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·研究原著 · 文章编号 : 100022790 (2006) 0320261203
胆总管结石的成因观察
陈晓文 1 ,智发朝 2 ,曹东林 3 ,周思朗 1 ,陈勇伟 1 ,谢 栋 1 (1 解放军第 421医院消化内科 ,广东 广州 510310,南方医科大
学 : 2 南方医院消化内科研究所 ,广东 广州 510515, 3 生物化学教研室 ,广东 广州 510315)
收稿日期 : 2004212214; 接受日期 : 2005211202
作者简介 :陈晓文. 硕士 ,主治医师. Tel: ( 020) 61636381 Email: xiao2
wench@ sina. com
Exper im en ta l stud ies on causes of
ca lculus forma tion in comm on b ile duct
CHEN X iao2W en1 , ZH I Fa2Chao2 , CAO D ong2L in3 , ZHOU S i2
Lang1 , CHEN Yong2W ei1 , X IE D ong1
1Department of Gastroenterology, PLA 421 Hosp ital, Guangzhou
510310, China, 2Department of Gastroenterology, Nanfan Hosp i2
tal, Guangzhou 510515, China, 3Department of B iochem istry,
Southern Medical University, Guangzhou 510315, China
【Abstract】A IM : To observe the roles of bacterial infections,
gastrointestinal hormones and bile biochem ical factors during cal2
culus formation in the common bile duct. M ETHOD S: In this
study, 72 patients were divided into 2 group s: CBDS group ( 56
patients with common bile duct stone) and NCBDS group ( 16
patients with obstruction of common bile duct but without CBDS).
B ile asp irated by ERCP from all the patients was cultured aerobi2
cally and the contents of TBA, Ca2 + , P2 + and CHO in the bile
were detected. Stones of 11 patients asp irated by ERCP were
inspected for E. coli by PCR. The serum motilin (MTL ) and the
somatostatin ( SS) were measured by radioimmunoassay in 52
patients. RESUL TS: 53 patients (95% ) of CBDS group and 8
patients (50% ) of NCBDS group were positive in biliary germ i2
cultures. Infection rate in CBDS group was significantly higher
than that in NCBDS group ( P < 0. 05 ). Three ( 27% ) of 11
patients who had a PCR exam ination had positive results. The
serum motilin level of the patients in CBDS group was significantly
lower compared with that of the patients in NCBDS group (202 ±
151 vs 315 ±161) ng/L, while the serum somatostatin and bile
Ca2 + level of CBDS group were significantly higher than those of
NCBDS group [ (15 ±5 vs 12 ±3) ng/L, (1. 4 ±0. 9 vs 0. 7 ±
0. 3) mmol/L, P < 0. 05 ]. TBA level of CBDS group was signifi2
cantly lower than that of NCBDS group [ ( 12 ±6 vs 16 ±7 )
nmol/L , P < 0. 05 ]CO NCL US IO N: The changes of biochem ical
characteristics in the bile, the disorders of modulating action of
gastrointestinal hormones and the bacterial infections may be the
risk factors of common bile duct stones.
【Keywords】common bile duct calculi; bacteria; motilin; soma2
tostatin; bile; biochem istry
【摘 要 】目的 :探讨细菌感染、胃肠激素及胆汁生化在胆总
管结石形成中的作用 . 方法 :实验分为胆总管结石 (CBDS)组
( n = 56)、非结石胆总管梗阻 (NCBDS)对照组 ( n = 16). ①内
窥镜下逆行胰胆管造影术 ( ERCP)中抽取胆汁作需氧菌培养
及进行总胆汁酸 ( TBA) , Ca2 + , P2 +和胆固醇 (CHO)测定. ②
ERCP术中取结石用 PCR法行结石大肠杆菌检测. ③采静脉
血行胃动素及生长抑素检测. 结果 : ① CBDS组 56例胆汁标
本需氧菌培养中 ,有 53例检出细菌 (95% ) , NCBDS组 16例
胆汁标本中 ,有 8例检出细菌 (50% ) ,两组细菌检出率比较有
统计学意义 ( P < 0. 05). 用 PCR方法对 11例 CBDS患者结石
进行大肠杆菌 DNA 片段检测 , 3 例出现阳性 ( 27% ). ②
CBDS组血浆胃动素水平较 NCBDS组明显偏低 ( 202 ±151 vs
315 ±161) ng/L,而生长抑素则明显升高 ( 15 ±5 vs 12 ±3)
ng/L,组间比较差异显著 ( P < 0. 05). ③ CBDS组胆汁中 Ca2 +
显著高于 NCBDS组 [ (1. 4 ±0. 9 vs 0. 7 ±0. 3) mmol/L, P <
0. 05 ] , TBA 则显著低于 NCBDS组 [ ( 12 ±6 vs 16 ±7 )
nmol/L , P < 0. 05 ]. 结论 :胆汁理化性质改变、胆道感染及胃
肠激素紊乱在胆管结石形成中可能具有重要作用.
【关键词 】胆总管结石 ;细菌 ;胃动素 ;生长抑素 ;胆汁 ;生化
【中图号 】R575. 62 【文献标识码 】A
0 引言
近年来 ,胆道细菌感染在棕色结石形成中的作用
成为人们关注的焦点之一. Steward等 [ 1 ]运用扫描电
镜首次证实棕色结石中存在细菌 , Tabata等 [ 2 ]检测发
现 100%胆总管棕色结石中可检出细菌 ,提示细菌在
胆总管结石 ( common bile duct stone, CBDS)形成中
扮演重要作用 ;也有学者认为 ,胆结石形成可能与胆
道动力异常和胆汁淤滞有关 ;近年来研究表明 ,改变
胆汁酸组成和酸碱度可影响胆汁中胆红素及钙离子
浓度 ,二者浓度过高 ,在胆汁中不能充分溶解 ,可促进
胆汁核化和结石形成. 我们对胆总管结石患者菌群、
激素水平及胆汁生化进行观察 ,以探讨其在胆总管结
石形成中的作用.
1 材料和方法
1. 1 材料 ①仪器设备 : BECKMAN DU600型核酸
蛋白质
仪 ,美国 Beckman Coulter公司 ; JM 2250型
电泳仪 ,大连捷迈科贸有限公司 ; Model 60全自动微
生物鉴定仪 ,特康科技有限公司 ; O lympus AU800型
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全自动生化分析仪 ,日本 O lympus公司 ; SN2682型放
射免疫γ计数器 ,上海核福光仪器有限公司 ; PERKIN
ELMER 480型 DNA扩增仪 ,美国 PERKIN2ELMER公
司 ; SANYO MDF2U50V超低温冰箱 ,日本 SANYO公
司 ; UV I Tec凝胶成像系统 ,英国 UV I Tec公司 ; TGL2
16G台式高速冷冻离心机 ,上海安亭科学仪器厂 ;电
热恒温培养箱 ,广州医疗设备厂. ②试剂 : DNA Mak2
er,大连宝生物技术有限公司 ; dNTP,上海生物工程技
术服务有限公司 ; Taq DNA聚合酶 ,河南华美生物工
程公司 ;胆汁酸 2HR W ako,日本和光纯药工业株式会
社 ;生长抑素及胃动素放射免疫检测试剂盒 ,解放军
总医院科技开发中心放免所 ;细菌基因组 DNA提取
试剂盒 ,北京赛百盛公司.
1. 2 对象 实验组 : 2002年南方医院就诊 CBDS (同
时需排除胆囊结石或肝内胆管结石 )患者 56 (男 29,
女 27)例 ,年龄 22~82 (平均 57 ±15)岁. 所有患者
均通过腹部 B超、CT或 MR I检查 ,最后经内窥镜下
逆行胰胆管造影术 ( endoscop ic retrograde choledocho2
pancreatography, ERCP)证实. 近期均未服用影响胃
肠道动力的药物. 对照组 : 2002年南方医院就诊非结
石胆总管梗阻 ( not common bile duct stone, NCBDS)
患者 16 (男 7,女 9)例 ,年龄 25~86 (平均 55 ±15)
岁. 所有患者均通过腹部 B超、CT或 MR I检查证实
胆总管扩张 , ERCP证实胆总管内无结石. 近期均未
服用影响胃肠道动力的药物. 两组性别年龄比较差
异无统计学意义.
1. 3 方法
1. 3. 1 需氧菌培养 患者行 ERCP检查 ,注射造影
剂前应用无菌导管入胆道 ,抽吸胆汁 2 mL,并接种在
血平板上 , 37℃恒温箱中进行常规培养 , 48 h观察结
果 ,用 Model 60型全自动微生物鉴定仪进行鉴定.
1. 3. 2 大肠杆菌 DNA检测 ERCP下取胆石标本
( n = 11) ,用无菌生理盐水冲洗三次 ,放入无菌试管
中置于 - 20℃冰箱中备用. 参照 Dong等 [ 3 ]方法 ,采
用 PCR扩增大肠杆菌 DNA片段. PCR体系如下 :常
规配制含 DNA
1. 5 μL,引物序列参照 Dong
等 [ 3 ]报道 ,由上海生物工程技术服务有限公司合成 ,
上游引物 : 5′2TCTCTATGTGCATACGGAG23′,下游引
物 : 5′2CCATACTGATTGCCGCAA23′. PCR循环条件 :
94℃ 3 m in, 94℃ 60 s, 65℃ 30 s, 72℃ 45 s, 35个循
环后 72℃延伸 5 m in. 用 20 g/L琼脂糖凝胶电泳检
查 PCR产物 ,扩增片段长度为 320 bp.
1. 3. 3 胆汁胃动素和生长抑素的放射免疫检测 用
预冷的注射器抽取患者 (由于部分患者不配合 ,实际
参与实验人数 CBDS组 n = 41, NCBDS组 n = 12)空
腹静脉血 2 mL,置于含 30μL ( 2 ×103 万 U /L )抑肽
酶的预冷试管中 , 4℃低温离心 15 m in (4000 r/m in) ,
取血浆分装于 2个 Eppendorf管内 ,每管约 0. 5 mL,
编号后冻存于 - 78℃低温冰箱保存待测. 检测方法
参照试剂盒
进行.
1. 3. 4 胆汁生化检测指标 ERCP术中 ,注射造影
剂前抽吸胆汁 5 mL,离心 5 m in (4000 r/m in) ,取上
清 ,用 O lympus AU 800全自动生化分析仪对胆汁中
总胆汁酸 ( total bile acid, TBA ) , Ca2 + , P2 + ,胆固醇
( cholesterol, CHO )进行检测 ,其中 Ca2 +用 MXB法 ,
TBA用酶比色法 , P2 +用钼酸直接法 , CHO用酶法.
统计学处理 : 细菌结果用统计软件 SPSS 11. 0
对数据进行卡方检验. 胃肠激素检测数据采用 x ±s
表示 ,作方差分析. 胆汁生化指标用 x ±s表示 ,用两
样本均数 t检验进行统计分析.
2 结果
2. 1 胆汁需氧菌培养及菌种分析
2. 1. 1 两组患者胆汁细菌培养 CBDS 56例胆汁标
本需氧菌培养 53例检出细菌 ,检出率为 95% , 15例
检出 2种细菌 ,共获 68株细菌. 其中革兰氏阴性杆
菌 50株 ,占 74% ;革兰氏阳性球菌 17株 ,占 25% ;霉
菌 1株 ,占 1%. NCBDS 16例有 8例检出细菌 ,检出
率为 50% ,其中 3例检出 2种细菌 ,共获 11株细菌.
埃希氏菌属、克雷伯氏菌属、肠杆菌属和肠球菌属为
胆道主要致病菌.
2. 1. 2 结石中大肠杆菌 DNA检测 用 PCR法分析
11例 CBDS患者结石 ,其中 3例扩增出大肠杆菌基因
片段 ,与标准大肠杆菌菌株 DNA阳性对照带位置相
同 ,形态一致. 其余 8例无条带出现 ,扩增结果阴性 ,
未发现大肠杆菌 DNA片段存在 ,重复三次 ,结果一致
(图 1).
M: DNA Marker; 1, 2, 3:均为胆总管结石标本 ; 4:阳性对照.
图 1 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR扩增产物
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2. 2 两组血浆胃动素及生长抑素检测 CBDS组血
浆胃动素水平较 NCBDS组明显偏低 ( 202 ±151 vs
315 ±161) ng/L ,而生长抑素水平较 NCBDS组明显
升高 ( 15 ±5 vs 12 ±3 ) ng/L,有统计学意义 ( P <
0. 05).
2. 3 两组胆汁生化测定 CBDS组胆汁中 Ca2 +水平
较 NCBDS组明显增高 ( P < 0. 05) , TBA较 NCBDS组
明显降低 ( P < 0. 05) ,两组间比较有统计学意义 ( P <
0. 05) , P2 +和 CHO则无显著性差异 (表 1).
表 1 两组患者胆汁生化测定结果 ( x ±s)
组别 n
钙离子
(mmol/L)
总胆汁酸
( nmol/L)
胆固醇
(mmol/L)
磷离子
(mmol/L)
胆总管结石 41 1. 4 ±0. 9a 12 ±6a 1. 4 ±1. 1 0. 3 ±0. 2
非结石胆总
管梗阻
12 0. 7 ±0. 3 16 ±7 1. 2 ±0. 6 0. 3 ±0. 3
a P < 0. 05 vs非结石胆总管梗阻组.
3 讨论
正常情况下胆总管内无细菌生长 ,据文献 [ 4 ]报
道 ,在并发胆道感染时胆汁中可培养出一种或多种致
病菌株 ,这些致病菌几乎都来自肠道 ,多为条件致病
菌. 内镜下经导管抽吸胆汁进行细菌检测 ,国内已有
较多报道 ,但有学者对其结果的可靠性提出异议. 本
实验 56例 CBDS胆汁标本细菌检出结果与国内报道
类似 [ 5 ] . 本实验中 ,同样在胆道梗阻情况下 ,两组患
者胆汁细菌培养阳性率差异显著 ,而混合感染率比较
无统计学意义 ,提示胆道梗阻是合并感染、特别是混
合感染的一个诱发因素 ,而不是唯一原因. 同时这些
结果也表明 CBDS患者较其它原因引起的胆道梗阻
更易出现感染 ,间接提示胆道长期细菌感染可能与结
石形成有关.
据报道 ,棕色结石细菌检出率可达 90%以上 ,但
取棕色结石作细菌培养 ,通常得不到细菌存在的直接
证据 , PCR技术可大大提高结石中细菌的检出率. 本
组 11例患者结石中 , 3例发现存在大肠杆菌 DNA片
段. 提示 PCR技术可提高胆石中细菌感染检测的敏
感性.
有学者用电镜和 PCR方法证实 ,胆汁或结石不
同层面可出现不同细菌或菌株 ,说明细菌在结石形过
程中扮演一定角色 ,有可能在结石形成前已有细菌感
染 ,其机制可能是与细菌产生β2葡萄糖醛酸酶及磷
酯酶有关. 细菌感染还可使胆管上皮细胞分泌紊乱 ,
引起急慢性胆管炎、胆管运动功能障碍、胆汁瘀积、沉
淀形成. 细菌代谢产物如聚多糖及黏蛋白可使细菌
间相互黏附在一起 ,形成菌膜 ( biofilm ) ,对于棕色结
石起凝聚和支架作用 ,成为结石核心. 胆道感染易造
成胆道梗阻 ,而胆道梗阻又加重胆道感染 ,如此形成
恶性循环 ,加快结石形成.
本实验结果显示 , CBDS组血浆胃动素水平较
NCBDS明显偏低 ,而生长抑素水平较 NCBDS明显升
高 ,提示胃肠激素紊乱与胆道结石形成有关. 动物实
验研究表明 ,豚鼠体内胃肠激素在胆汁淤滞尚未发生
之前已发生改变 ,提示胃肠激素的改变可能是导致胆
汁代谢障碍的影响因素之一 ; CBDS组胆汁中 TBA较
NCBDS组明显降低 ,胆汁 Ca2 +浓度明显增高. 胆汁
中 TBA降低 ,不能有效地溶解游离胆红素及胆固醇 ,
不能有效地与胆汁中 Ca2 +结合形成可溶性钙盐 ,使
Ca2 +浓度增高 ,而胆汁中 Ca2 +浓度增高 ,为非结合胆
红素钙、软脂酸盐及硬脂酸盐增高提供了底物 ,导致
胆汁中较易形成微胶粒 ,微胶粒达过饱和后形成结晶
析出 ,最终导致结石形成. 两组胆汁中 CHO无明显
差异 ,说明棕色结石形成与 CHO 无明显关系 ,这与
CBDS主要为棕色结石 ,其成分主要为胆红素钙
相符.
【参考文献 】
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编辑 井晓梅
362第四军医大学学报 (J Fourth M ilMed Univ) 2006; 27 (3) http: / / journal. fmmu. edu. cn