菌、微需氧菌、嗜冷菌和嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的细菌也受到限制。因此，这种方法所得到的结果，实际上只包括一群在普通营养琼脂中发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落的总数。但由于在自然界这类细菌占大多数,其数量的多少能反映出样品中细菌的总数,正因为如此，用该方法来测定食品中含有的细菌总数已得到了广泛的认可。３　实验材料３.1仪器　恒温箱、冰箱、恒温水浴锅、天平、微波炉、均质器。3．2　材料吸管（容量为0.１mL、１m和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、灭菌平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、灭菌镊子。3．3试剂营养琼脂培养基、7５%乙醇、０.85％生理盐水。４　实验方法与步骤4．1菌落总数实验程序（如图28-１)4．２检样稀释及培养（１）以无菌操作将检样25g(2５mL)剪碎放于装有225ｍL灭菌生理盐水和玻璃珠的三角瓶内，经过充分振荡或均质处理制作成1:１0的均匀稀释液（固体食品有的需先用灭菌研钵研磨后再稀释)。(2)用1mL灭菌吸管吸取1：1０稀释液1mL，沿管壁徐徐注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管混合均匀，作成1：100稀释液,按上述操作顺序，作10倍系列稀释液，每递增稀释一次，即换用1支1mL灭菌吸管。(3）根据食品卫生要求或对标本污染情况的估计，选择２~3个适宜稀释液,分别在作10倍递增稀释同时,吸取该稀释度的吸管移取1ｍL稀释液于灭菌平皿内,每个稀释度作两个平皿。（4)稀释液移入平皿后，应及时将融化并冷却到４６℃营养琼脂培养基注入平皿约１5ｍL,并转动平皿使其混合均匀,同时将营养琼脂培养基注入加有无菌生理盐水的灭菌平皿内作空白对照。(5）待琼脂凝固后,翻转平板,置３６＋１℃温箱内培养24＋２ｈr(肉、乳和蛋品为48+2ｈ,水产为30℃4８＋2ｈ)。4．３菌落计数将培养2４h后的平板取出,选取菌落数在30~3０0之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板,取两个平板的平均数,乘以稀释倍数，即得每克(或毫升）样品所含菌落总数。4.4平板菌落计数方法(1)平板菌落数的选择选取菌落数在３0～３00个之间的平板作为菌落总数测定的标准，且一个稀释度应使用两个平板的平均数。其中当一个平板有较大片状菌落生长时,若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘2以代表全皿菌落数。(2)　稀释度的选择A．应选择平均菌落数在30～30０之间的稀释度，乘以稀释倍数之。B．若有两个稀释度,其生长的菌落数均在30~３00个之间,则视二者之比如何来决定，若其比值小于2,应报告其平均数;若两者之比大于2，则报告其中较小的数字。C.若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。D.若所有稀释度的平均菌落数均小于30,则应按稀释度最底的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。E．若所有稀释度均无菌落生长,则以小于<1乘以最低稀释倍数报告之。F.若所有稀释度的平均菌落数均不在30~3０0之间,其中一部分大于３０0或小于3０时,则以最接近３0或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。（３)菌落数的报告菌落数在100以内时,按其实有数报告，大于10０时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值,以四舍五入方法计算,为了缩短数字后面的零数,也可用10的指数来表示。(见表28-1)表28－1稀释度选择及菌落数报告方式例次稀释液及菌落数两稀释液之比菌落总数(cfu/g，mＬ）报告方式(ｃｆu/g，mＬ）10-11０－２10-31多不可计１６0０0或1．6×10４2多不可计29５４6１.６37７5０３800０或３.８×１0４3多不可计2７１６02．２27１０0２7０00或2．7×1044多不可计多不可计3１3－3或3.1×1０55２７115-270270或2.7×102６000-<1×１０<107多不可计３０00或3.1×1０4５　实验结果(１）将实验得到的菌落总数结果记入下表10－210－３10－410－5备注12平均(2)报告所选两个稀释度之比及检测结果。６注意事项（1)若实验样品为食品，为防止食品碎屑混入琼脂影响计数，通常需在琼脂中添加一定量TTC（氯化三苯四氮唑),每１00ｍL加1ｍL０.5%TTC,培养后,如系食品颗粒,不见变化，如为细菌，则生成红色菌落。(2)理论上讲，为了得到实验食品中所有细菌菌落总数，应将样品接种到几种不同的培养基中并培养在不同的条件下,所得到的细菌菌落数总和。但根据国家颁发的不同食品的规定,都是根据用普通营养琼脂，37℃(水产品３0℃）进行需氧培养的结果来确定的，而且这种测定确具代表性,因而菌落总数在一般卫生学评价中并不要求用不同培养基进行选择性培养。(3)目前还有几种快速检测菌落总数的方法如由军事医学科学院研制而成食品细菌检验箱，菌落总数测定采用试管斜面计数法操作简便,不易受污染，结果与国标法平板计数一致。另一种是3Ｍ有限公司提供的PeｔrifilmＰlaｔｅｓ测试片(菌落总数测试片)。由于测试片中含有一种红色指示剂，使所有菌落易于识别计数，该片也可用于乳酸菌测定,4８hr可确定菌落总数。7思考(1）什么是菌落总数，何谓cfｕ?（2）若平板上菌落数生长一半较均匀，另一半呈片生长,如何计数菌落数?(3)影响杂菌总数准确性的因素有哪些？实验2食品中大肠菌群的测定1目的要求（１)学习与掌握食品中大肠菌群的测定方法。(2)了解大肠菌群在食品卫生学检验中的意义。2　基本原理大肠菌群系指一群在３7℃2４ｈr能发酵乳糖产酸产气,需氧或兼性厌氧的埃希氏无芽孢杆菌。它包括大肠埃希氏杆菌和柠檬酸杆菌、阴沟肠杆菌等类大肠杆菌。大肠菌群的检测就是根据大肠菌群的定义,即利用它们能发酵乳糖产酸产气的特性而的初发酵实验；初发酵阳性管通过伊红美兰平板进行分离;复发酵对分离菌作证实实验的三步法。根据证实为大肠菌群阳性管数，查MＰN检索表，报告每100mＬ（ｇ）大肠菌群的最可能数（食品中大肠菌群系以每100ｍL（g）检样内大肠菌群最可能数ＭPN表示),MPN最可能数是表示样品中活菌密度的估计。3实验材料3.1仪器温箱、冰箱、恒温水浴、天平、微波炉、均质器、普通光学显微镜。3．2材料吸管(0.1mＬ、1ｍL和10mL）、广口瓶或三角烧瓶、玻璃珠、平皿、试管、酒精灯、试管架、灭菌剪刀、镊子、小倒管等。3.3培养基　乳糖胆盐培养基,伊红美兰琼脂，乳糖发酵培养基，革兰氏染色液，0.8５％生理盐水。4实验方法与步骤4．1大肠菌群检验程序（如图29－１)4．2检样稀释取检样2５g（mL)剪碎,以225mL灭菌生理盐水稀释做成1:10稀释液，并依次做1０倍递增稀释液，例如10-1,10-２，10－3,１0-４等，估计样品污染程度,选择3个合适稀释液备用。4．3乳糖发酵试验将待稀释检样品接种乳糖胆盐发酵管内,接种量在1ｍL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管,1mL及1ｍL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管,每一稀释度接种3管，置36+1℃温箱内培养24+2h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，则按下列程序进行。4.4分离培养用接种环挑取产气的乳糖胆盐发酵管划线接种在伊红美兰琼脂平板上,36+1℃温箱内18~24h培养,观察菌落形态,并作革兰氏染色和证实试验。典型的大肠埃希氏菌落呈紫黑色金属光泽，非典型大肠菌群有时为红色菌落。4.5证实试验在上述平板上,挑取带有黑色金属光泽的可疑大肠菌群菌落１~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管3６＋1℃培养24+2h后观察产气情况。凡乳糖管产气,革兰氏染色阴性的无芽孢杆菌即可报告为大肠菌群阳性。5　实验结果（1)将大肠菌群检验结果填入下表接种量管号发酵反应结果有无典型菌落革兰氏染色结果复发酵反应结果最后结论+或-1mＬ1230.1mL12３0.01mＬ12３（2）根据证实为大肠菌群的阳性管数，查(ＭPN检索表后报告每100ｍL(ｇ)大肠菌群的最可能数。6　注意事项双料乳糖发酵管除蒸馏水外,其他成分加倍。30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。(1）初发酵实验与证实实验有时不一定符合。凡初发酵的产气管一定要做伊红美兰平板分离。如果平板出现典型的大肠菌菌落,G-染色阴性无芽孢菌，即可做出判定。如果平板上典型菌落少，应多挑取菌落包括挑菌落中心黑红、灰红,以及红、粉红等菌落,在革兰氏染色的同时，做证实试验，以免出现假阴性。(2）关于产气发酵管内的小倒管如储留气体则是阳性结果,如果不存留气体，但液面及管壁可以看到缓慢上浮的小气泡,或者对没有气体产生的发酵管用手轻轻弹动试管,有气泡出现而且沿管壁上升,都应考虑可能是由菌发酵产生气体的缘故。应做进一步观察，因为这种情况阳性检出率可达50%以上。(3）所谓典型大肠埃希氏菌是指具有该菌所有生物学特性的大肠菌。新近随粪便排出的大肠菌多属于这一类型。所以如查出多量典型大肠埃希氏菌表明样品是粪便的近期污染结果。研究表明，典型大肠菌随粪便排到外界环境中约一周后,典型菌可变为非典型菌。这种变化以生化变异为主。如果样品检测以非典型大肠菌为主,则指示样品受粪便的远期污染。大肠埃希氏菌大量存在于人畜肠道，并随粪便排出。本菌在粪便中数量多,易于培养，对外界的抵抗力与肠道致病菌比较相近，所以选择大肠埃希氏菌作为被粪便污染的指示菌,合理、科学。凡被粪便污染的样品，就有可能受到致病菌污染。所以大肠菌群的测定是必做的食品卫生学检项目。(4）大肠菌群检验方法（国标）采用的管发酵通常需三天，目前已开发出几种快速检验方法（TTＣ显色法,ＤC试管法,纸片法)。如由军事医学科学研究院研制而成的一小时快速检测法,检验结果与国标法一致。3M中国有限公司提供的pｅｔｒifiｌmplａteｓ测试片，可在２4小时确定大肠菌群数。7思考题（1）什么是大肠菌群？大肠菌群表示的单位及其意义。（2)固体检样三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN怎样表示?(３)液体检样三个稀释度检测结果都是阴性时，MPN怎样表示？(4)大肠菌群检验中为什么首先要用乳糖胆盐发酵管发酵?实验3食品中金黄色葡萄球菌的检测１目的要求（1）了解食品和食物中毒样品中金黄色葡萄球菌的检测方法。(2）观察金黄色葡萄球菌的革兰氏染色镜检形态以及在血平板和Bairｄ-Pａrkeｒ氏琼脂平板上生长的菌落特征。（３）观察金黄色葡萄球菌产生血浆凝固酶现象。２　基本原理金黄色葡萄球菌可产生多种毒素和酶。在血平板上生长时,因产生金黄色色素使菌落呈金黄色;由于产生溶血素使菌落周围形成大而透明的溶血圈。在Ｂａirｄ-Ｐａｒker氏平板上生长时,因将亚碲酸钾还原成碲酸钾使菌落呈灰黑色；因产生脂酶使菌落周围有一浑浊带，而在其外层因产生蛋白水解酶有一透明带。在肉汤中生长时，菌体可生成血浆凝固酶并释放于培养基中（叫做游离凝固酶）。此酶类似凝血酶原物质,不直接作用到血浆纤维蛋白原上，而是被血浆中的致活剂(即凝固酶致活因子)激活后，变成耐热的凝血酶样物质,此物质可使血浆中的液态纤维蛋白原变成固态纤维蛋白，血浆因而成凝固状态。3实验材料３.1仪器和材料　显微镜、温箱、离心机、灭菌吸管(１mL，10mL）、灭菌试管、灭菌平皿、均质器、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环。3．2培养基及试剂　胰酪胨大豆肉汤、７．5%氯化钠肉汤、豆粉琼脂、血琼脂平板、Baiｒd－Paｒkｅr琼脂平板、肉浸液肉汤、兔血浆、革兰氏染色液等。4实验方法与步骤4.1　金黄色葡萄球菌检测程序(如图３０-1)ﻫ　4．2增菌培养法（1）检样处理称取2５g固体样品或吸取２５mL液体样品，加入225mL灭菌生理盐水，固体样品研磨或置均质器中制成混悬液。（2)增菌及分离培养吸取5mL上述混悬液，接种于50mＬ7．5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤培养基内,置３6±1℃温箱培养24h,转种于血平板和Baird－Ｐａrker平板上,３６±１℃培养24h，挑取可疑金黄色葡萄球菌菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。（3)形态金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄球状，无芽孢,无荚膜,致病性葡萄球菌菌体较小,直径约为0.５~1μｍ。（4）培养特征在肉汤中呈混浊生长,在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长,血平板上菌落呈金黄色,也有时为白色,大而突起、圆形、不透明、表面光滑,周围有溶血圈。在Bairｄ－Paｒker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径为2～3mm,颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色,周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度,偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落,但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些,外观可能粗糙并干燥。（５)血浆凝固酶试验吸取1∶4新鲜兔血浆０.5ｍL，放入小试管中,再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养物０.５ｍL,振荡摇匀,放36±1℃温箱或水浴内，每半小时观察一次,观察６h,如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时呈现凝块者,被认为阳性结果。同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。4．３　直接计数法（１)吸取上述1：１0混悬液，进行10倍系列稀释，根据样品污染情况，选择不同浓度的稀释液1mL，分别加入到三块Ｂaird-Pａｒkeｒ平板中,每个平板接种量分别为0．３ｍL、0.3mL、0.４mL,然后用灭菌L棒涂布整个平板。如水分不多吸收,可将平板放在36±１℃温箱1h，等水分蒸发后反转平皿置3６±1℃温箱培养。(2)在三个平板上点数周围有混浊带的黑色菌落，并从中任选5个菌落，分别接种血平板,3６±１℃24h培养后进行染色镜检、血浆凝固酶试验，步骤同增菌培养法。(３)将三个平板中疑似金黄色葡萄球菌的黑色菌落数相加，乘以血浆凝固酶阳性数,除以５,再乘以稀释倍数,即可求出每克样品中金黄色葡萄球菌数。5　实验结果（1)金黄色葡萄球菌涂片染色镜检为阳性球菌，致病性葡萄球菌一般较非致病性葡萄球菌小，且各个菌体的大小排列也较整齐。细菌繁殖时呈多个平面的不规则分裂,堆积成葡萄串状。在中毒食品、脓汁或液体培养基中常呈单个或环球短链排列，易误认为链球菌或细球菌。(2）金黄色葡萄球菌在血平板上菌落呈金黄色，周围有溶血圈，在Ｂaiｒｄ-Ｐarkeｒ平板上菌落呈灰黑色，周围为一浑浊带，在其外层有一透明圈。（３）致病性葡萄球菌血浆凝固酶为阳性。6注意事项（1)在做样品中金黄色葡萄球菌计数进行10倍递次稀释时,要注意每个稀释度更换吸管。（2）实验中操作者须注意生物安全防护，实验结束后要消毒环境,把实验材料高压灭菌后方可清洗或弃之。７　思考题（1）金黄色葡萄球菌引起食物中毒的机理是什么？(2)为什么采用血浆凝固酶试验来决定葡萄球菌致病和不致病?实验4食品中溶血性链球菌的检测1目的要求（1）了解食品和食物中毒样品中溶血性链球菌的检测方法。(2)观察溶血性链球菌的革兰氏染色镜检形态以及在血平板上菌落特征及溶血情况。(3）观察乙型溶血性链球菌产生链激酶的现象以及杆菌肽敏感实验结果。2　基本原理乙型(β）溶血性链球菌致病性强，能产生溶血毒素,在血平板上生长，可使菌落周围形成一个有2～4mm宽，界限分明，完全透明的无色溶血环,称乙型溶血；还能产生链激酶（又称溶纤维蛋白酶)，激活血浆中的血浆蛋白酶原,使之变成活动性的血浆蛋白酶,故可溶解血块或阻止血浆凝固;还可以产生胞外cAMＰ因子，它可以增强葡萄球菌的溶血能力，即增强对羊、牛血红细胞的溶解能力。因此,在羊血琼脂平板上接种链球菌处,可以见到蘑菇状或箭头样的溶血区。3实验材料3．1设备和材料温箱、水浴、显微镜、离心机、试管架、灭菌平皿、灭菌小试管、载玻片、灭菌吸管(1mL、10mL)灭菌镊子、均质器、酒精灯、接种环。3．2培养基和试剂葡萄糖肉浸液肉汤、牛心浸液、匹克氏肉汤、血琼脂平板、人血浆、0.２5％氯化钙、灭菌生理盐水、杆菌肽药敏纸片(含0．04单位)。4实验方法与步骤:4.1溶血性链球菌检验程序（如图31-1）4.2样品处理称取25ｇ固体检样或称取25ｍL液体检样，加入２25mL灭菌生理盐水制成混悬液。4．3一般培养将上述混悬液吸取5mL，接种于50mＬ葡萄糖肉浸液肉汤或直接划线接种于血平板,如检样污染严重,可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36±1℃培养２4ｈ后接种血平板,置３６±１℃培养２４h，挑取乙型溶血圆形突起的细小菌落在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肽敏感试验。4．4形态与染色本菌呈球形或卵圆形，直径0.５~1μm,链状排列,链长短不一，短者４~８个细胞组成,长者20～30个，链的长短常与细菌的种类及生长环境有关；液体培养中易呈长链；在固体培养基中常呈短链,不形成芽孢，无鞭毛，不能运动。４．5培养特性该菌营养要求较高,在普通培养基上生长不良，在加有血液、血清培养基中生长较好。溶血性链球菌在血清肉汤中生长时，管底呈絮状或颗粒状沉淀。血平板上菌落为灰白色,半透明或不透明，表面光滑有乳光，直径约0.5~0.75m，为圆形突起的细小菌落,乙型溶血链球菌周围有２～４mm界限分明、无色透明的溶血圈。４.６　链激酶试验致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶），此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原成为血浆蛋白酶,而后溶解纤维蛋白。吸取草酸钾血浆0.2mL,加０．8ｍL灭菌生理盐水混匀，再加入１8~24h36±1℃培养的链球菌培养物０．５mL及0.25%氯化钙0．25mL（如氯化钙已潮解，可适当加大至０．3%~0.35％),振荡摇匀,置于３６±1℃水浴中10min，血浆混合物自行凝固(凝固程度至试管倒置,内容物不流动)。然后观察凝固块重新完全溶解的时间,完全溶解为阳性。若24h后不溶解即为阴性。草酸钾人血浆配制:草酸钾0．01g放入灭菌小试管中,再加入5mL人血混匀，经离心沉淀吸取上清液即为草酸钾人血浆。4.7杆菌肽敏感试验挑取乙型溶血性链球菌液涂布于血平板上,用灭菌镊子夹取每片含有0.0４单位的杆菌肽纸片放于上述平板上,置于３6±1℃下培养１8~２4h,如有抑菌带出现即为阳性。同时用已知阳性菌株作为对照。5　实验结果(1)溶血性链球菌涂片染色镜检为革兰氏阳性，呈球形或卵原形直径为０.5~1微米，链状排列，链的长短不一,短者由4~８个菌体组成，长者达2０～30个菌。液体培养基中易呈长链,固体培养基中常呈短链。(2）溶血性链球菌在血平板上形成的菌落为灰白色,半透明，表面光滑有乳光，直径约为0.５~0.7５mm的圆形突起的细小菌落。乙型溶血性链球菌菌落周围呈完全溶血,并有明显的溶血境界。在显微镜低倍镜下观察，菌落周围一般不能见到红血球。乙类溶血性链球菌在血平板上对杆菌胎敏感,经37℃培养18小时,出现明显抑菌圈。6注意事项（１）做链激酶实验时注意人血浆应新鲜。(2）实验中操作者须注意生物安全防护,实验结束后要消毒环境,把实验材料高压灭菌后方可清洗或弃之。７　思考题(１)溶血性链球菌在血平板上生长时的菌落特征？(2)溶血性链球菌的致病力强弱与那些生物特性有关?实验5食品中沙门氏菌属的检验1目的要求（１)学习食品中沙门氏菌属的检验方法和基本原理。（２)熟悉沙门氏菌属因子血清的使用方法。(３)了解沙门氏菌属的生化反应及基本原理。2　基本原理沙门氏菌属是肠道杆菌科中最重要的病原菌属，它是引起人类和动物发病及食物中毒的主要病原菌之一。食品中沙门氏菌的含量较少,且常由于食品加工过程使其受到损伤而处于濒死的状态。为了分离与检测食品中的沙门氏菌,对某些加工食品必须经过前增菌处理，用无选择性的培养基使处于频死状态的沙门氏菌恢复其活力,再进行选择性增菌,使沙门氏菌得以增殖而大多数的其它细菌受到抑制，然后再进行分离鉴定。沙门氏菌属是一群血清学上相关的需氧,无芽孢的革兰氏阴性杆菌,周身鞭毛,能运动，不发酵侧金盏花醇、乳糖及蔗糖,不液化明胶，不产生靛基质，不分解尿素，能有规律地发酵葡萄糖并产生气体。沙门氏菌属细菌由于不发酵乳糖，能在各种选择性培养基上生成特殊形态的菌落。大肠杆菌由于发酵乳糖产酸而出现与沙门氏菌形态特征不同的菌落，如在ＳＳ琼脂平板上使中性红指示剂变红，菌落呈红色,借此可把沙门氏菌同大肠杆菌相区别。根据沙门氏菌属的生化特征,借助于三糖铁、靛基质,尿素、KCN,赖氨酸等试验可与肠道其它菌属相鉴别。本菌属的所有菌种均有特殊的抗原结构，借此也可以把它们分辨出来。３　实验材料3.１设备和材料　　天平、均质器或研钵、培养箱、显微镜、灭菌广口瓶、灭菌三角烧瓶、灭菌吸管(l0ｍＬ）、灭菌平皿、灭菌小玻管、灭菌毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、酒精灯、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架等。3.2培养基和试剂　缓冲蛋白胨水（BP),氯化镁孔雀绿(MＭ)增菌液,四硫磺酸钠煌绿（ＴTB)增菌液,亚硒酸盐胱氨酸(ＳＣ)增菌液，亚硫酸铋琼脂(BS),DHL琼脂,HE琼脂,SS琼脂,三铁糖琼脂(ＴSI)，蛋白胨水，靛基质试剂,ｐＨ７.2尿素琼脂，KCN培养基,氨基酸脱羧酶试验培养基,糖发酵管，OＮPG培养基，半固体琼脂，缓冲葡萄糖蛋白胨水(附ＭR、V·P试剂），丙二酸钠培养基，氧化酶试剂,革兰氏染色液,2６种（初步分型)、57种(一般分型)、144种（详细分型)沙门氏菌因子血清。4实验方法与步骤４．1沙门氏菌属检验程序（如图32－1）4.2前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其它加工食品均应经过前增菌。各称取样品25g，加在装有22５mL缓冲蛋白胨水的5０0mL广口瓶内,固体食品可用均质器，8000～１00００rpm／min打碎lmin,或用研钵加灭菌砂磨碎,粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化。于３6±1℃培养4h(干蛋品需培养18～24h)，移取10mL转种于1０0ｍＬ氯化镁孔雀绿增菌液或硫磺酸钠煌绿增菌液内，于4２℃培养18~2４h。同时另取10ｍL，加入于1０0mＬ亚硒酸盐胱氨酸增菌液内,于36±ｌ℃培养1８～２4h。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其它未经加工的食品不必经过前增菌。各取25mL加入灭菌生理盐水225mL,按前法做成检样匀液，取其半量接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫磺酸钠煌绿增菌液内于42℃培养２４ｈ，另半量接种于１０0mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液内,于36±l℃，培养18~２4h。４．3分离取增菌液一环,划线接种于BS平板一个和ＤＨL琼脂平板（或HE琼脂平板、或SS琼脂平板)一个。于36±１℃分别培养18~２４h(DHL、HE,SS)或４0～4８h(BS)。观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌亚属I、Ⅱ，Ⅳ、Ｖ和亚属Ⅲ在各个平板上的菌落特征见表32—1。表32-１　沙门氏菌属各亚属在各种选择性琼脂平板上的菌落特征选择性琼脂平板亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ亚属Ⅲ（即亚利桑那菌)亚硫酸琼脂产Ｈ2S菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色、菌落周围培养基可呈黑色或棕色；有些菌株不产生H２Ｓ，形成灰绿色的菌落，周围培养基不变色。黑色有金属光泽。DHＬ琼脂无色半透明，产生Ｈ2S菌落中心带黑色或几乎全黑色。乳糖迟缓阳性或阴性的菌株,与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ相同,乳糖阳性的菌株为粉红色,中心带黑色。ＨＥ琼脂蓝绿色或蓝色，多数菌株产Ｈ2S,菌落中心黑色或几乎全黑色。乳糖阳性的菌株为黄色，中心黑色或几乎全黑色;乳糖迟缓阳性或阴性的菌株为蓝绿色或蓝色,中心黑色或几乎全黑色。SS琼脂无色透明，产生H2S菌株，有的菌落中心带黑色，但不如以上培养基明显。乳糖迟缓阳性或阴性的菌株，与亚属Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ相同;乳糖阳性的菌株为粉红色，中心黑色,但中心无黑色形成时与大肠埃希氏菌不能区别。4．4三糖铁高层琼脂初步鉴别挑选上述选择性琼脂平板上的可疑菌落,接种到三糖铁琼脂斜面试管中，于３６±1℃分别培养18~2４h,然后根据表3２-2初步判断是否为可疑沙门氏菌。表32-2肠杆菌科各菌属在三糖铁琼脂内的反应结果斜面底层产气Ｈ2S可能的菌属-＋+/－＋沙门氏菌属、变形杆菌属、枸橼酸杆菌属、爱德华氏菌属＋＋+/-＋沙门氏菌属亚属Ⅲ、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属-＋+-沙门氏菌属、埃希氏菌属、哈夫尼亚菌属、摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属-＋-－伤寒沙门氏菌、鸡沙门氏菌、志贺氏菌属、埃希氏菌属、哈夫尼亚菌属、摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属++＋/-－埃希氏菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、枸橼酸杆菌属该表说明在三糖铁琼脂内只有斜面产酸并同时H2S阴性的菌株可以排除,其它的反应结果均有沙门氏菌的可能，同时也均有不是沙门氏菌的可能。因此需要做几项最低限度的实验。４．5生化试验在接种三糖铁的同时，再接种蛋白胨水(供作靛基质试验)、尿素（pH７.2）琼脂、KCN培养基和赖氨酸脱羧酶试验培养基及对照培养基各一管,于36±ｌ℃培养18-24h，必要时可延长至4８小时，按表３2-3判断结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于A1、Ａ２和B1,其它五种结果均可排除。表32-3　肠杆菌科各属生化反应初步鉴别表反应序号H2S靛基质pH7.2尿素ＫCN赖氨酸脱羧酶判定菌属Ａ1＋-－－+沙门氏菌属A2++--+沙门氏菌属（少见)、爱德华氏菌属A３+-＋＋－枸橼酸杆菌属、奇异变形杆菌A4＋＋++－普通变形杆菌B1－－------＋－沙门氏菌属、埃希氏菌属甲型副伤寒沙门氏菌、埃希氏菌属、志贺氏菌属B２－－＋＋----＋-埃希氏菌属埃希氏菌属、志贺氏菌属B3－-－-＋/-+＋++－克雷伯氏菌族各属阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌属B４－++/－＋－摩根氏菌属、普罗菲登斯菌属注：（1)三糖铁琼脂底层均应产酸，不产酸者可排除。斜面产酸与产气与否均不限。(2）ＫCＮ和赖氨酸可选用其中一项,但不能判定结果,仍需补做另一项。（3）+阳性、-阴性、＋/-多数阳性、少数阴性。(1)反应序号A1典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KＣN和赖氨酸三项中有一项异常、按表3２—3附1仍可判定为沙门氏菌。如有两项异常,则按A３，判定为枸橼酸杆菌。表３２-3-A　附1pH7.2尿素KCN赖氨酸判　　定　结果-－-甲型副伤寒沙门氏菌(要求血清学鉴定结果)－＋＋沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ（要求符合本群生化特性）＋－＋沙门氏菌个别变种(要求血清学鉴定结果)（2）反应序号Ａ2可先做血清学鉴定，当A—F多价血清不凝集时，补作甘露醇和山梨醇，按表３２—3附2判定结果。表32－3附2甘露醇山梨醇判定结　果++沙门氏菌属靛基质阳性变种（要求血清学鉴定结果)-－缓慢爱德华氏菌(3)反应序号B1三糖铁斜面产酸的菌株可首先排除,不产酸者可先做血清学鉴定,当A—F多价血清不凝集时,补做鸟氨酸、OＮPＧ、水杨苷、棉子糖和半固体动力试验,按实验表32—3附３判定结果。必要时按表３2—4,进行沙门氏菌属亚属Ⅲ或其它亚属的鉴定．表32-3附3赖氨酸乌氨酸ONPG水杨苷棉子糖动力判定结果+＋－-－+沙门氏菌属----－-志贺氏菌属－++－--宋内氏志贺氏菌属dd+ddd埃希氏菌属注：判定结果时应注意伤寒沙门氏菌鸟氨酸阴性,甲型副伤寒沙门氏菌赖氯酸阴性，鸡沙门氏菌无动力。表中d表示有不同反应结果。如果未做KCN试验时，常需做V－P试验(22~250C,４天）,哈夫尼亚菌属为阳性。表32－4沙门氏菌属亚属的鉴定项目亚　属ⅠⅡⅢⅣⅤ乳糖－-+/（+）--ONPG－－＋-＋卫矛醇++－-＋丙二酸钠-+＋--KＣN-－-++水杨苷---＋-(+)迟缓阳性4．６血清学分型鉴定(1）抗原的准备一般采用１.5%琼脂斜面培养物作玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(如２.5~3%)培养基上再检查,如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于ｌmL生理盐水中作成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7~０．8％半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长后,在其边缘部分取菌检查，或将菌株通过装有0.3～0．４％半固体琼脂的小玻管1~2次，自远端取菌培养后再检查。（2）抗原的鉴定用A—F多价O血清作玻片凝集试验,同时用生理盐水作对照。在生理盐水中自凝者为粗糙型菌株,不能分型。被A—F多价O血清凝集者,依次用O4、O３、O１0、Ｏ7、O8、O9、O2、和O1１因子血清作凝集试验，根据试验结果判定O群。被O3、Ｏ１0血清凝集的菌株，再用O10、O1５、O34、Ｏ19单因子血清作凝集试验,判定E1、E２、E3、Ｅ4各亚群，每一个O抗原成份的最后确定均应根据Ｏ单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。　不被A—F多价O血清凝集者，先用5７种或144种沙门氏菌因子血清中的7种多价O血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的Ｏ因子如下:ＯＡ　　l，２,３，4,５,9，10，12,１9,2l，26，46ＯB　6，7，８,1１，１３,１4，２０，2２，２3,２4ＯC1６，17，18,２8,30,3５,38OD39，4０,41,4２,43，4４，45OE　47,４8,５０，５1,5２OF53,54，5５,５6，５7，58,5９ＯG6０,61，６2，６3,65,66，6７（3）H抗原的鉴定属于A—F各O群的常见菌型,依次用下述(表3２一5）H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。不常见的菌型，先用1４4种沙门氏菌因子血清中的６种多价H血清检查,如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查以确定第1相或第2相的H抗原。每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果,没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第2相Ｈ抗原的,可在琼脂斜面上移种1~2代后再检查。如仍只检出一个相应的抗原,要用位相变异的方法检验其另一个相。单菌相不必作位相变异检查。表32-5A—F群见菌型H抗原表Ｏ群第1相第２相Aa无Βg，f,,s无Βi,b，d2C1k,ｖ,r,c５　Z15Ｃ2b,　d，ｒ２,5Ｄ(不产气的)ｄ无D(不气的)ｇｍp　q无E1ｈv6,ｗ,xＥ２ｈ6wE4gsｔ无E4ｉZ6Ｆi2HAa，b，c，ｄ，ｉ，Ｚ１0，Z29HBｅ,h;e,n，x;f，g；g，m,s;ｇ,p；m,ｔＨCk,l，ｖ;ｒ,y,Z，Z4，Z23ＨD　１，2;l，5;１,6;1,7；Z６HEＺ３５，Z36,Ｚ38,Ｚ39，Z41，Z４２，Ｚ４4ＨFZ5２,Ｚ5３,Ｚ54,Ｚ５5，Z５6,Z57(4)V１抗原的鉴定用V１因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌。５实验结果综合以上生化实验和血清学分型鉴定的结果,按照考夫曼——怀特沙门氏菌属抗原表解和补充表解判定菌型,并报告实验结果。6思考题（1)如何提高沙门氏菌的检出率?(２）沙门氏菌在三糖铁培养基上的反应结果如何？（3）沙门氏菌属检测主要包括哪几个主要步骤？实验6　食品中志贺氏菌属的检验1目的要求（1）了解志贺氏菌的形态、培养以及生化反应等特性。（２)学习志贺氏属菌检验的基本原理和方法。2基本原理志贺氏菌属为埃希氏杆菌，包括痢疾志贺氏菌、福氏志贺氏菌、鲍氏志贺氏菌和宋内氏志贺氏菌四群，是引起人类细菌性痢疾的病原菌。它们主要通过食品加工、集体食堂和饮食行业的从业人员中痢疾患者或带菌者污染食物，从而导致痢疾的发生，是一种较常见的、危害较大的致病菌。志贺氏菌的鉴定主要根据血清学反应，再以生化反应证实。3实验材料３.1样品：肉与肉制品、蛋与蛋制品、乳与乳制品等。3.２　设备和材料天平、均质器或研钵、培养箱、显微镜、灭菌广口瓶、灭菌平皿、酒精灯、载玻片、灭菌金属匙或玻璃棒、接种棒、试管架。3．3　培养基和试剂GＮ增菌液、HE琼脂、SＳ琼脂、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂、三糖铁琼脂、半固体琼脂、赖氨酸脱羧酶试验培养基、苯丙氨酸琼脂、西蒙氏柠檬酸盐琼脂、葡萄糖铵琼脂、糖发酵管、蛋白胨水、靛基质试剂、缓冲葡萄糖蛋白胨水、V-Ｐ试剂、甲基红试剂、氧化酶试剂、革兰氏染液、志贺氏菌属诊断血清等。４实验方法与步骤4．１　志贺氏菌检验程序（如图３3－1）４.2增菌称取检样25g加入装有2２５mＬGN增菌液的500mI广口瓶内（固体食品应用均质器以8，000～10,000r/mi打碎1min，或用研钵研碎)，于培养3６±1℃培养6～8h。４.３分离取一环增菌液,划线接种于HE琼脂平板或SS平板一个,麦康凯琼脂平板或伊红美兰琼脂平板一个，于36±1℃培养18～２4ｈ．。志贺氏菌在这些培养基上呈现无色透明的中等大小的光滑型菌落。4．4生化试验（１）志贺氏菌属生化特性试验挑取平板上的可疑菌落，接种三糖铁琼脂和半固体琼脂各一管。志贺氏菌在三糖铁琼脂内的反应结果为底层产酸而不产气(福氏志贺氏菌6型可微产气)，斜面产碱,不产生硫化氢，无动力，在半固体管内沿穿剌线生长。然后再做V-Ｐ\苯丙氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶、西蒙氏柠檬酸盐和葡萄糖铵试验,结果均应阴性反应。(2）志贺氏菌属分群生化试验要将志贺氏菌属分群，应做5％乳糖、甘露醇、棉子糖和甘油的分解试验，靛基质试验。结果见表３3-1。要将志贺氏菌属分型，还需进行血清学试验,具体为：挑取三糖铁琼脂上的培养物,作玻片凝集试验。先用四种志贺氏菌多价血清检查,若因Ｋ抗原的存在而凝集被阻,应煮沸菌液破坏K抗原后再检查。若呈现凝集，则用A1、A2群多价和D群血清分别试验。如系B群福氏志贺氏菌,则用群和型因子血清分别试验，确定菌型。福氏志贺氏菌各型和亚型的型和群抗原的血清学鉴定见表33-2、3３－３。表33-１志贺氏菌属四个群的生化特性生化群5%乳糖甘露醇棉子糖甘油靛基质Ａ群:痢疾志贺氏菌--－（＋）-/+B群：福氏志贺氏菌-＋+--/+C群：鲍氏志贺氏菌-＋-＋－/+D群:宋内志贺氏菌+/（＋）++d-注:＋阳性，－/+多数阴性,少数阳性,(+）迟缓阳性，d不同生化型。福氏志贺氏6型生化特性与A或C群相似。表3３-2福氏志贺氏菌各型和亚型的型抗原和群抗原型和亚型型抗原群抗原1aⅠ1、２、4、5、9……１ｂⅠ1、2、4、5、6、9……2aⅡ1、3、4……2ｂⅡ１、7、8、9……3ａⅢ1、6、7、8、９……3bⅢ1、4、6、（7、8、9)……３cⅢ1、6……4aⅣ1、（3)…4bⅣ1、6……５ａⅤ1、4……５bⅤ1、5、7、9……６Ⅵ1、２、（4）……ｘ-１、7、8、9……y-1、3、4……注：……均为省略号表33－３福氏志贺氏菌的血清学鉴定群3.４群6群７.8可能的型和亚型+--2ａ、１a、6、４a、y变种+＋-1b、３ｂ、4ｂ-++3ａ--+２b、5、x变种---4、66实验结果综合以上生化和血清学的试验结果,判定菌型并作出报告。(1)根据培养和生化试验,有否检出志贺氏菌？（２）根据生化特性和血清学试验，检出的志贺氏菌属哪个群?哪个型?7　思考题(1)志贺氏菌属有哪些重要的生化特性？（2）你认为在志贺氏菌属检验过程中,哪些试验是不可缺少的?实验7食品中蜡样芽孢杆菌的检验1目的要求（1）学习蜡样芽孢杆菌检验的原理和方法。（2)了解腊样芽孢杆菌食物中毒情况。2基本原理蜡样芽孢杆菌为需氧、能产生芽孢的革兰氏阳性杆菌,在自然界分布较广,食品在正常情况下就可能有此菌存在，因而易从各种食品中检出。当人体摄入的蜡样芽孢杆菌数目达到一定数量后就会引起食物中毒。蜡样芽孢杆菌食物中毒中涉及的食品种类较多,包括乳类食品、肉类食品、蔬菜、汤汁、豆芽、甜点心和米饭等，引起的食物中毒表现为呕吐型和腹泻型。3实验材料３.１　仪器与设备培养箱、冰箱、显微镜、恒温水浴、天平、电炉、吸管（0.1ｍL、1.０mＬ和10m1)、广口瓶或三角烧瓶、玻璃珠、培养皿、试管、载玻片、酒精灯、均质器或乳钵、试管架、接种棒、L形涂布棒、灭菌刀、剪、灭菌镊子、酒精棉球、记号笔等。3.2培养基和试剂甘露醇卵黄多粘菌素琼脂培养基、肉浸液肉汤培养基、营养琼脂培养基、酪蛋白琼脂培养基、动力－硝酸盐培养基、木糖－明胶培养基、缓冲葡萄糖蛋白胨水、血琼脂培养基、3%过氧化氢溶液、70%酒精、革兰氏染色液、甲醇、0.5%碱性复红染色液、甲萘胺－醋酸溶液、对氨基苯磺－醋酸溶液等。4实验方法与步骤4．1蜡样芽孢杆菌检验程序（如图34-1)４.２菌数测定以无菌操作将检样２5g或２5mL按菌落总数测定方式，用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成１0-1～10-5的稀释液。取各稀释液0．1mL，接种在选择培养基（甘露醇卵黄多粘菌素琼指)平板上，用L形棒涂布于整个表面，置37℃培养12~20ｈ后,选取菌落数在３0个左右者进行计数。蜡样芽孢杆菌在此培养基上生成的菌落为灰白色或微带红色，具紫红色背景(表示不发酵甘露醇)环绕有白色至淡粉红色的晕(表示产生卵磷脂酶)。计数后，从中挑取5个这样的菌落作证实试验。根据试验证实为蜡样芽孢杆菌的菌落数,计算出该培养皿内的蜡样芽孢杆菌数，然后乘其稀释倍数即得每克或每毫升样品所含的蜡样芽孢杆菌数。4．3分离培养将检样或其稀释液划线于上述选择性培养基平板上,置37０C培养12～２0h，挑取可疑蜡样芽孢杆菌的菌落接种于肉汤和营养琼脂培养基上做纯培养，然后做证实试验。4．4证实试验（1)形态观察：应为G＋杆菌，宽度在1μm或1μm以上,芽孢呈卵圆形,不突出菌体,多位于菌体中央或稍偏于一端。(2）培养特性:肉汤中生长混浊，常有菌膜或壁环,振摇易乳化。琼脂平板上形成的菌落不透明，表面粗糙,似毛玻璃状或融蜡状且边缘不齐。(３）生化特性:本菌有动力,产生卵磷脂酶和酪蛋白酶,过氧化氢酶试验阳性，溶血，不发酵甘露醇和木糖，能液化明胶和还原硝酸盐,在厌氧条件下能发酵葡萄糖。（４)与类似菌鉴别。本菌与其他类似菌的鉴别见表34-１。表３4-1蜡样芽孢杆菌与其他类似的鉴别特　　性巨大芽孢杆菌蜡样芽孢杆菌苏云金芽孢杆菌蕈状芽孢杆菌炭疽芽孢杆菌过氧化氢酶+＋++＋动力+/－+/-+／－－－硝酸盐还原－++++酪蛋白分解+/－+＋/－＋/－-/＋卵黄反应-++++葡萄糖利用(厌氧)-＋++＋甘露醇+--－-木糖+/-－---溶　血－＋+-/＋－/＋已知致病特性产生肠毒素对昆虫致病的内毒素结晶假根样生长对动物和人致病注：“＋”90～１00%的菌株阳性。“－”９0～1０0％菌株阴性，“＋/－”大多菌株阳性,“－／+”大多菌株阴性。本菌在生化性状上与苏云金芽孢杆菌极为相似，但后者可通过细胞内产生蛋白质毒素结晶加以鉴别。其检查方法为：取营养琼脂上纯培养物少许制片,加甲醇于玻片上，0.5miｎ后倾去甲醇,置火焰上干燥，然后滴加0.5%复红液于玻片上,并用酒精灯加热至微见蒸汽后维持1.５min（注意勿使染液沸腾）,移去酒精灯,将玻片放置０.5min后倾去染液,而后置洁净自来水下彻底清洗、晾干、镜检。如有游离芽孢和深染了的，似菱形的红色结晶小体即为苏云金芽孢杆菌（如游离芽孢未形成,培养物应放置室温再保持１～２d后查检），而蜡样芽孢杆菌用此法检查为阴性。６　实验结果根据以上实验作出检验报告。７　思考题如何区分蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌?实验８食品中副溶血性弧菌的检验1目的要求（1）了解副溶血性弧菌的生长特性。(2)熟悉食品中副溶血性弧菌的检验原理。2基本原理副溶血性弧菌(Viｂrｉoparahaeｍolyticuｓ)是近海岸、河口处的栖息生物,常存在于海水、海底沉积物、海产品（鱼类、介壳类）及海渍食品中。人们由于食入污染本菌而未充分加热的海产品或食物可引起食物中毒或胃肠炎。副溶血性弧菌是一种嗜盐性弧菌，在不含NaＣl培养基中不生长，在ＴＣBＳ平板上,菌落0.5～2.0mm大小,因不发酵蔗糖而呈绿色或蓝绿色。3实验材料３.1　菌种副溶血性弧菌（Vibriｏparahａｅmoｌyｔicuｓ）、大肠埃希氏菌（Ｅ.coli）。3.2检样鱼类、贝类。3.3　培养基及试剂氯化钠结晶紫增菌液、TCBS培养基、3.５％氯化钠三糖铁琼脂、生化试剂等。4实验方法与步骤4．1副溶血性弧菌的检测程序（表35－1)４.2样品处理准备好灭菌用具及容器,以无菌操作取有代表性的样品2５g,加入到含有225mL的３.5%灭菌盐水中，用均质器打碎或用力摇匀1０~20mｉn。4．3增菌培养取10mL加入１0０mL氯化钠结晶紫增菌液中，摇匀,放37℃培养８~16h。4．4分离培养取增菌液1环划线接种于TCBS平板，于37℃培养１8~24h后，观察平板上生长的菌落,0.５~２.0mm大小、绿色或蓝绿色的为可疑菌落。4．５初步鉴别用接种针挑取可疑菌落,转种３.５%氯化钠三糖铁斜面，37℃培养2４h观察结果。4．6涂片镜检将三糖铁培养基上反应可疑者即底层变黄(葡萄糖产酸不产气）、上层斜面不变（乳糖、蔗糖不分解）、有动力、不产生硫化氢,进行革兰氏染色镜检形态。4.7嗜盐性试验将上述可疑培养物分别接种不同含量的盐胨水（0％，7%,1１%）于３7℃2４h培养后观察生长情况,在0％和11%盐的胨水中不生长，在7%盐的胨水中生长良好者,继续进行下列有关试验。4．8生化试验分别接种下列各类微量生化培养基:葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、甲基红、靛基质、Ｖ-P,赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸、硫化氢及溶血性试验,放3７℃培养,除V－P、靛基质和甲基红试验培养4８h后加试剂观察外，其他均在24h观察结果。副溶血性弧菌对葡萄糖产酸不产气，不分解乳糖和蔗糖，能分解甘露醇,产生靛基质,不产生硫化氢，甲基红阳性，Ｖ-P阴性,赖氨酸阳性,精氨酸阴性，鸟氨酸多数为阳性少数呈阴性,溶血性多数阳性,有少数不溶血,5结果报告根据镜检的菌体形态特征、TCBS平板上菌落特征、生化试验等判断样品中是否含有副溶血性弧菌。6注意事项(1）副溶血性弧菌在适宜温度下繁殖较快,但不适于在低温生存,在寒冷的情况下容易死亡,所以应防止待检材料冷冻,以免影响检验结果。（2)样品中的菌体因受存放条件等的影响，常处于受伤状态，所以不宜选用抑制性较强的培养基,否则影响细菌生长。７思考题（1)副溶血性弧菌在TCBS平板上有何菌落特征?为什么？(２)鉴定致病性副溶血性弧菌的重要指标是什么?实验9食品中空肠弯曲杆菌的检验1目的要求（1）了解空肠弯曲杆菌的生长特性。（２）了解食品中空肠弯曲杆菌的检验原理。２　基本原理空肠弯曲杆菌广泛存在于鸟、禽、猫、狗等动物体内，从牛奶、蟹肉、河水和无症状人群粪便中可分离到此菌。健康的鸡和奶牛携带该菌。空肠弯曲杆菌已涉及生的和未煮熟的鸡、生的和巴氏杀菌不彻底的牛奶、蛋制品、生火腿、未经氯处理的水。空肠弯曲杆菌为革兰氏染色阴性菌，螺旋形，弯曲杆状,大小为(0．２~0.8）μm×（0.５~5）μｍ，有一个以上螺旋并可长达８μm，也可出现Ｓ形或似飞翔的海鸥形,菌体一端或二端有单根鞭毛，长度约为菌体的2～３倍，有活泼的动力或不产生动力，超过48h的培养物以衰老的球菌状居多。空肠弯曲杆菌是一类微需氧菌，初次分离时需在含5％O2-8５％N２-10%ＣＯ2环境中，该菌相对脆弱,对周围环境敏感，如对干燥、加热、消毒、酸性和2１%氧气都敏感。培养适宜温度为２５~４３℃,最适宜温度为４２℃。最适pＨ7.2。对糖类既不发酵也不氧化，呼吸代谢无酸性或中性产物。在布氏肉汤中生长呈均匀混浊。在血琼脂上，初分离出现两种菌落特征:第一型菌落不溶血，灰色,扁平，润湿,有光泽,看上去像水滴,边缘不规则，常沿划线生长;第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落（直径1mm~2ｍm)，边缘整齐，半透明，有光泽,中心稍浑,呈单个菌落生长。3　实验材料3．1菌种　空肠弯曲杆菌（Caｍpylobａctｅｒｊｅjunｉ）。3．2检样碎牛肉、牛奶、鸡、污水。3.３培养基　布氏肉汤、改良Camｐ-BAP培养基、血琼脂基础培养基、甘氨酸培养基。3.4其他用品　生化试剂。４实验方法与步骤4．1空肠弯曲杆菌的检测顺序(如图36-1）4.2增菌(1)　碎牛肉称取2５g样品,置于匀质杯中，加入100mL布氏增菌肉汤，用均质器以80０0~1０000r/ｍiｎ均质３0s。将均质液通过灭菌纱布，倒入２50mＬ三角瓶中,于微氧条件下，37℃预增菌4ｈ后，42℃培养20～44h。(2)净膛全禽和分割肉在一个灭菌容器中，用250mL灭菌营养肉汤振摇洗涤样品5min,肉汤经灭菌纱布过滤,于２3000r/min、4℃离心20miｎ，或于16300r/ｍin、4℃离心30miｎ,弃去上清液，将沉淀物置于250mL三角瓶中,加入1０0ｍL布氏增菌肉汤,摇匀。于微氧条件下,37℃预增菌4h后,42℃培养2０~４4ｈ。(3)牛奶称取4０g牛奶放入离心管中，按2条中方法离心,弃去脂肪和上清液将沉淀物置于2５0mL三角瓶中，加入100mＬ布氏增菌肉汤,摇匀。于微需氧条件下，35℃预增菌４h后,４2℃培养２0~44h。(４）河水或污水取水样2~4L，每升水样加入5ｍL1mol/L硫代硫酸钠,用０.45μm微孔滤膜过滤，立即将滤膜置于１０0mL布氏增菌肉汤中,于微氧条件下，３0℃预增菌３h后，再于37℃增菌2h，然后于42℃培养20～４4h。4.2分离和初步鉴定取5mL经2０~4４h增菌的培养物，以０.6５μm孔径滤膜过滤。取经过滤和未经过滤的增菌培养物，分别在改良Caｍp-BAP培养基琼脂平板上划线接种，各不少于二个平板。将平皿置于微需氧条件下42℃培养２4～４8h。检查平板上有无不溶血、灰色、扁平、湿润、有光泽及有时沿接种线向外扩散的菌落。挑取典型菌落制作湿片,用相差(或暗视野）显微镜检查，本菌呈快速螺旋运动。涂片作革兰氏染色镜检时,本菌为革兰氏阴性，如小逗点状,两菌体的末端相连时，呈S形、海鸥形或螺旋状。挑取初步鉴定为弯曲杆菌的菌落,在布氏琼脂上划线作纯分离。培养方法同上，根据生化、生长特性和抗生素敏感性试验进行菌株证实。４.３证实试验从用作纯分离的平板上挑选二个典型菌落。从每个典型菌落各挑取一满接种环,分别接种于5０mL三角瓶中的4mＬ布氏肉汤中,于微需氧条件下４2℃培养24~48h,同时接种一份阳性培养物作为对照。通常用于生长试验和生化反应的基础培养物是含0.１8%琼脂的布氏肉汤。该培养基分装于试管中,每管7ｍL。从所有布氏肉汤中取出接种物,滴加0.2～0.3mL于琼脂表面。(１)生长温度试验接种3管含0.0０2％中性红（ＮR)的基础培养基，其中一管置于37℃培养，检查在这一温度下的生长情况，并用于观察过氧化氢酶反应。另二管分别置于２5℃和４２℃培养。每日检查有无生长。对未生长者,需培养5d方可作出最后判断。弯曲杆菌的生长仅限于接近培养基表面的一薄层,广泛的生长不是弯曲杆菌属细菌所致。(２)过氧化氢酶试验滴加３%过氧化氢溶液于有细菌生长的试管中,产生气泡者为阳性反应。(3)氧化酶试验使用琼脂平板表面经２4h培养的生长物。将氧化酶试剂滴于棉拭子上,用棉拭子接触生长物表面,接触点变为深蓝色者为阳性。(4）硝酸盐还原试验将供试培养物接种于含1%硝酸钾的基础培养基中,置空气中于37℃培养5d。加入亚硝酸盐检测试剂,出现红色者为阳性反应。（５）１%甘氨酸中生长试验将供试培养物接种于加有NＲ和1%甘氨酸的基础培养基中,置空气中于３７℃培养,每日检查有无生长，对未生长者需培养5d，方可作出最后判断。(6）　3.5%氯化钠中生长试验将供试培养物接种于加有NＲ和3.5%氯化钠的基础培养基中，置空气中于３7℃培养.每日检查有无生长,对未生长者需培养5ｄ,方可作出最后判断。(7)硫化氢产生试验将肉汤培养物接种于加有