地铁施工动画
2011-09-02 8页 ppt 1MB 96阅读
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分析和WX,活性+Y6@活性测定分析的启动子表达的定量分析方法$并讨论该方法在环境可...
书遗!传!"#"$%&’(!)*+,+-."!"!#"#"$!%#$!&&’ 技术与方法
收稿日期!&&$ &! !&"修回日期!&&$ &( !)
基金项目!云南省自然科学基金资助!编号#!&&!*&&(!+"%,-../0123456-778790/:;7<;8=>/-7381;/7/?@81-08=,<;27<2A!@/B!&&!*&&(!+"&
作者简介!萧凤回!#%’&’"$男$浙江苍南人$教授$在职博士生$研究方向#植物分子育种(CDE8;=#?FG;8/"E8;=B578-B23-B<7
通讯作者!翟虎渠!#%$&’"$男$教授)博士生导师$研究方向#作物遗传育种(CDE8;=#FHIF8;"<88AB<7
张红生!#%’!’"$男$教授$博士生导师$研究方向#作物遗传育种(CDE8;=#FAIF87J"7K8-B23-B<7
快速检测干旱和脱水可诱导植物启动子
瞬间达特性的方法
萧凤回#!!段承俐!!翟虎渠#!L!薛刚平(!张红生#
!#B南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室$南京!#&&%$*
!B云南农业大学中药材研究所$云南省中药材规范化技术指导中心$云南省生物技术创新人才
培养基地$云南 昆明’$&!&#*LB中国农业科学院$北京#&&&%(*(B*,MNO9=871M73-A105$P=3B(&’"$Q-A108=;8"
摘!要!选择合适的诱导表达启动子是开展植物耐干旱和脱水等非生物逆境转基因研究的重要环节(我们通过几
年的研究$已建立了一套以大麦幼苗完整活体和植物离体叶片为主要材料通过瞬间表达鉴定来快速检测干旱和脱
水可诱导基因启动子表达特性的方法(来自大麦和水稻的启动子RF7(A)RF7"A)STQ#A)N84#’UK)VA;#"K在大麦)小
麦)水稻)高粱和蕨类植物的离体叶片中经干燥诱导可以瞬间表达 W>9$在绿豆)番茄叶片中不表达(鉴定了
STQ#A和VA;#"K在大麦不同器官或组织中启动子的定性表达情况(进一步建立了W>9荧光点+WX,染色点计数
分析和WX,活性+Y6@活性测定分析的启动子表达的定量分析方法$并讨论该方法在环境可诱导植物启动子功能
分析中的应用价值和前景(
关键词!植物启动子*干旱*脱水*瞬间表达*检测
中图分类号!PLL!!!文献标识码!Q!!! 文章编号!&!$LZ%))!!&&’"&#Z&&"$Z&)
!"#$%&’(’)*$+"($,+,-.)"+/$’+(01#)’//$,+23")"4(’)$/($4/,-
&),563(7"+%&’38%)"($,+79+%54$:;’<),*,(’)/-),*<;"+(/
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>’8?,)%/#.=871.0/E/120*30/-JF1*32F53081;/7*1087A;2712G.02AA;/7$3212<1;7J
!!干旱)高盐和低温胁迫引起的脱水是影响农作
物生长和产量的最重要环境限制因子之一%#!L&(提
高作物对干旱和脱水胁迫的耐性是植物育种家长期
追求的目标$但利用传统的育种方法和物种内的现
有遗传基因来改良作物的耐脱水能力仍十分困难(
采用转基因技术为改良作物的耐脱水性提供了新的
途径(通过外源基因的导入和表达$可提高转基因
拟南芥)水稻)烟草和玉米等对干旱和高盐的耐
性%!!"&(为避免非特异性启动子所启动的导入基因
持续表达带来的不利影响$检测和评价干旱和脱水
可诱导基因启动子的可诱导性)表达强度及时间动
态等功能$选择合适的特异性启动子是开展耐干旱
脱水转基因研究的重要环节%$$’&(我们通过几年的
技术方法研究$已建立了一套以大麦幼苗完整活体
和离体植物叶片为主要材料通过瞬间表达检测等方
法来检测脱水可诱导基因启动子功能的方法体系(
实践证明该方法快速)准确)可操作性强(
#!材料和方法
@A@!实验材料
#B#B#!实验植物
用于启动子功能检测的瞬间表达转化体主要为
大麦品种]8=/7!!/EC4.19*[B<:B"幼苗$辅助的
植物材料还有小麦)水稻)高粱)绿豆)番茄和肾蕨
!0*C4121[B"等植物的叶片)大麦的
种子)叶片)花穗和愈伤组织等(
#B#B!!表达质粒载体
表达质粒载体分别携带有绿色荧光蛋白
!W>9")#D葡萄糖苷酶!WX,"和木聚糖酶!Y6@"L种
基因和不同表达特性的启动子$详见表#(表
达载体构建见文献%&和%#&&(
表@!表达质粒携带的报告基因和启动子及特性
.":;’@!01#)’//$,+#;"/*$%/#)’#,)(’)6’+’/"+%#),*,(’)/?$(3%$--’)’+(#),#’)($’/
质粒载体
9=8AE;3A
启动子
90/E/120A
启动子来源和特性
,/-0<2A873.0/.201;2A/?.0/E/120A
报告基因
N2./0120A
参考文献
N2?2027<2A
.RF7(AW>9W RF7(A 来自大麦$诱导表达>0/E480=25$;73-<;4=2 W>9 %#&&
.RF7"AW>9W RF7"A 来自大麦$固定表达>0/E480=25$9 %#&&
.STQ#AW>9W STQ#A 来自大麦$诱导表达>0/E480=25$;73-<;4=2 W>9 %#&&
.N84#’UKW>9W N84#’UK 来自水稻$诱导表达>0/E0;<2$;73-<;4=2 W>9 %#&&
.^ A;#"KW>9W VA;#"K 来自水稻$诱导表达>0/E0;<2$;73-<;4=2 W>9 %#&&
.STQ#AWX,N STQ#A 来自大麦$诱导表达>0/E480=25$;73-<;4=2 WX, %#&&
.QQM#WX,N Q<1# 来自水稻$固定表达>0/E0;<2$*/7A1;1-1;:2 WX, %&
.QQM#Y6@N Q<1# 来自水稻$固定表达>0/E0;<2$*/7A1;1-1;:2 Y6@ %&
#B#BL!实验仪器
主要仪器包括#基因枪及配套仪器!>;720"%##&*
绿色荧光蛋白体视显微镜![2;<8+\’"及配套设
备*质粒R@Q制备等仪器*自制的大麦幼苗培养架$
见图#Q(
#B#B(!主要试剂
质粒R@Q制备采用P;8J279=8AE;3+;3;_;3试剂
盒!P;8J27公司"*基因枪介导的金粉!U;/=;A1;<$ +;D
<0/7J/=3"由美国U;/N83实验室生产$直径#%E(
@AB!实验方法
#B!B#!植物幼苗培养
本实验瞬间表达的主要材料为(日龄大麦幼
苗$要求无菌!防止WX,污染")苗和根较直)黄苗(
根据每次实验幼苗需要量$取!&!L&J大麦种子放
入L&&E[无菌三角瓶中$加!$&E[#B&‘次氯酸
钠无菌水$搅拌杀菌!&E;7后$用无菌水漂洗$次(
!" 遗!传!"#"$%&’( !)*+,+-."!&&’!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!
种子在无菌条件下$逐粒按种胚端朝下方向插入到
幼苗培养架的种子插孔中(幼苗培养架在插入种子
之前$先覆盖二层已消毒的滤纸$并用无菌水湿润以
便种子插入时容易穿透(滤纸长度必须足以覆盖幼
苗培养架后两端下折接触到架的基部(培养架移到
塑料盒内$加灭菌水至#9报告基因(
基因枪转化受体大麦幼苗的准备#选择’!#&
株(3龄大麦幼苗$剔除种皮和胚乳$胚一侧朝下$
并排放入直径$9荧光点是
否产生)出现的时间)数量的变化等来了解启动子的
表达特性(
#"!#期!!!!!!!!!萧凤回等#快速检测干旱和脱水可诱导植物启动子瞬间表达特性的方法
WX,染色#按d2?20A/7!#%")"%#!&方法染色$在
显微镜下观察计数染色点(
W>9荧光点+WX,染色点计数定量分析STQ#A
启动子表达活性#.STQ#AW>9W和.QQM#WX,N质
粒R@Q按一定比例混合$二者的R@Q总浓度为#B&
%J+%[(如果二者R@Q浓度达不到#B&%J+%[水平$
则附加其他非瞬间表达的质粒R@Q把浓度调节到
该水平(用混合好的质粒R@Q通过基因枪转化大
麦幼苗后$马上分别进行自然干燥)QUQ和纯水保
湿!空白对照"等启动子表达的诱导处理$!&!!(F
后$在绿色荧光蛋白显微下观察和计数W>9荧光
点$然后进行WX,染色$进而在可见光下显微观察
并计数WX,染色点$最后获得转化幼苗显现的W>9
荧光点和WX,染色点!图!"数比值(该比值代表
STQ#启动子瞬间表达活性强度
图B!EC<荧光点$EFG染色点计数定量分析被转化的
大麦幼苗在自然干燥和=D=诱导后HI=@/
启动子瞬间表达水平的差异
C$6AB!EC<-,4$$EFG-,4$J5"+($("($K’"//"8-,)()"+/$’+(
’1#)’//$,+;’K’;/,-#),*,(’)HI=@/$+()"+/-,)*’%
:");’8/’’%;$+6/"-(’)%)8$+6"+%=D=()’"(*’+(
WX,活性+Y6@活性测定定量分析S:8#A启动
子表达活性#用WX,报告基因取代W>9报告基因
构建.STQ#AWX,N质粒$Y6@基因取代WX,报告
基因构建.QQM#Y6@N质粒作为对照$二者混合或附
加其他非瞬间表达的质粒R@Q$通过基因枪轰击转
化大麦幼苗$经过前已述及的L种处理后在Z!&a
保存$供以后WX,和Y6@酶活性测定(另外$用不
含WX,和Y6@报告基因的质粒.,9)!基因枪转化
大麦幼苗$作为酶活性测定的本底对照材料(WX,
酶活性和Y6@酶活性比值则代表S:8#启动子瞬间
表达活性强度(
WX,和Y6@酶活性测定#处理!(F后的幼苗
用!倍体积的提取缓冲液!$EE/=+[磷酸钠缓冲
液!.S)B("$$EE/=+[CR]Q$#EE/=+[R]]"研磨
匀浆$取 上 清 液 按 d2?20A/7!#%")"%#!&和 9812=
!&&&"%&方法光测定WX,酶活性和Y6@酶活性(
!!结果与分析
BA@!启动子表达的定性检测
!B#B#!启动子在不同物种叶片的表达
!!选用大麦)小麦)水稻)高粱)绿豆)番茄和肾蕨
植物的离体叶片作为瞬间表达转化体$观察了启动
子启动的报告基因在不同物种中的定性表达情况(
来自大麦和水稻的启动子 RF7(A)RF7"A)STQ#A)
N84#’UK)VA;#"K在上述禾谷类和蕨类植物叶片中能
在干燥条件诱导下定性表达产生W>9$但在绿豆和
番茄中不能表达$结果见表!及图L(来自禾谷类的
启动子能在蕨类植物中表达值得注意(通过单一的
W>9报告基因可以定性地检测启动子在不同植物
中的物种表达特异性(
!B#B!!启动子在大麦不同器官和组织中的表达
选用含STQ#K和VA;#"K启动子的表达质粒转
化大麦不同器官和组织$检测瞬间表达是否具有组
织特异性(除成熟种子的胚乳和颖果皮外$其他器
官或组织在具备诱导因素如QUQ或干燥条件下$都
检测到W>9的表达$没有明显的组织特异性!表L$
图L和图("(
由于幼苗材料易于制备)转化和处理$容易观
察$并且属于非离体的完整植株$所以是启动子瞬间
表达定性和定量快速分析的最佳材料(从!!%3
龄幼苗转化后都可以高效表达报告基因$但以(!$
3龄的幼苗体积更便于操作(营养和生殖生长期植
株的叶片也是良好的材料$但要预先分期播种和温
室盆栽$所需时间长)成本高(
BAB!启动子表达的定量检测
!B!B#!启动子表达活性的定量分析
分别以 W>9和 WX,的编码区为报告基因与
RF7(A等$个启动子分别融合$构建了"个瞬间表
达质粒!表#"(以Q<1#为固定表达启动子)W>9和
WX,编码区为报告基因的瞬间表达质粒!表#"为对
照$建立了定量分析方法(以S:8#A启动子为例说
明二种分析方法(
!#"W>9荧光点+WX,染色点计数定量分析
检测对象为.STQ#AW>9W瞬间表达质粒$含
STQ#A诱导型启动子和W>9报告基因(内对照为
"" 遗!传!"#"$%&’( !)*+,+-."!&&’!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!
表B!不同启动子在不同物种叶片中启动EC<表达
.":;’B!.3’E9表达W9>2G.02AA;/7-7320305207
RF7(A eee#" ee eee eeee Z Z ee
RF7"A eeee eee eee eeee Z Z eee
STQ#A eee ee eee eee Z Z ee
N84#’UK e ee e e Z Z e
VA;#"K ee ee ee ee Z Z ee
!!#"#表示转化叶片中出现W>9$e 越多$W>9荧光点越多*Z 表示不出现W>9(用于基因枪转化的表达载体R@Q量为每次轰击#%J(
#"#;73;<812A1F2.02A27<2/?W>9;71F21087A?/0E23=28:2AB]F2E/02e$1F2E/02W>9?=-/02A<271?/<;BZ;73;<812A7/W>9BCG.02AA;/7
.=8AE;3R@QV8A#%J.204/E4803E271?/0.801;<=2;7?=/VJ-71087A?/0E81;/7B
图L!不同物种叶片中表达EC<的荧光显微照片
8#RF7(A启动子在高粱叶片中表达*4#STQ#A启动子在
大麦叶片中表达*<#VA;#"K在蕨类叶片中的表达(
C$6AL!E92G.02AA;/730;:2745RF7(A;7A/0JF-E
=28?$30;:2745STQ#A;7480=2587345VA;#"K;7?20702A.2<1;:2=5B
图M!EC<和EFG在同一大麦幼苗中表达
8#在荧光显微镜下的W>9荧光点*4#在光学显微镜下的WX,染色点(
C$6AM!EC<"+%EFG’1#)’//’%$+(3’/"*’:");’8/’’%;$+6
8#W>9?/<;/4A20:23-7320?=-/02A<271E;<0/A9基因的启动子STQ#A是诱导型启动
子$W>9荧光点的多少既反映大麦幼苗个体被基因
枪转化的程度也反映STQ#A启动子被诱导的程度(
不同大麦幼苗在转化时被转化的程度存在处理间和
个体间的误差$仅仅用W>9荧光点数的绝对值$不
能客观说明启动子的表达强度和活性(因此$用
W>9荧光点+WX,染色点的比值作为单位转化细胞
中的W>9表达量$使处理间和个体间具有可比性(
图!采用W>9荧光点+WX,染色点计数法定量
分析STQ#A启动子在自然干燥)QUQ和纯水保湿L
种处理下的表达活性的差异(图中方柱表示平均数
f误!(苗(次重复"$QUQ和自然干燥诱导表
达的活性明显$纯水对照未检测到表达(W>9荧光点
+WX,染色点计数法的优点是比较直观$程序较简单*
缺点是绿色荧光蛋白显微配套设备比较昂贵$WX,染
色点容易扩散重叠!图L"$造成计数的误差(
!!!"WX,活性+Y6@活性测定定量分析
为克服W>9荧光点+WX,染色点计数定量分析
的缺点$进一步建立了WX,活性+Y6@活性测定定量
分析方法(图$采用WX,活性+Y6@活性测定定量
分析STQ#A启动子在自然干燥)QUQ和纯水保湿L种
处理下的表达活性!干燥处理L&苗$次重复$其他处
$"!#期!!!!!!!!!萧凤回等#快速检测干旱和脱水可诱导植物启动子瞬间表达特性的方法
表L!启动子在大麦不同器官和组织中表达的鉴定
.":;’L!9%’+($-$4"($,+,-(3’#),*,(’)’1#)’//$,+$+%$--’)’+(,)6"+/"+%($//5’/,-:");’8
启动子
90/E/120A
在QUQ或干燥处理下的W>9表达W>92G.02AA;/71F0/-JFQUQ/030510281E271
愈伤组织
*8=-A
种皮
,2234087
9出现与否(愈伤组织通过大麦幼胚离体组织培养诱导产生(用于基因枪
转化的表达载体R@Q量为每次轰击&B!!#%J(
@/12#]F202A-=1A8028A-EE805/?1F22G.20;E271A813;?20271A18J2ABe873Z;73;<812A1F2.02A27<2/084A27<2/?W>9;71F21087A?/0E23
1;AA-2A$02A.2<1;:2=5B*8=;V202;73-<23?0/E5/-7J2E405/A/?480=251F0/-JF1;AA-2<-=1-02BCG.02AA;/7.=8AE;3R@Q-A23V8A&B!!#%J.20
4/E4803E271?/0.801;<=2;7?=/VJ-71087A?/0E81;/7B
理#"苗L次重复"$纯水对照比值为&(该方法用
荧光分光度计测定$不能用肉眼直接观察$可减少主
观误差(
从图!和图$可看出$两种方法测定的启动子
瞬间表达活性强度基本一致$但后者误差更小(因
此$WX,活性+Y6@活性测定定量分析方法更实用(
图N!EFG活性$OPQ活性测定定量分析被
转化的大麦幼苗在自然干燥和=D=诱导后
HI=@/启动子瞬间表达水平的差异
C$6AN!EFG"4($K$(8$OPQ"4($K$(8J5"+($("($K’
"//"8-,)()"+/$’+(’1#)’//$,+;’K’;/,-#),*,(’)
HK"@/$+()"+/-,)*’%:");’8/’’%;$+6/"-(’)
%)8$+6"+%=D=()’"(*’+(
!B!B!!表达质粒R@Q浓度与表达强度
瞬间表达质粒在大麦幼苗中表达水平不但与外
界诱导因子有关$而且与基因枪转化导入的表达质
粒本身 R@Q浓度有关(为明确表达质粒的合适
R@Q浓度$我们设定了不同的质粒R@Q浓度梯度$
用W>9荧光点+WX,染色点计数定量分析法研究了
质粒R@Q浓度与表达强度的关系$结果见图’(如
果每基因枪的表达质粒R@Q导入量大于$&7J$质
粒启动子STQ#A和VA;#"K表达水平可达到#B&的
比值以上$导入量大于!&&7J$在#B$!!B&上下(
因此$表达质粒R@Q浓度因控制在每基因枪$&!
!&&7J导入量$过大的导入量$表达量过大$会导致
计数或检测的困难和误差(
图R!表达质粒&Q=浓度与表达强度的关系
基因枪转化的幼苗经过QUQ诱导处理后进行
W>9荧光点+WX,染色点计数定量分析(
C$6AR!!’;"($,+:’(?’’+(3’4,+4’+()"($,+,-’1#)’//$,+
#;"/*$%&Q=:,*:")%’%"+%(3’’1#)’//$,+/()’+6(3
W>9+WX,?/<;V8A工程
必不可少的遗传元件(
目前已商品化的转基因植物利用的启动子基本上属
于固定表达的组成型启动子$如 *8+TL$,)Q<1#)
X4;D#等(本研究建立的启动子表达特性快速检测
方法的优点#首先是快速省材$以前我们曾用愈伤组
织作为表达转化体$获得适合转化的愈伤组织材料
需要)V时间*用大麦幼苗为材料$可在#V内完成
启动子的定性和定量分析(第二是定量分析结果有
%$ 遗!传!"#"$%&’( !)*+,+-."!&&’!!!!!!!!!!!!!!!!!"卷!
可比性$能客观反映不同启动子在相同条件下或同
一启动子在不同诱导条件下表达活性强度的差异$
从而准确评价启动子的特性(第三是用植物真实的
器官活体(因此$有多方面的应用价值(
LA@!鉴定启动子固定表达或诱导表达的特异性
以前的报道认为大麦RF7"属于干旱和低温诱
导的启动子%#L!#$&$Y;8/等%#&&通过定量分析方法比
较了RF7(A)RF7"A)STQ#A)N84#’UK)VA;#"K启动子
在不同诱导条件下的瞬间表达活性强度$发现
RF7"A属于固定表达的组成型启动子$并且表达活
性强度比Q<1#高(
LAB!研究启动子结构元件与功能的关系
启动子的功能与其结构密切相关$通过对启动
子内部结构元件的缺失)重复等改造突变$然后定性
和定量分析野生型启动子和突变启动子的瞬间表达
的差异$可以了解启动子结构与功能的关系(Y;8/
等%#&&定量分析VA;#"K启动子发现其可被QUQ诱导
表达$但其同源启动子VA;#"对QUQ诱导不敏感(
序列比较发现二者的QUQ应答复合体的 *CL和
QUNC元件基序的序列有差异(对VA;#"K的QUNC
序列进行突变$经WX,活性+Y6@活性测定定量分
析比较$发现突变后 QUQ 表达活性降低 ( 倍(
Y-2%#’&对STQ#A启动子]Q]Q盒及其上游序列进行
缺失突变$经表达活性定量分析$确定其反式作用元
件在Z(&&!ZL&&位置(
LAL!研究启动子与诱导因子的关系
可诱导启动子表达的因子有干旱)低温)高盐)
低渗)植物激素等(通过对转化大麦幼苗或叶片的
诱导处理及瞬间表达定性和定量分析$可以了解启
动子对诱导因子的反应特性以及适合的诱导因子处
理水平(此外$以大麦幼苗为瞬间表达的受体$通过
基因枪转化并诱导W>9表达$检测启动子表达时间
的早晚和表达水平$建立其表达的时间曲线$可以了
解不同启动子对环境诱导应答的敏感性和表达时间
动态(我们目前已建立了(个干旱可诱导启动子表
达的时间曲线(
LAM!鉴定启动子在不同植物上表达的特异性和广
谱性
!!选择不同植物成熟叶片为瞬间表达的受体$通
过基因枪转化并诱导W>9表达和检测$可了解启动
子的表达广谱性和特异性及适合的物种$为具体植
物的基因工程制订提供依据(本研究中$大麦
和水稻的干旱可诱导启动子在耐旱作物高粱叶片上
表达量高于大麦$在绿豆和番茄叶片不表达$但在更
低级的蕨类叶片可以表达(
参 考 文 献%!’-’)’+4’/&!
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