项目46食品中还原糖的测定

Determination of carbohydate in foods 引 言 食品中糖类测定是食品的主要项目之一，在食品工业中具有十分重要的意义。 1、食品加工中常需要控制一定量的糖酸比 2、糖果中糖的组成及比例直接关系到其风味和质量 3、糖的焦糖化作用及羰氨反应既可使食品获得诱人的色泽和风味，又能引起食品的褐变，必须根据工艺需要加以控制 4、食品中糖类含量也在一定程度上标志着营养价值的高低，是某些食品的主要质量指标 典型食品糖类含量国家 学习目标 知识目标： 1.能区别不同提取剂、不同澄清剂之间的差异 2.能解读国家标准食品中还原糖含量测定 3.能解释不同方法测定食品中还原糖含量原理 技能目标： 1.能依据国家标准进行还原糖测定实验准备； 2.会控制操作反应条件，正确进行还原糖测定； 3. 能准确报告检测结果，评价还原糖含量是否符合标准。 素质目标： 1.培养学生严谨、务实的学习精神； 2.培养学生开拓创新、团结协作的职业素质。 基础知识 什么是还原糖？ 具有还原性的糖类。 在糖类中,分子中含有游离醛基或酮基的单糖和含有游离半缩醛羟基的双糖都具有还原性。 还原糖的测定方法是一般糖类定量的基础。 还原糖：葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖 样品预处理共分两大步骤：提取样品液→澄清样品液 1.提取 取样→加提取剂提取→过滤或倾出提取液 常用的提取剂：水和乙醇溶液 水：温度一般控制在40~50℃。若温度更高，可提取出相当量可溶性淀粉和糊精。为防止蔗糖等低聚糖在加热时被部分水解，提取液应调为中性。 乙醇：常用70%~75%，用高浓度乙醇的目的，降低酶的作用，避免糖被酶水解；还可以使淀粉和糊精沉淀。此时提取液不用除蛋白质。 提取液制备的原则 （1）取样量和稀释倍数 一般每毫升提取液含糖量应在0.5~3.5mg之间 提取10g含糖2%的样品可在100mL容量瓶中进行提取。 （2）含脂食品（如乳酪、巧克力、蛋黄酱杏仁糖等） 石油醚脱脂→水提取 （3）含大量淀粉和糊精的食品 （如粮谷制品、某些蔬菜、调味品） 70%~75%的乙醇溶液提取，沉淀淀粉和糊精，不需要除蛋白 （4）含酒精和二氧化碳的液体样品 通常蒸发至原体积的1/3~1/4，以除去酒精和二氧化碳。 但是酸性食品，在加热之前应预先用氢氧化纳调节样品溶液至中性，以防止低聚糖被部分水解。 （5）固体样品 40~50℃的水提，温度高可溶性多糖溶出，增加澄清负担 乙醇做提取剂，加热时应安装回流装置 2. 澄清 方法：提取液中加入一定量澄清剂混匀→静置→过滤，得待测液 澄清剂的用量 用量必须适当：太少，达不到澄清的目的。 太多，会使分析结果产生误差。 中性醋酸铅—先加1~3mL饱和醋酸铅溶液（30%），静置15分钟，向上清液中加入几滴中性醋酸铅溶液，如有沉淀就重复，无，则沉淀完全。 乙酸锌和亚铁氰化钾溶液—50~75mL样液加入乙酸锌溶液和亚铁氰化钾溶液各5mL。 硫酸铜和氢氧化钠溶液—50~75mL样液加入10mL硫酸铜溶液和4mL氢氧化钠溶液。 费林试剂法选用乙酸锌和亚铁氰化钾作为澄清剂,各5mL 注意： ①乙酸锌和亚铁氰化钾混合形成白色的氰亚铁酸锌沉淀，能使溶液中的蛋白质等共同沉淀下来。 ②采用中性醋酸铅做澄清剂时，澄清后的样液中残留有铅离子，在测定过程中加热样液时，铅能与还原糖（特别是果糖）结合生成铅糖化合物，结果使测得的还原糖含量偏低。因此必须除铅。 常用的除铅剂有草酸钠、草酸钾、硫酸钠、磷酸钠、磷酸氢二纳等。 ③本法是根据一定量的碱性酒石酸铜溶液（铜离子量一定）消耗的样液量来计算样液中还原糖含量，反应体系中铜离子的含量是定量的基础，所以样品在处理时，不能用铜盐（硫酸铜－氢氧化钠）作为澄清剂。 子项目一 黄酒中还原糖的测定 直接滴定法 GB/T 5009.7-2008 检测依据 直接滴定法 高锰酸钾滴定法 1 2 GB/T 5009.7-2008 直接测定法测定原理 试样经除去蛋白质后，在加热条件下，以亚甲基蓝作指示剂，滴定标定过的碱性酒石酸铜溶液(费林试剂)（用还原糖标准溶液标定），根据样品消耗的体积计算还原糖含量。 将一定量的费林试剂甲、乙液等量混合，立即生成天蓝色的氢氧化铜沉淀 这种沉淀很快与酒石酸钾钠反应，生成深蓝色的可溶性酒石酸钾钠铜络合物。 在加热条件下，以次甲基蓝作为指示剂，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，生成红色的氧化亚铜沉淀 继续滴定，待二价铜全部被还原后，稍过量的还原糖把次甲基蓝还原，溶液由蓝色变为无色，即为滴定终点 根据样液的消耗量可以算出还原糖的含量。 滴定过程中颜色的变化 蓝色 红色 蓝色 无色 适用范围 适合于各类食品中还原糖的快速测定。 但是测定酱油、深色果汁等样品时，因色素干扰，滴定终点常常模糊不清。 特点：试剂用量少，操作和计算都比较简便、快速，滴定终点比较明显 具体工作任务分解 任务一、仪器设备及试剂的准备 试剂： 费林试剂甲液：(15.00g无水硫酸铜+0.05g次甲基蓝→1000mL) 费林试剂乙液：(50.00g酒石酸钾钠+75.00g氢氧化钠溶解后+4g亚铁氰化钾→1000mL) 乙酸锌溶液 亚铁氰化钾溶液 1mg/mL葡萄糖标准溶液 注：1、费林试剂甲液和乙液要分别贮存，用时才能混合原因： 酒石酸铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。 2、在费林试剂乙液中加入亚铁氰化钾，可以使所生成的氧化亚铜的红色沉淀与之形成可溶性的无色络合物，使终点便于观察。 澄清剂 1g/L葡萄糖标准溶液的配制 精确称取1.0000g经过98～100℃干燥2h至恒重的纯葡萄糖 ，加水溶解后移入到1000mL的容量瓶中，加入5ml盐酸(防止微生物生长)，用水稀释到1000mL。 （此溶液葡萄糖浓度相当于1.0mg/mL） 仪器： 25mL的酸式滴定管、可调电炉、150mL锥形瓶4个、10mL量筒、5mL移液管2根、250mL容量瓶1个、250mL锥形瓶2个、漏斗2个、50mL烧杯1个 任务二、样品预处理 称取100g混合均匀后的试样→ 置蒸发皿→ 用NaOH（40g/L）溶液中和至中性→ 水浴上蒸发至原体积的1/4→移入250mL容量瓶中→慢慢加入5mL乙酸锌溶液和5mL亚铁氰化钾溶液→加水至刻度→混匀→静置30min →干燥滤纸过滤→弃去初滤液20～30mL →滤液备用 注：样品预处理的原则：除去样品中的蛋白质、淀粉、脂肪等干扰成分。 任务三、样品还原糖含量测定 1、费林试剂的标定 2、样品溶液的预测定 3、样品溶液测定 计算每10mL（甲、乙各5mL）费林试剂相当于葡萄糖的质量m1（mg） m1=V×c m1：每10mL费林试剂相当于葡萄糖的质量，mg c——葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL； V——标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。 〖注〗为了提高准确度，用哪种还原糖示结果就用相应的还原糖标定碱性酒石酸铜溶液。 蓝色 无色 这个过程发生了什么？ 次甲基蓝也是一种氧化剂，但在测定条件下氧化能力比铜离子弱，故还原糖先与铜离子反应，铜离子完全反应后，稍过量的还原糖与次甲基蓝指示剂反应，使之由蓝色变为无色，指示终点。 2.样品溶液的预滴定 准确吸取费林试剂甲液和乙液各5mL→150mL锥形瓶→加水10mL→玻璃珠3粒→加热使其在2分钟内沸腾→趁沸以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品液（注：需要始终保持溶液的沸腾状态）→待溶液蓝色变浅时，趁热以每1d/2s的速度滴定→直至溶液蓝色刚好褪去为终点→记录消耗体积V1 3.样品溶液测定 吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL→3个150mL锥形瓶中→加水10mL→加玻璃珠3粒→从滴定管中加入比预测时样品溶液消耗总体积V1少1mL的样品溶液→加热使其在2分钟内沸腾→沸腾30s→趁热以每1d/2s的速度继续滴加样液→直至蓝色刚好褪去为终点→记录消耗样品溶液的体积V2 同法平行操作3份，取平均值。 任务四：检验结果的数据处理 项目名称 食品中还原糖测定 样品名称 接样日期 检测日期 检验依据 GB/T 5009.7-2008-第一法 锥形瓶标记(标定) 第一份 第二份 第三份 标定 V0初 V0终 V0 10mL酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的量m1=c0×V0 酒石酸铜溶液当量平均值m1 样品质量m 锥形瓶标记(正式滴定) 第一份 第二份 第三份 正式滴定 V初 V终 V 计算公式 X= 葡萄糖含量（g/100g） 平均值（g/100g） 标准规定分析结果的精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过10%。 本次试验分析结果的精密度 还原糖（以葡萄糖计%）X= 式中： X ——试样中还原糖含量，g/100g； m——样品质量，g； m1——10mL碱性酒石酸铜溶液相当于葡萄糖的质量，mg； V——测定时平均消耗样品溶液的体积，mL； 250——样品的总体积，mL。 有效数字： 试样中还原糖含量≥10 g/100 g 时，保留三位有效数字； 试样中还原糖含量＜10 g/100 g 时，保留二位有效数字。 精密度：在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 注：样液中还原糖浓度过高时，适当稀释再进行正式测定，使每次滴定消耗样液的体积控制在与标定碱性酒石酸铜溶液时所消耗的还原糖标准溶液的体积相近，约10mL左右。 当浓度过低时则采取直接加入10mL样品液，免去加水10mL，再用还原糖标准溶液滴定至终点，记录消耗的体积，与标定时消耗的还原糖标准溶液体积之差，再乘以标准溶液的浓度，就相当于10mL样液中所含还原糖的量m2。（公式中V=10mL,m1改为m2) 任务五：填写检验报告单 实验过程中 （1）热源强度应控制在使反应液在2min内沸腾，滴定速度为每1d/2s,总沸腾时间为3min。 （2）在测定过程中要严格遵守标定时所规定的操作条件，如热源强度（电炉功率）、锥形瓶规格、加热时间、滴定速度等，使平行实验条件保持一致。 （3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上拿下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。 （4）为了提高测定的准确度，要求用哪种还原糖表示结果就用相应的还原糖标定碱性酒石酸铜溶液，如用葡萄糖表示结果就用葡萄糖标准溶液标定碱性酒石酸铜溶液。 1、滴定必须在沸腾条件下进行原因 一是可以加快还原糖与铜离子的反应速度； 二是次甲基蓝变色反应是可逆的，还原型次甲基蓝遇空气中氧时又会被氧化为氧化型。 三是氧化亚铜极不稳定，易被空气中氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入。 2、样品的预滴定目的 一是本法对样品溶液中还原糖浓度有一定要求（1mg/mL左右），测定时样品溶液的消耗体积应与标定葡萄糖标准溶液时消耗的体积相近，通过预测可调节样品中还原糖浓度，使预测时消耗样液量在10mL左右。 二是通过预测可知道样液大概消耗量，以便在正式测定时，预先加入比实际用量少1mL左右的样液，只留下1mL左右样液在续滴定时加入，以保证在1分钟内完成续滴定工作，提高测定的准确度。 注： 影响测定结果的主要操作因素时反应碱度、热源强度、煮沸时间和滴定速度。 反应液的碱度直接影响二价铜与还原糖反应的速度、反应进行的程度及测定结果。在一定范围内，溶液碱度越高，二价铜的还原越快。 热源强度应控制在使反应液在两分钟内沸腾，且应保持一致。 滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上拿下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。 沸腾时间和滴定速度对结果影响也较大，一般沸腾时间短，消耗糖液少，反之，消耗糖液多；滴定速度快，消耗糖量少，反之，消耗糖量多。 假如样品中含有较多的还原性双糖，则会使测定的结果偏低 准确称量2g牛乳样品，用水稀释后移至100mL的容量瓶中，加水置刻度。准确称取两份费林试剂甲、乙液各10mL放入锥形瓶中。一份用标准的1g/L的葡萄糖溶液滴定，消耗标准溶液20mL，一份用样液进行滴定，消耗样液19.5mL，求样品中还原糖的含量（以葡萄糖计）？ 习题讲解 扩展教学 一、高锰酸钾滴定法 1.原理 将一定量的样液与过量的碱性酒石酸铜溶液反应，还原糖会将二价铜还原为氧化亚铜，经过滤，得到氧化亚铜沉淀，加入过量的酸性硫酸铁将其氧化溶解，而三价铁盐被定量地还原为亚铁盐，用高锰酸钾标准溶液滴定所生成的亚铁盐，根据高锰酸钾溶液消耗量可计算出氧化亚铜的量，查检索表，从而可计算出样品中还原糖的含量。 所以碱性酒石酸铜溶液中不能含有亚铁氰化钾 适用范围 本法是国家标准分析方法，第二法 适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液不受限制。 优点：准确度和重现性都优于直接滴定法。 缺点：操作复杂、费时，需使用特制的高锰酸钾法糖类检索表。 ①此法又称贝尔德蓝(Bertrand)法 ②取样量视样品含糖量而定，取得样品中含糖应在25 -1000mg范围内，测定用样液含糖浓度应调整到0.01~0.45％范围内，浓度过大或过小都会带来误差。通常先进行预试验，确定样液的稀释倍数后再进行正式测定 ③此法以测定反应过程中产生的定量的Fe+2为计算依据，因此，在样品处理时，不能用乙酸锌和亚铁氰化钾作为澄清剂，以免引入 Fe+2，并且加入的硫酸铁溶液要稍微过量。 说明与讨论 ④测定必须严格按规定的操作条件进行，必须控制好热源强度保证在4min内加热至沸，沸腾时间2min也要准确，否则误差较大。实验时可先取50mL水，加费林试剂甲、乙液各25mL，调整热源强度，使其在4min内加热至沸、维持热源强度不变，再正式测定。 ⑤此法所用碱性酒石酸铜溶液是过量的，即保证把所有的还原糖全部氧化后，还有过剩的Cu2+存在。所以，煮沸后的反应液应呈蓝色（酒石酸钾钠铜络离子）。如不呈蓝色，说明样液含糖浓度过高，应调整样液浓度，或减少样液取用体积。 ⑥在过滤及洗涤氧化亚铜沉淀的整个过程中，应使沉淀始终在液面以下，避免氧化亚铜暴露于空气中而被氧化。 ⑦当样品中的还原糖有双糖（如麦芽糖、乳糖）时，由于这些双糖的分子中仅有一个还原基，测定结果将偏低。 还原糖与碱性酒石酸铜的反应过程十分复杂，除上述反应外，还伴随有副反应。此外，不同的还原糖还原能力也不同，反应生成的Cu2O量也不相同。因此，不能根据生成的Cu2O量按反应式直接算出还原糖含量，而需利用经验检索表。 1.原理 样品脱脂后,用水或乙醇提取,提取液经澄清处理以除去蛋白质等杂质,再用6mol/l的盐酸在68~70℃下进行水解,使蔗糖转化为还原糖,在按还原糖的测定方法测定水解前后还原糖的差值乘以一个换算系数0.95即为蔗糖的含量。 乙醇作为提取剂 好处：可提取可溶性糖,也可使淀粉和蛋白质沉淀。 坏处：蔗糖微溶于乙醇溶液。 水解条件要严格控制，因为在此水解条件下，蔗糖可水解而其他糖类水解很少可忽略不计。 二、蔗糖的测定-以还原糖测定为基础 用转化糖标准溶液来标定费林试剂（可以减少误差） 精确称取2.36g炼乳，加少量水溶解转移至250ml容量瓶中，缓慢加澄清剂定容，静置分层。干滤，取滤液放入滴定管中，滴定费林试剂，消耗11.28ml，另取滤液50ml至250ml容量瓶中，加入5ml6mol/l的盐酸，摇匀，置68-70℃水浴锅中恒温水解15min，冷却，中和，定容至刻度，移入碱式滴定管。滴定费林试剂，消耗13.52ml；计算：炼乳中乳糖及蔗糖的含量。（10ml费林溶液相当于9.83mg的转化糖；相当于13.33mg的乳糖） 样品中乳糖含量：12.5% 样品中蔗糖含量：27.8% 例题讲解 三、总糖的测定 总糖:具有还原性的糖(葡萄糖、果糖、乳糖、麦芽糖等）或在测定条件下能水解成还原性单糖的碳水化合物总量。 营养学上是指能被人体消化、吸收利用的糖类物质的总和，包括淀粉。 食品分析中的总糖不包括淀粉，因为在测定条件下，淀粉的水解作用很微弱。 测定方法 以还原糖的测定和蔗糖的测定为基础。 通常有： 直接滴定法 蒽酮比色法 硫酸苯酚法 1、直接滴定法 总糖(以转化糖计,%)= 式中： F——10ml碱性酒石酸铜溶液相当的转化糖的质量，mg； V1——样品处理液总体积，ml； V2——测定时消耗样品水解液体积，ml； m——样品质量，g。 计算 2、蒽酮比色法 原理 单糖类遇浓硫酸时,脱水生成糠醛衍生物,后者可与蒽酮缩合成蓝绿色的化合物，在620nm处有最大吸收。当糖的量在20-200mg时，其呈色强度与溶液中糖的含量成正比。 注意： 1、该法是微量法,适合于含微量碳水化合物的样品,具有灵敏度高,试剂用量少的优点. 2、反应液中的硫酸浓度高达60%以上，在此高酸度条件下，在沸水浴中加热，可使双糖、淀粉等发生水解，再与蒽酮发生显色反应。因此测定结果是样液中单糖、双糖和淀粉的总量。 3、苯酚-硫酸法 原理：糖类物质与浓硫酸作用脱水，生成糠醛或糠醛衍生物，与苯酚溶液反应，生成黄至橙色化合物，在一定范围内，吸收值与糖含量呈线形关系。 特点：简单、快速、灵敏、重现性好，颜色持久，精确度可达到±2% 适用范围：适用于所有类型的糖，包括单糖的衍生物、低聚糖和多糖都能测定（低聚糖和多糖能够反应是因为它们在强酸和加热条件下进行水解时，释放出单糖所致）。 测定方法 1、葡萄糖标准曲线的绘制： 准确吸取0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00ml的0.1％的标准葡萄糖溶液→分别置于7个洁净的干燥具塞试管中→各加水补至1.00ml→加5％苯酚1.6mL→摇匀→迅速滴加浓硫酸7.5mL→放入冷水中5min→摇匀30s→沸水浴15min→取出冷水浴5min→490nm处测OD值。 2、样液的测定 吸取1.00mL的样液按照标准曲线绘制的方法测出OD值。减去空白对照的OD值后，糖的含量可通过标准曲线来确定。