流式细胞术(19页）

流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry,FCM）：是对悬液中的单细胞或其他生物粒子，通过检测标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量分析和分选的技术。可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析；能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度>95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。三个：第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；（上午实验部分）第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；第三，是结果分析阶段。实验一流式细胞术检测5-FU对大肠癌细胞HCT116的细胞周期抑制作用实验二流式细胞术检测CD44在大肠癌细胞HCT116的表达情况实验一流式细胞术检测5-FU对大肠癌细胞HCT116的细胞周期抑制作用【实验目的】1.掌握PI单染进行细胞周期检测的操作步骤2.熟悉5-FU对大肠癌细胞的抑制机理3.熟悉流式细胞术细胞周期检测的结果分析4.了解流式细胞仪的操作原理【实验用品】(1)大肠癌细胞HCT116(2)锡箔纸、离心管、EP管、移液器、离心机、流式细胞仪、一次性手套(3)药物5-FU、胰蛋白酶、70%乙醇、预冷的PBS、染色缓冲液、PI染色液、RNaseA化疗药物（5-氟尿嘧啶，5-FU）最早的抗癌药物之一，在细胞内转化为有效的5-氟尿嘧啶脱氧核苷酸（5F-dUMP）而抑制脱氧胸苷酸合成酶，阻止脱氧尿苷酸（dUMP）甲基化为脱氧胸苷酸（dTMP），从而影响DNA的合成。对多种肿瘤有效，特别是对消化道癌症和乳腺癌疗效较好.荧光染料（碘化丙锭PI）是一种双链DNA的荧光染料，和双链DNA结合后可以发光，并且荧光强度和双链DNA的含量成正比。G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。【实验内容】前一天，细胞加药(实验组)：实验老师已完成实验组和对照组细胞上清培养液分别倒入离心管中（分别做好标记）胰酶消化2-3min，加入前面收集的细胞培养液，轻轻吹打细胞至完全脱落，细胞悬液平均分别分两组（两组公用一皿细胞），分别转移至1.5EP管中（一）细胞收集1000rpm离心5min，小心吸除上清加入1ml预冷的PBS，重悬细胞，1000rpm离心5min，小心吸除上清（二）细胞固定加入1ml预冷70%乙醇，4℃固定至少2h（隔一段时间上下颠倒混匀）1000rpm离心5min，沉淀细胞，小心吸除上清加入1ml预冷的PBS，重悬细胞，1000rpm离心5min，小心吸除上清（三）PI染色每管细胞样品中加入0.3mlPI染色液（已配置好），缓慢并充分重悬细胞沉淀37℃避光温浴30min（包裹锡箔纸）科研楼4楼完成：将细胞悬液加入流式管中，做好标记，然后进行检测（分组去，1/2组：13点30；3/4组：14点；5/6组：14点30；7/8组：15点）注意：若不能及时流式检测，4℃或冰浴避光存放【结果分析】对照组实验组G1:69.56%S:22.5%G2:7.94%G1:82.19%S:17.81%G2:0%实验二流式细胞术检测CD44在大肠癌细胞HCT116的表达情况【实验目的】1.掌握细胞表面蛋白标记细胞的操作步骤2.熟悉流式细胞术检测细胞表面蛋白表达的结果分析3.了解流式细胞仪的操作原理【实验用品】(1)大肠癌细胞HCT116(2)锡箔纸、离心管、EP管、移液器、离心机、流式细胞仪、一次性手套(3)CD44抗体、FITC二抗、胰蛋白酶、预冷的PBSCD44:分布较为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，主要参与异质性粘附,即肿瘤细胞与宿主细胞和宿主基质的粘附，异质性粘附在肿瘤侵袭转移中起促进作用。已在人类各种恶性肿瘤的研究中发现CD44普遍存在,研究证实，CD44可作为肿瘤干细胞的标志物，且与大肠癌的发生发展和侵袭转移密切相关。流式细胞术通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析，进行细胞分类和亚群分析。【实验内容】HCT116细胞上清培养液分别倒入离心管中（做好标记）胰蛋白酶消化2-3min，加入前面收集的细胞培养液，轻轻吹打细胞至完全脱落，分别收集至离心管中（一）细胞收集1000rpm离心5min，小心吸除上清加入1ml预冷的PBS，重悬细胞，1000rpm离心5min，小心吸除上清（二）CD44染色加入100μlPBS重悬细胞，分装细胞到两管EP管中，每管50μl一管加入50μlCD44试剂,设为实验组；一管加入50μlPBS，设为对照组，4℃孵育1h（期间颠倒充分反应）加入1ml预冷的PBS，重悬细胞,1000rpm离心5min，沉淀细胞,小心吸除上清，加入100μlFITC标记二抗,4℃避光孵育30min（期间颠倒充分反应）加入1ml预冷的PBS，重悬细胞,1000rpm离心5min，沉淀细胞,小心吸除上清，每管加入300μlPBS重悬，流式检测【结果分析】对照组实验组