细胞总蛋白提取-考马斯亮蓝测蛋白含量 (2)

精品文档精品文档可编辑可编辑精品文档可编辑蛋白样品的获得主要包括破碎法、沉淀法、蛋白溶解等，可以根据实验目前选择最合适的方法，本文主要了蛋白抽提的仪器和材料的准备，试剂溶液的配制以及具体的操作步骤。蛋白提取方法1材料和方法1.1材料1.1.1组织和细胞的来源：1.1.2HYPERLINK"http://www.bio1000.com/zt/focus/351875.html"\t"_blank"仪器设备机械组织匀浆器低温高速HYPERLINK"http://www.bio1000.com/zt/product/lixinji.html"\t"_blank"离心机(>40,000g)超速离心机超生细胞破碎仪超纯水装置1.1.3试剂三氯醋酸(TCA)丙酮二硫苏糖醇(DTT)尿素CHAPSPMSFHYPERLINK"http://www.bio1000.com/zt/focus/edta.html"\t"_blank"EDTA乙醇磷酸考马斯亮蓝R350抑肽素A亮肽素试剂纯度均应是分析纯或以上。1.1.4溶液配制(1)HYPERLINK"http://www.bio1000.com/zt/product/pbs.html"\t"_blank"PBS：NaCl8g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO4，溶于800ml水中，用HCl调pH至7.4，用纯水定容至1L;(2)EDTA储存液：18.61gNa2EDTA•2H2O，溶于70ml纯水中，用10mol/LNaOH调节pH值至8.0(约需2gNaOH颗粒)，定容为100ml。可高压灭菌后分装备用;(3)亮肽素储存液(50μg/ml，100×)10mg/ml溶于水，-75℃保存;使用时配成50μg/ml储液，-20℃保存;(4)抑肽素储存液(70μg/ml，100×)1mg/ml溶于甲醇，-75℃保存;使用时配成70μg/ml储液，-20℃保存;(5)PMSF储存液(10mM,100×):17.4mgPMSF，溶于1ml异丙醇中，-20℃保存。DTT储存液(1M):0.31gDTT溶于2mlH2O中，-20℃保存(DTT或含有DTT的溶液不能进行高压处理，可过滤除菌)。(7)裂解液:LysisbufferA(9Murea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)LysisbufferB(7Murea,2Mthiourea,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)LysisbufferC40mMTris-base(pH9.5)inultrapureH2OLysisbufferD(8Murea,4%CHAPS,40mMTris(base),40ml)LysisbufferE(5Murea,2Mthiourea,2%SB3-10,2%CHAPS,1%w/vDTT,0.5%CAandacocktailofproteaseinhibitors)LysisbufferF100μLSDSsamplesolution(1%w/vSDS,0.375MTris-HCl,pH8.8,50mMDTT,25%v/vglycerol)●CA、蛋白酶抑制剂混合物和DTT在临用前加入。蛋白酶抑制剂混合物[3]成分终浓度蛋白酶抑制剂混合物PMSF35μg/mlor1mMEDTA0.3mg/ml(1mM)抑肽素0.7μg/ml亮肽素0.5μg/ml1.2方法1.1.1组织蛋白提取方法1.2.1.1三氯醋酸/丙酮沉淀法[1](1)冰上取材，称湿重，置液氮中冻存或直接进行下一步;(2)在液氮中研碎样品或使用机械匀浆器磨碎组织;(3)将粉末悬浮于含DTT(0.2%w/v)的10%三氯醋酸(w/v)的丙酮溶液中;(4)蛋白–20℃沉淀过夜;(5)35000×g(6℃)离心30min;将沉淀重悬于含0.2%DTT的预冷丙酮中;(7)-20℃放置1h;35000×g(6℃)离心30min;(9)在通风橱中让丙酮充分挥发，得到干燥的沉淀;(10)在裂解液中重新溶解沉淀(50-100mg组织需要1ml裂解液);(11)15℃,40000×g，离心1hr;(12)用Bradford法[2]测定上清的蛋白浓度，分装后置–75℃保存。1.2.1.2超速离心法(1)取材;(2)用研钵在液氮冷冻条件下将样品研成粉末，每1g样品加入0.5ml裂解液，使用组织匀浆器匀浆30s;(3)组织悬液15℃，10000×g离心10min;(4)上清液4℃，150000×g超速离心45min;(5)小心避开上层漂浮的脂质层，吸取离心上清6℃40,000g再次离心50min;取离心上清。Bradford法定量，分装后置–75℃保存。1.2.2培养细胞蛋白提取1.2.2.1循环冻融法(1)吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次;(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中;(3)500×g，离心5min;(4)弃上清，PBS洗三次(室温,500×g，5min)，(5)在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中;执行Biofuge存储程序8，500×g5min离心;(7)用200μl微量加液器吸出PBS，弃去;吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，巴氏滴管混匀，液氮中反复冻融三次(每次置液氮中3s，室温融化)，DTT在第一次冻融后加入;(9)执行Biofuge存储程序6，15℃，40000×g，离心1hr(Biofuge);(10)上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。1.2.2.2超声破碎法(1)取对数生长期的细胞，吸出培养液弃去，0.01mol/LPBS洗一次;(2)加入PBS，用橡胶刮收集细胞于10ml离心管中;(3)室温，500×g，离心5min;(4)弃上清，PBS洗3次(室温,500×g，5min);(5)在离心管中加入1mlPBS，重悬细胞，用1ml微量加液器移入Eppendorf管中，500×g离心5min;吸干残留的PBS，估计样品体积，加入5倍体积裂解液，混匀，移入1.5mlEppendorf管中，冰浴中以最大功率超声破碎细胞(3×10s);(7)15℃,40000×g，离心1hr(Biofuge);上清Bradford法定量，沉淀-75℃保存备用。2.结果和讨论蛋白质提取的基本步骤包括清洗组织或细胞、裂解细胞、离心除去膜组分等获得溶解的蛋白质上清。我们破碎细胞采用循环冻融法和超声波法;破碎组织采用液氮研磨法和机械匀浆法。循环冻融法操作简便，比较适合提取培养细胞的稳定蛋白，我们后期实验对培养细胞主要采取这种破碎方式。使用超声破碎必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。因为产生泡沫会导致蛋白质变性，同时要注意散热。匀浆是机体软组织破碎最常用的方法之一。由于匀浆过程中蛋白质被蛋白酶降解的可能性较小，所以匀浆是简便、迅速和风险小的组织破碎方法，我们实验室在破碎脑和脊髓组织时常用此法;由于神经组织比较柔软，液氮研磨法也很适合，本实验中我们使用了这一方法破碎大鼠脊髓组织，中枢神经组织由于富含脂类，沉淀法和高速离心法可以使蛋白和脂类干扰物质有效分离，但沉淀法的缺点是再溶解时蛋白损失严重。高速离心的缺点是需要样品量大，如BeckmanL7-65超速离心机的离心管容量为8ml，不适用小量样品的制备。在众多的裂解液配方中，我们主要采用9M尿素,4%w/vCHAPS,1%w/vDTT,0.5%两性电解质加蛋白酶抑制剂混合物，原因是这一配方经长期使用很稳定，裂解效率也较高，非常适合小量细胞蛋白提取要求。针对富脂的中枢神经组织中脂类物质与蛋白相互作用，高浓度的尿素可以造成强变性条件(但如果再提高尿素浓度，尿素就容易析出，影响蛋白的溶解)，过量的去污剂也可以减少脂类的污染，两性电解质可以提高蛋白的溶解度，同时有利于等待聚焦。早期我们加入Tris碱以防止蛋白的水解，但是由于盐离子的引入，导致IEF电压过低，影响聚焦。蛋白抽提纯化过程中务必保证实验的试剂、仪器等整个实验过程中没有蛋白酶的作用，一定要抑制蛋白酶的活性，可以通过加入苯甲基磺醯化氟PMSF和AEBSF抑制苏氨酸蛋白酶和半胱氨酸HYPERLINK"http://www.bio1000.com/zt/protein/danbaimei.html"\t"_blank"蛋白酶活性、加入EDTA抑制金属HYPERLINK"http://www.bio1000.com/zt/protein/danbaimei.html"\t"_blank"蛋白酶活性，高的pH可以抑制大多说蛋白酶活性。、细胞总蛋白的提取及裂解液一．悬浮细胞计数107重悬于0.5mlPBS(0.01M)中，加入饱和浓度一抗(1/10)或（10ug/ml）4℃15-30min后，短暂离心4000转×3分，用PBS0.4-0.5ml重悬(室温),加入饱和浓度二抗（1/100）或(20ug/ml),迅速置于37℃水浴中2-5分后（迅速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uMNa3VO4,5mMEDTA,10mMNaF））,离心4000转×3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-0.3ml(裂解浓度108/ml？)吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入10ul浓度为10mg/ml的PMSF储存液，冰点孵育30分钟。4度离心15000g20min。上清液即为全部细胞溶解成分。二．裂解缓冲液：50mMTris-HClpH7.6或20mMHepespH7.4150-300mMNaCl1％(w/w)NP-40(0.5%Triton-X100)5mMEDTA（现加1ml加10ul）临用前加入蛋白酶抑制剂：Na3VO4钒酸钠1mM(75mM—13.3ul/ml)（用0.2mol/L储存液配制）PMSF苯甲酰氟1mM(10mg/mlPMSF用量：10ul/ml)或10-20ug/mlSoybeanTrypsininhibitor（加10-20ul）Aprotinin抑肽酶10ug/ml（10ul/ml）(Leupeptin亮肽素10ug/ml未加)Westernblotting三．给你介绍一个裂解液：50mMTris-HCl（PH8.0）缓冲液，含：NaCl150mM叠氮钠0.02%SDS0.1%NP-401%PMSF100ug/ml（使用前临时加入）(10mg/mlPMSF用量：10ul/ml)尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用6xSDS上样buffer。四．我的样品蛋白是这样制备的：１．将与腺病毒转染液共培养２４小时的细胞消化下来２．离心收集细胞３．向离心管里加入４０微升１×PBS缓冲液，随后再加入４０微升2×Lamilybuffer（由tris碱和SDS组成）裂解细胞４．将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟，放冷后离心．５．测定蛋白浓度，加样电泳我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不是指加样孔下面有蛋白．胶的浓度应该没问题。五．碧云天公司技术支持Western及IP细胞裂解液的主要成分为20mMTris(pH7.5)，150mMNaCl，1%TritonX-100，以及焦磷酸钠,β-glycerophosphate，EDTA，Na3VO4，leupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。(-20℃保存，一年有效。)如果是贴壁细胞，按照6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培养液量的1/20）加入裂解液。六．军科院技术支持裂解液（50mmol/LTris?HClpH8.0，150mmol/LNaCl，1％TritonX－100，100ug/mlPMSF）：1mol/LTris?HCl（pH8.0）2.5mlNaCl0.438gTritonX－1000.5ml蒸馏水至50ml混匀后，4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100ug/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/mlPMSF50μl）。七．操作方法：蛋白样品制备：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加3ml4度预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10ulPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、每瓶细胞加400ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于4度下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20度保存。考马斯亮蓝法也称考马斯蓝染色法（coomassiebluestaining）又称Bradford法。由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/1362725.htm"\t"_blank"考马斯亮蓝G-250（CoomassiebrilliantblueG-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/3949125.htm"\t"_blank"游离状态下呈红色，最大HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/793288.htm"\t"_blank"光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/92530.htm"\t"_blank"色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/421677.htm"\t"_blank"室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/495141.htm"\t"_blank"灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/4080007.htm"\t"_blank"考马斯亮蓝G250由于与HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/15472.htm"\t"_blank"蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/25110.htm"\t"_blank"电泳条带染色。考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/207615.htm"\t"_blank"核糖核酸酶或HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/39726.htm"\t"_blank"溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/390397.htm"\t"_blank"TritonX-100、SDS、NP-40等。1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，HYPERLINK"http://baike.baidu.com/view/1012539.htm"\t"_blank"显色反应不得超过30min．6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。注意：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。待一两周左右，皮屑细胞自然衰老脱落即可无碍。蛋白质浓度测定的方法有很多，考马斯亮蓝测定蛋白质是实验室最常见的一种方式，它利用比色法和色素法混合方法、操作简便，下文介绍了考马斯亮蓝测定蛋白质浓度的原理、优缺点、操作以及注意事项。实验原理考马斯亮蓝(CoomassieBrilliantBlue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。考马斯亮蓝染色法的突出优点是：(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。(3)干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、HYPERLINK"http://www.bio1000.com/zt/focus/edta.html"\t"_blank"EDTA等均不干扰此测定法。此法的缺点是：(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、TritonX-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。试剂与器材一、试剂考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250100mg溶于50mL95%乙醇中，加入100mL85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。二、标准和待测蛋白质溶液1.标准蛋白质溶液结晶HYPERLINK"http://www.bio1000.com/zt/experiment/bsa.html"\t"_blank"牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。2.待测蛋白质溶液。人血清，使用前用0.15mol/LNaCl稀释200倍。三、器材试管1.5×15cm(×6)，试管架，移液管管0.5mL(×2);1mL(×2);5mL(×1);恒温水浴;HYPERLINK"http://www.bio1000.com/zt/product/351938.html"\t"_blank"分光光度计。操作方法一、制作标准曲线取7支试管，按下表平行操作。试管编号0123456标准蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.060.15mol/LNaCl（mL）0.10.090.080.070.060.050.04考马斯亮蓝试剂（mL）5mL摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色A595nm绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。二、未知样品蛋白质浓度测定测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。注意事项在试剂加入后的5-20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用，重复测定吸光度时，比色杯一定要冲洗干净，制作蛋白标准曲线的时候，蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定，防止误差。考马斯亮蓝法测定牛血清蛋白的标准曲线？一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250100mg溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%H3PO4，雍蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。2、移液管使用（）。（三）、标准曲线制作：试管编号0123456100ug/ml标准蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl（ml）10.90.80.70.60.50.4考马斯亮蓝试剂（ml）5555555摇匀，1h内以1号管为空白对照,在595nm处比色A595nm1、2、以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20ug、30ug、40ug、50ug、60ug），在坐标轴上绘制标准曲线。1）、利用标准曲线查出回归方程。2）、用公式计算回归方程。3）、或用origin作图，测出回归线性方程。即A595nm=a×X()+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。2、取量要准确。3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。4、对照：用被测物质以外的物质作空白对照。一、原理HYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E8%80%83%E9%A9%AC%E6%96%AF%E4%BA%AE%E8%93%9D&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"考马斯亮蓝G-250（CoomassieG-250）是一种甲基取代的HYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E4%B8%89%E8%8B%AF%E5%9F%BA%E7%94%B2%E7%83%B7&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"三苯基甲烷，分子中磺酸基的蓝色染料，在465nm处有最大吸收值。考马斯亮蓝G-250能与蛋白质通过范得华相互作用形成蛋白质—考马斯亮蓝复合物蓝色溶液，引起该染料的最大吸收λmax的位置发生红移，在595nm处有最大吸收值。由于蛋白质—考马斯亮蓝复合物在595nm处的光吸收远高于考马斯亮蓝在465nm处的光吸收，因此，可大大地提高蛋白质的测定灵敏度。蛋白质—考马斯亮蓝复合物溶液颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。利用溶液颜色的差异进行比色测定，适合于蛋白质类的HYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E5%AE%9A%E9%87%8F%E5%88%86%E6%9E%90&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"定量分析，尤其适合于稀有蛋白质的微量分析。考马斯亮蓝G-250试剂呈色反应颜色稳定、灵敏度高，最低测试蛋白质量在1ug左右。二、操作步骤1.HYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E6%A0%87%E5%87%86%E6%9B%B2%E7%BA%BF&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"标准曲线测定法分别取六只试管，其中一只加入1.0ml蒸馏水做空白，5只分别加入不同体积的浓度为100ug/ml牛血清HYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E6%B8%85%E8%9B%8B%E7%99%BD&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"清蛋白标准液，补充水到1.0ml。然后每只试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min，在紫外-HYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E5%8F%AF%E8%A7%81%E5%88%86%E5%85%89%E5%85%89%E5%BA%A6%E8%AE%A1&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"可见分光光度计595nm处测定吸光值。以A595吸光值为纵坐标，牛血清清蛋白的ug数量为横坐标绘制标准曲线。具体操作见下表。蛋白质标准曲线测定加样试剂空白12345100ug/ml牛血清清蛋白/ml1.00.10.20.40.60.8牛血清清蛋白/ug01020406080HYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E5%8E%BB%E7%A6%BB%E5%AD%90%E6%B0%B4&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"去离子水/ml00.90.80.60.40.2考马斯亮蓝G-250试剂/ml5.05.05.05.05.05.0吸光值A5952.蛋白样品配制浓度约100ug/ml的待测蛋白质溶液。取一只试管加入1.0ml蒸馏水做空白，一支加入0.5ml待测蛋白质溶液，补充水到1.0ml。然后每支试管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀放置5min后，在紫外-可见分光光度计595nm处测定吸光值。用测得的吸光值从标准曲线上查得相当于牛血清清蛋白的ug数量，计算出待测蛋白质的含量。在标准蛋白质和蛋白质样品的测定时，为了减小误差，每一个浓度的蛋白质做3支平行管。3.试剂配置a.牛血清清蛋白标准液结晶牛血清清蛋白或酪蛋白，预先经HYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E5%BE%AE%E9%87%8F%E5%87%AF%E6%B0%8F%E5%AE%9A%E6%B0%AE%E6%B3%95&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"微量凯氏定氮法标定该蛋白质的百分含量或者根据牛血清清蛋白的HYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E6%B6%88%E5%85%89%E7%B3%BB%E6%95%B0&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"消光系数是6.6来计算其百分含量。然后根据该蛋白的纯度配置成浓度为100ug/ml的蛋白溶液。b.考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100mlHYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E8%B4%A8%E9%87%8F%E6%B5%93%E5%BA%A6&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"质量浓度为0.85g/ml的HYPERLINK"http://wenwen.soso.com/z/Search.e?sp=S%E7%A3%B7%E9%85%B8&ch=w.search.yjjlink&cid=w.search.yjjlink"\t"_blank"磷酸，作为母液保存，使用时用水稀释到1000ml。试剂的最终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250、质量浓度为0.085g/ml磷酸。BCA法测定蛋白质浓度【目的】：掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理。【原理】：BCA(bicinchoninincacid)与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色…【目的】：掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理。【原理】：BCA(bicinchoninincacid)与二价铜离子的硫酸铜等其他HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html"\t"_blank"试剂组成的HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-43.html"\t"_blank"试剂，混合一起即成为苹果绿，即BCA工作试剂。在碱性条件下，BCA与蛋白质结合时，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，一个Cu+螯合二个BCA分子，工作试剂由原来的苹果绿形成紫色复合物，最大光吸收强度与蛋白质浓度成正比。【操作】标准曲线的绘制：取HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-952.html"\t"_blank"试管七支、编号，按下表操作：【计算】（一）绘制标准曲线。（二）以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。（三）再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。【优缺点】(一)操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便；(二)准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。(三)经济实用，除HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-952.html"\t"_blank"试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量；(四)抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响,但是还原剂容易使2价铜转化为1价铜,导致吸光度提高.【器材】（一）7220型分光光度计（二）恒温HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-56.html"\t"_blank"水浴箱（三）中试管7支（四）枪式移液管【试剂】1、试剂A：1％BCA二钠盐2％无水碳酸钠0.16%酒石酸钠0.4％氢氧化钠0.95％碳酸氢钠混合调PH值至11.25。2、试剂B：4％硫酸铜。3、BCA工作液：试剂A100ml＋试剂B2ml混合。4、蛋白质标准液：用结晶牛HYPERLINK"http://www.ebioe.com/yp/product-list-636.html"\t"_blank"血清白蛋白根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定）5、待测样品：用双缩脲测定法的样品稀释而成。此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。总之，虽然蛋白质含量的测定方法很多，但是，还没有一个完美的方法。在选择测定方法时，可根据实验要求和实验室条件决定。BCA蛋白质定量检测试剂盒产品说明：BCA法是理想的蛋白质定量方法，在碱性环境下蛋白质分子中肽键结构与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA特异地与Cu1结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nM处有最大的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比，可以根据吸收值测定蛋白质浓度。该测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去垢剂等影响小。产品特点：1.准确灵敏，线性范围广，BCA试剂的蛋白质测定范围是25－500μg/ml;2.快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便;3.不受样品中离子型和非离子型去污剂影响;4.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝,可以酶标板法或分光光度计法测定蛋白质浓度。编号包装价格产地SK3021500Assays450生工ModifiedBCAProteinAssayKit改良型BCA蛋白浓度测定试剂盒产品说明：在碱性环境中，蛋白质和Cu2+离子结合并将其还原成Cu+离子。BCA与Cu+离子结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nm处有最大光吸收并与蛋白质浓度成线性关系，据此可测定蛋白质的浓度。与Lowery法相比，BCA法最大的优点就是不受去垢剂的影响。但样品中若存在还原剂，同样可以将Cu2+离子还原成Cu+离子，从而提高光吸收值。本试剂盒中的试剂C可以有效地降低蛋白质抽提样品中残留的还原剂对蛋白质浓度检测的干扰。当样品中的DTT浓度≤5mM或β-巯基乙醇浓度≤10mM时，蛋白质浓度的测定不会受影响。产品特点：1.在样品中的DTT浓度≤5mM或β-巯基乙醇浓度≤10mM时，光吸收值不受影响；2.可以采用酶标板法或分光光度法进行蛋白质定量，定量范围为25-1000ug/ml；3.需要的样品体积5-25ul；4.不受样品中低浓度的离子型和非离子型去污剂影响。编号包装价格产地SK3051500Assays500生工MicroBCAProteinAssayKitBCA法微量蛋白质浓度测定试剂盒产品说明:BCA法是理想的蛋白质定量方法，在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu1+。BCA与Cu1+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562nM处有最大的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。该测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，并且受干扰物质去垢剂等影响小。本试剂盒适用于微量蛋白质浓度的测定。产品特点：1.适用于浓度比较稀的蛋白质样品的定量；2.定量范围：分光光度法0.5-20μg/ml；酶标板法2-40μg/ml；3.与离子型或非离子型去污试剂兼容；4.检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考马氏亮蓝。编号包装价格产地