【doc】酶组织化学法检测高强度聚焦超声消融后牛肝细胞活性

【doc】酶组织化学法高强度聚焦超声消融后牛肝细胞活性 酶组织化学法检测高强度聚焦超声消融后 牛肝细胞活性 酶组织 中国超声医学杂志2011年1月第27卷第1期ChineseJUltrasoundMedVol27No1January2011 化学法检测高强度聚焦超声消融后牛肝细胞活性 张弘方廖琼龚晓波田耘博丁晓燕王智彪白晋 摘要 目的比较冷冻切片琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase,SDH)酶组织化学染色法和石蜡切片HE染色法在评价高强 度聚焦超声(HIFU)消融牛肝组织即刻效应中的价值. 方法HIFU消融牛肝组织后即刻,分别置液氮和4多聚甲醛中,分别行冷冻切片SDH酶组织化学染色和石蜡切片HE 染色.以未消融牛肝为对照. 结果HIFU消融后即刻,SDH酶组织化学染色示消融区内SDH活性消失,HE染色显示细胞核形态及细胞结构无明显 改变.2种方法检测的有效性差异显着(P<O.05). 结论冷冻切片SDH酶组织化学染色可作为评价HIFU消融即刻效应快速有效的方法. 关键词 高强度聚焦超声消融琥珀酸脱氢酶酶组织化学染色HE染色 CellViabilityAfterHighIntensityFocusedUltrasoundAblationByEnzymeHistochemical Staining ZhangHong,FangLiaoqiong,GongXiaobo,etal DepartmentofBiomedicalEngineering.ChongqingMedicalUniversity,Chongqing40001 6China Abstract:ObjectiveTocomparethevalueofenzymehistochemicalstainingoffrozensection forsuccinatedehy— drogenase(SDH)andH&.Estainingofparaffinsectionduringevaluatingtheimmediateeffectofthebovineliverabla— tionbyHighIntensityFocusedUltrasound(H1FU).MethodsAfterHIFUablation,thebovineliverpieceswere placedrespectivelyintotheliquidnitrogenforenzymehistochemicalstainingoffrozensectionforSDHandintothe4 paraformaldehydeforH&.Estainingofparaffinsection.Thebovinelivertissuewithoutablationwasservedascontrol group.ResultsAftertheHIFUablation,immediatelythebovineliverinenzymehistochemicalstainingshowedthat SDHactivitywaslostinablatedregion.Incontrast,therewerenosignificantchangesinnucleiandcellulararchitec— luresdisplayedbyH&Estaining.Therewassignificantdifferenceineffectivenessbetweenthetwogroups(P<0.05). ConclusionsFrozensectionforSDHenzymehistochemicalstainingcouldbeconsideredasarapidandeffectivemeans 1oevaluatetheimmediateeffectofHIFUablation. Keywords:Highintensityfocusedultrasound,Ablation,Suecinatedehydrogenase,Enzymehistochemistry staining,H&Estaining. 高强度聚焦超声(HIFU)消融,指将超声聚焦到 体内,在几秒内使局部组织温度达6O?以上,致组织 凝固性坏死.HIFU消融已广泛应用于临床治疗多种 良,恶性实体肿瘤,如纤维瘤,肝癌,前列腺癌,胰腺癌 等].目前,在HIFU研究中,疗效评价主要靠石蜡 切片HE染色.但HIFU消融后,细胞仍保持其核形 态及整体结构,HE染色难以评价HIFU消融即刻效 应].酶组织化学染色更易显示HIFU消融后细胞 功能变化一.本研究用冷冻切片琥珀酸脱氢酶(Succi natedehydrogenase,SDH)酶组织化学染色与传统石 蜡切片HE染色法比较,检测HIFU消融后即刻牛肝 基金项目:国家自然科学基金熏点项目(No.30830040) 作者单位:400016重庆市,霞庆医科大学生物医学超声工程系 通讯作者:于智彪Email:wangzhibiao@haifu.con1.cn 组织的变化. 资料与方法 1.主要试剂 冷冻切片组织琥珀酸脱氢酶(SDH)活性染色试 剂盒(GenMedScientificsInc.U.S.A.)等. 2.主要设备 JC2OO型聚焦超声肿瘤治疗系统(重庆海扶), CM1900冷冻切片机(Leica,Germany),BX40显微镜 (Olympus,Japan),C一5060照相机(Olympus,Japan); RM2135石蜡切片机(Leica,Germany)等. 3.标本获取 取新鲜牛肝,用JC200型聚焦超声肿瘤治疗系统 (1.6MHz),声功率300W,扫描速度6mm/s,于组织 均匀处形成3em长凝固性坏死线.消融后即刻,沿线 中国超声医学杂志20t1年1月第27卷第1期ChineseJUhrasoundMedVol27NolJan 旦ary0l1 扫方向纵切牛肝组织,取2块分别置4%多聚甲醛和 液氮中.以未消融新鲜牛肝组织块分别对照. 4.切片获取 4多聚甲醛固定标本,常规石蜡切片.液氮冷冻 标本,lOm冷冻切片..每个标本各抽取平整无折叠的 .实验重复3次,切片均沿线扫方向纵切. 20张切片 5.琥珀酸脱氢酶活性染色 按冷冻切片组织SDH活性染色试剂盒说明进 行.阳性对照组为未消融牛肝,SDH染色.阴性对照 组为消融后牛肝,用不含SDH反应液的工作液染色. 6.HE染色 常规石蜡切片HE染色.对照组为未消融牛肝. 7.结果判断 光学显微镜观察各组HE和SDH酶组织化学染 色对损伤点的显示情况.HE染色,以有细胞形态和 细胞排列变化,呈雪茄形损伤点为有效.SDH染色, SDH活性存在处呈蓝紫色,失活区呈淡红色,以SDH 失活区域呈雪茄形为有效. 8.统计学 两总体样本的有效率比较,用Y检验. 结果 1.牛肝组织HIUF消融后即刻牛肝组织切面, 见图1. 巾央损伤点短轴0.194trim 图1消融即刻牛肝组织切面图 2.SDH染色 (1)阳性对照组未消融牛肝SDH染色,蓝紫 色颗粒分布于整个组织,中央静脉周围分布更多,颜 色更深,见图2. (2)阴性对照组HIFU消融后即刻牛肝,用不 含SDH反应液的工作液染色,呈淡黄色,中央损伤 点隐约可见,分界不清,见图3. (3)实验组HIFU消融后即刻牛肝sDH染色, 13一 蓝紫色颗粒分布于大部分组织,中央损伤点区域呈雪 茄型淡红色,见图4. 图2未消融的牛肝组织SDH染色图 (左:×100,右:×200) 图3消融后的牛肝组织用不舍反应液的工作液 进行SDH染色图(左:X100.右:X200) 图4消融后即刻牛肝组织SDH染色图 (左:×100,右:X200) 3.HE染色 (1)对照组未消融牛肝HE染色,肝细胞以中 央静脉为中心呈放射状排列.肝细胞为多角形,直径 约20,30"m,细胞核呈圆形,位于细胞中央,见 图5. 14一中国超声医学杂志2011年1月第27卷第1期ChineseJUh!nd!!』: (2)实验组HIFU消融后即刻牛肝HE染色, 肝细胞排列,细胞形态,大小以及细胞核形态与对照 组均无明显差别,见图6. 图5未消融的牛肝组织HE染色图 (左:X100.右:X200) 图6消融后即刻的牛肝HE染色组织图 (左:X100.右:X200) 4.统计结果SDH染色实验组6O张切片均可 见淡红色雪茄形损伤区域,有效率为100HE实 验组切片中均未见明显损伤区域,有效率为0.两样 本率比较用Y检验,P<0.05,差异性显着. 讨论 HIFU消融肿瘤的基本原理与微波,射频相似,故 可借鉴其检测方法.Ozaki等发现,热消融后即刻,细 胞整体及细胞核仍保留原来的形态[4].本研究中, HIFU消融后即刻的牛肝,HE染色亦因此难以分辨 消融区域.可见,HIFU消融后即刻的变化主要在细 胞功能.Yamashiki等提醒病理学家需注意热消融 后,治疗区细胞形态特征保留活性已破坏的现象[5]. 60?以上高温作用于组织,细胞内酶必定失活. Date等认为,检测还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(ni— cotinamideadeninedinueleotide,NADH)是评价热消 融效果的敏感方法_6].SDH和NADH同为线粒体功 能标志酶,参与氧化还原反应和能量产生,为细胞生命 活动所必需.Wataha等也通过SDH评价细胞活 性.冯炼强等认为,组织内SDH对高温敏感,检测 组织SDH活性可敏感评价微波热消融肝癌的灭活效 应. 利用牛肝进行HIFU研究,往往需快速评价其效 应,以选择超声剂量.石蜡切片HE染色用时长,效果 不佳,故冷冻切片SDH酶组织化学染色更适用.但 冷冻切片酶组织化学染色细胞形态显示不佳,与石蜡 切片HE染色结合可更好地显示HIFU消融后的原 位热凝固和细胞功能失活,用于HIFU热消融后期的 疗效评价. 结论 本研究结果提示,冷冻切片SDH酶组织化学染 色可作为一种快速有效的即刻效应评价方法,应用于 HIFU热消融研究. (本文承蒙解放军第三军医大学野战外科研究所 陈志强等老师指导,谨此致谢.) 参考文献 [1]HwangJH,CrumLA.Currentstatusofclinicalhighintensity focusedultrasound.3lstAnnualInternationa1Conferenceofthe IEEEEMBS,2009:130一l33. E23wuF,WangZ.CaoY,eta1.Heatfixationofcancercellsablated withhighintensityfocusedultrasoundinpatientswithbreast cancer.AmJSurg,2006,192(2):179—184. [3]LuoW,ZhouX,YuM,eta1.Ablationofhighintensityfocusedul— trasoundassistedwithSonoVueonrabbitVX2livertumors:se— quentialfindingswithhist0pathol0gy,immunohistochemistry,and enzymehistochemistry.AnnSurgOncol,2009,16:2359—2368. 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