连翘叶中活性成分提取及对豆腐防腐作用的研究

连翘叶中活性成分提取及对豆腐防腐作用的研究 沈阳化工大学 本科生毕业 题 目: 连翘叶中活性成分提取及对豆 腐防腐作用的研究 院 系: 制药与生物工程学院 专 业: 生物工程 班 级: 生物工程1102 学生姓名: 郭世铭 指导教师: 刘桂萍 论文提交日期: 年 月 日 论文答辩日期: 年 月 日 毕业设计(论文)任务书 生物工程专业 1102班 学生:郭世铭 毕业设计(论文)题目:连翘叶中活性成分提取及对豆腐防腐作用的研究 毕业设计(论文)内容:利用微波辅助水提连翘叶中总黄酮，考察料液比、时间、功率、提取次数等对总黄酮提取率的影响，通过单因素实验和正交实验确定最佳提取条件，并探究连翘叶提取液对豆腐防腐的作用。 毕业设计(论文)专题部分:1、微波辅助对连翘叶中总黄酮提取 2、探究粗提液对豆腐防腐的作用效果 3、探究连翘叶粗提液与壳聚糖复配对对豆腐防腐的作用效果 起止时间:2015年3月---2015年6月 指导教师: 签字 年 月 日 教研主任: 签字 年 月 日 学院院长: 签字 年 月 日 毕业设计(论文)诚信承诺书 本人郑重承诺此处所提交的学位论文是在指导教师的指导下，严格按照学校和学院(系)有关规定完成的。论文中引用他人的观点和参考资料均加以注释和说明。在本人的毕业论文中未剽窃、抄袭他人的学术观点、思想和成果，未篡改研究数据，如有违规行为发生，我愿承担一切责任并接受学校的处理。 作者签名: 日期: 年 月 日 关于学位论文使用授权的说明 本论文的研究成果归沈阳化工大学所有，本论文的研究内容不得以其它单位的名义发表。本学位论文作者和指导教师完全了解沈阳化工大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅;本人授权沈阳化工大学可以将论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索、交流，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 (保密的论文在解密后应遵循此规定) 作者签名: 导师签名: 日期: 年 月 日 摘要 连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl，木犀科连翘属，是我国著名的中草药，果实又名落翘，青翘等。研究表明，连翘味苦，无毒，性微寒，在中药中具有镇吐、利尿、强心、抗菌、抗氧化功能等药理作用，历来被视为疮家圣药。连翘叶子与果实的药理成份相似，作用相同，研究对叶子中活性成分的提取，在医药活性成分提取以及对连翘利用方面具有重大意义。 实验采用2014年7月干燥连翘叶，在微波条件下以提取时间、微波提取功率、料液比、微波提取次数为影响条件设计单因素实验，以提取液中芦丁含量为指标，通过硝酸铝显色法对连翘叶中总黄酮类化合物提取率进行计算，通过对比不同条件的影响因素，设计4因素3水平正交实验，得出最佳提取条件;将提取的溶液配比成不同浓度梯度的溶液以及与壳聚糖的复配溶液探讨连翘叶水提物的防腐作用。 实验结果表明，在对各个因素进行分析后，得出微波最佳提取条件为:微波提取即料液比1:23，提取时间2.3min，提取功率640W，提取3次，提取率为16.35%，黄酮含量为0.409mg/ml。连翘叶粗提物对豆腐中微生物有一定的抑制作用，延长了其保存时间:当连翘叶提取物质量浓度为0.025g/ml时就表现出一定的防腐效果，且防腐效果随粗提物质量浓度的增加而加强;当连翘叶提取物质量浓度为0.1g/ml时，可使豆腐的保质期由1天延长至3天，在等同条件下，将连翘水提溶液与壳聚糖溶液按1:1的比例复配处理豆腐，与未加壳聚糖溶液的相比，同浓度的复配溶液处理的豆腐的腐败程度更低，效果更好。 关键词: 连翘叶; 黄酮; 提取; 微波; 防腐 Abstract Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl, oleaceae forsythias class, the othername become warped, such as green become warped. With sickness, diuresis, cardiac, antibacterial forsythia, anti-oxidation function, etc. Bitter taste,non-toxic, small cold, the doctor of traditional Chinese medicine used to qingrejiedu, has long been seen as sore effective medicine. Research under the condition of microwave extraction yield of total flavonoids in the leaves and stems of forsythia changes, comparing the influence factors of different conditions, obtain the best extraction parameters; Using extraction of crude extract bean curd antiseptic experiment. Forsythia leaves take in 2014 and dry, with high-speed universal grinder grinding, dry place preservation. Set aside. Extracted by microwave extraction time, microwave power, material liquid ratio, microwave extraction times as a variable for single factor experiment, in order to get the trend of each single factor, and then choose the best extraction conditions were analyzed, and the single factor of orthogonal experiment, finally obtain the optimal extraction conditions; Ratio of the extracted solution into the solution of different concentration gradient and the compound with chitosan solution anticorrosion performance of eucommia ulmoides leaf aqueous extract are discussed. The results showed that, after the analysis of the factors, the optimum extraction conditions for microwave, microwave extraction time is 2.3 min, power 640 w, and solid-liquid ratio 1:17, extracting 2 times, extraction rate is 16.03%; Crude extractings from forsythia leaves of bean curd of microorganism has certain inhibition, prolong the preservation time. As st John's wort leaf extract concentration is 0.025 g/ml will sho w some anticorrosive effect, and anti-corrosion effect enhance with the increase of mass concentration of crude extract; As st John's wort leaf extract concentration is 0.1 g/ml, can extend the shelf life of tofu by 1 day to 3 days, under equal conditions, forsythia aqueous solution with chitosan solution according to 1:1 proportion distribution of processing bean curd, compared with no chitosan solution with the concentration of the mixed solution processing tofu corruption levels lower, more effective. Key words: forsythia leaves; Flavonoids; Extraction; Microwave; Corrosion protection 目录 引言 ..................................................... 1 第一章 文献综述 .......................................... 2 1.1 连翘 .............................................. 2 1.1.1 连翘叶 ....................................... 2 1.1.2 连翘叶的用途 ................................. 2 1.2 类黄酮 ............................................ 3 1.2.1 类黄酮的结构和分类............................ 3 1.2.2 类黄酮的来源 ................................. 4 1.2.3 类黄酮的提取 ................................. 4 1.2.3.1 溶剂提取 ................................ 4 1.2.3.2 超声波辅助提取 .......................... 4 1.2.3.3 酶法提取 ................................ 5 1.2.3.4 超临界流体萃取技术 ...................... 5 1.2.3.5 微波法连翘叶类黄酮的提取 ................. 5 1.2.4 类黄酮对细菌的抑制............................ 6 1.3 常用检测方法 ...................................... 6 1.3.1 紫外-可见分光光度法 ........................... 6 1.3.2 高效液相色谱法,HPLC, ........................ 6 第二章 实验材料及装置仪器 ................................. 8 2.1 实验材料 .......................................... 8 2.1.1 原料预处理 ................................... 8 2.1.2 实验药品 ..................................... 8 2.2 实验仪器与设备 .................................... 8 2.3 实验 .......................................... 9 2.3.1 方案确定 ..................................... 9 2.3.2 配制芦丁标准溶液 制定工作曲线回归方程 .......... 9 2.3.3 类黄酮的提取与测定........................... 10 2.3.3.1 类黄酮的提取工艺流程 .................... 10 2.3.3.2 类黄酮的测定 ........................... 10 2.3.4 微波水提法单因素实验 ......................... 10 2.3.4.1 微波时间 ............................... 10 2.3.4.2 料液比 ................................. 10 2.3.4.3 微波功率 ............................... 11 2.3.4.4 提取次数 ............................... 11 2.3.4.5 微波水提法正交实验..................... 11 2.3.5 连翘叶提取物对豆腐的保鲜作用研究 ............. 11 2.3.5.1 豆腐防腐试实验步骤 ..................... 11 2.3.5.2 连翘提取物与壳聚糖联合防腐实验步骤....... 12 2.3.5.3 豆腐质量评价测定方法 .................... 12 第三章 实验结果分析及讨论 ............................... 13 3.1 芦丁标准曲线的绘制 ................................ 13 3.2 微波辅助提取 ..................................... 13 3.2.1 单因素 ...................................... 13 3.2.1.1 微波时间对总黄酮提取率的影响 ............ 13 3.2.1.2 料液比对总黄酮提取率的影响 .............. 14 3.2.1.3 微波功率对总黄酮提取率的影响 ............ 15 3.2.1.4 提取次数对总黄酮提取率的影响 ............ 15 3.2.1.5单因素实验结果分析 ...................... 16 3.2.2 正交实验结果 ................................ 16 3.3.1 连翘叶提取物对豆腐防腐定性实验结果与分析 ...... 18 3.3.1.1 豆腐感官变化 ........................... 18 3.3.1.2 豆腐表面霉菌生长情况 .................... 20 3.3.1.3 豆腐表面的pH值变化..................... 20 3.3.2 连翘叶提取物和壳聚糖联合作用对豆腐实验结果与分析21 3.3.2.1 豆腐感官变化 ........................... 21 3.3.2.2 豆腐表面霉菌生长情况 .................... 23 3.3.2.3 豆腐表面的pH值变化..................... 24 第四章 结论 ............................................. 26 4.1 微波辅助水提法提取连翘叶中黄酮类化合物实验结论 ..... 26 4.2 连翘叶粗提溶液以及复配溶液在豆腐防腐作用实验结论.... 26 参考文献 ................................................ 27 致谢 .................................................... 29 引言 连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl，木犀科连翘属，是我国著名的中草药，果实又名落翘，青翘等。研究表明，连翘味苦，无毒，性微寒，在中药中具有镇吐、利尿、强心、抗菌、抗氧化功能等药理作用，历来被视为疮家圣药。连翘叶子与果实的药理成份相似，作用相同，研究对叶子中活性成分的提取，在医药活性成分提取以及对连翘利用方面具有重大意义。本次实验采取微博辅助水提取法研究连翘花中类黄酮物质的分离提取优化工艺，计算最佳提取率，探究其对豆制品防腐作用以及提取物与壳聚糖溶液混合对豆制品防腐作用的效果。 1 沈阳化工大学学士学位论文 文献综述 第一章 文献综述 1.1 连翘 连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl，木犀科连翘属类，另名落翘，青翘等。连 [1-2]翘具有镇吐、利尿、强心、抗菌连翘、抗氧化功能等性质作用。近些年来，越来越多的科学家对从自然界中寻求的天然产物的研究高度重视。连翘味苦，无毒，性微寒，中医常用来清热解毒，历来被视为疮家圣药。从连翘中提取的黄酮类化合物是具有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗病毒等多种生理活性，其药理性质也可用于治疗心脑血管 [3]等疾病。研究者对连翘中的黄酮类化合物通常采用水提法、碱液提取法、醇回流法、 [4]醇渗漉法、浸渍法等方法进行提取。本次实验是通过微波辅助水提法探究黄酮类化合物提取工艺条件，并对该提取方法优化，同时用提取溶液进行豆腐防腐作用的研究。 1.1.1 连翘叶 [5]张建红(2005)检测连翘叶中黄酮的含量，黄酮类化合物得率为8.35%以芦丁为对照品，采用比色法在波长275nm处测出总黄酮含量是69.2%，采用高效液相色谱(HPLC)法测得其中芦丁含量为22.28%。对不同月份的连翘叶含量比较，发现8月 [6]份采摘的连翘叶中芦丁的含量最高为2.372% 1.1.2 连翘叶的用途 作为药用历史悠久的中草药，连翘以果实为主入药。 连翘以其具有抗氧化活性、抗菌活性、抗病毒 活性、抗肿瘤活性以及解热镇痛活性等功效，成为清热解毒药物 [7]的主要原料。目前，如双黄连口服液、双黄连注射液、连翘解毒片等在内的有数十种药物都含有连翘得活性成分。除了连翘的果实有药用价值外，其自身茎、叶以及花的提取物也有抑菌等药用价值，对高血压、痢疾、咽喉痛等具有较好的治疗效果，连翘根可治疗湿热疾病。 2 沈阳化工大学学士学位论文 文献综述 [8]连翘还具有抗肝损伤、抗菌、抗肿瘤和抗氧化等临床活性作用。侯改霞采用ICR健康小鼠，以复制高脂血症建立模型，分析连翘叶提取物对高脂血症小鼠血液、肝脏产生的影响。证明了连翘提取液可降低高脂血症小鼠血清中胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平升高高密度，在一定程度上能够改善高脂血症小鼠血脂紊乱现象，对小 ,,9鼠肝脏也具备保护作用。王新等的甲氧苄啶与连翘联合应用的抗菌试验，证明了连翘与甲氧苄啶联用对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌效果呈协同作用，对沙门氏菌的抗菌效果呈相加作用。此外，相关报道连翘提取物三萜类化合物,,可以引起人低分化胃癌细胞凋亡，有放疗增敏作用。连翘提取物对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用，连翘中的连翘脂素和表松脂素对人胃癌细胞株SGC7901生长也有一定的抑制作用。连翘叶醇提物和水提取物均能通过清除活性氧自由基及提高抗氧化酶活力来保护线粒体，具有一定的抗氧化及抗衰老的药用价值。 1.2 类黄酮 1.2.1 类黄酮的结构和分类 类黄酮(又被称为黄酮类化合物)，是一种具有多种颜色广泛存在自然界的化合物。目前，黄酮类化合物泛指两个芳香环，通过三碳链互相连接而成的一系列化合物，其基本骨架如图1、图2: 天然黄酮多为上述基本母体的衍生物，迄今为止，世界上发现的黄酮类化合物 [10~12]已经超过5000多种。 3 沈阳化工大学学士学位论文 文献综述 1.2.2 类黄酮的来源 类黄酮的来源非常的广泛，除了存在于自然界中的水藻，金鱼藻外，黄酮类化合物都是绿色植物特有的产物，这种化合物几乎遍布于植物体的各个部分，如叶、根、木质部、树皮、花中。 1.2.3 类黄酮的提取 1.2.3.1 溶剂提取 人们通常采用水和有机溶剂对黄酮类化合物进行提取。在采用水做为提取溶剂时，由于黄酮类化合物在水中溶解度较低，通常会对提取溶液加热或者加碱来提高化合物在水中的溶解度。但是加碱时浓度过高，会造成黄酮类化合物在强碱条件下造成结构破坏。水提法黄酮提取率较低，易把提取原料中易溶于水的内容物提取出来，因为其中富含糖类和蛋白质，所以提取液存放易腐败变质。用有机溶剂提取，可克服水提法的产生的问题，是一种最为常用的提取方法。杨洋等一睡集不同有机容积对柚子皮黄酮类化合物尽兴了提取方法的比较研究，结果表明以70%乙醇提取效果最好。但也在于提取所用的成本过高的问题。 1.2.3.2 超声波辅助提取 超声波辐射压强产生的震动效应、空化效应和热效应可以加速植物物质膨胀和水化，并以扩散和传递的方法使可溶性物质向溶剂中传送，在相当程度上极大地提高提取效率。超声空化产生的极大的压力能够使细胞壁和膜类物质瞬间破碎，并引起湍动效应、微扰效应、界面效应和聚能效应，使传质边界层变的薄弱，导致界面层中的浓度梯度逐渐减少，增大传质速率，且微扰效应强化了类黄酮的微孔扩散，聚能效应和热效应加快了类黄酮分子扰动，从而整体上提高提取过程的传质速率和 [13,14]效果，缩短提取时间。兰云昌等进行了超声波法提取槐花中黄酮的最佳工艺研究，结果表明在乙醇浓度为60%，75?，料液比1:5条件下提取30min，连续提取2次，得到黄酮类化合物提取率可高达99.84%。赵永光等用超声波辅助提取法对侧柏片中类黄酮物质尽兴研究，结果表明，在先以50%乙醇wield溶剂浸泡20 h，然后在70?，超声波40KHz，超声处理40min条件下，总黄酮的提取率可达到93.6%， 4 沈阳化工大学学士学位论文 文献综述 与传统醇提法相比，提取率高了23.43%，而且该方法节省时间、操作简便、快捷、 [13-14]节约能源，显示除了该提取方法的一定的优越性。 1.2.3.3 酶法提取 在生物技术不断飞速发展的今天，酶法提取已经逐渐被广泛应用于有效成分的提取中，酶法提取主要通过不同种类的酶来破坏细胞壁或膜的结构。酶法提取具有反应条件温和、选择性高、专一性高的特点。此外，酶法提取还具有提取率高、成本低、简化后续分离纯化工作，底物不易被破坏，能够有效优化组分，提高目标产物药用价值。陈炳华等通过将山楂中的果胶分解成小分子，依靠酶解法对山楂黄酮类化合物提取及含量分析的影响进行了研究，其结果充分表明该实验结果提取率比 [15]目前普遍使用的方法提高了2~3倍。 1.2.3.4 超临界流体萃取技术 超临界流体萃取技术是一种在临界温度和压力的条件下，以超临界流体为萃取溶剂，对目标产物进行有效成分的分离提取的方法。曾启华等研究了超临界萃取的压力、温度、夹带剂等因素条件对对银杏叶类黄酮化合物的萃取效率的影响，得到了银杏叶黄酮类化合物提取最优条件:压力20Mpa，温度为40?，夹带剂用量为10mL/g乙醇。邓丹雯等进行了超临界萃取藜蒿中类黄酮无知的研究，相关研究表 [16-17]明:以1.5mL/g无水乙醇为夹带剂，在35?，30Mpa条件下提取为最佳条件。超临界萃取作为一项新兴技术，在用于类黄酮的提取时，因为二氧化碳的非极性和类黄酮的极性，萃取所需条件要求高，设备成本大，故目前将其工业化生产上有一定的难度。 1.2.3.5 微波法连翘叶类黄酮的提取 近些年来，微波技术因为其反映的高效、高选择性、操作简便副产物少、产率 [18]高以及下游加工过程简单等优点，在生化蛋白质水解、有机合成、酯化反应等方 [19]面被广泛应用。目前有文献报道用于天然产物的提纯。本文探索运用微波技术提取连翘叶中的类黄酮，为连翘叶的充分理由提供新方法，并将其应用到食用豆腐的防腐实验中。 5 沈阳化工大学学士学位论文 文献综述 1.2.4 类黄酮对细菌的抑制 类黄酮具有广谱抗菌的特点，黄酮类化合物可通过可通过破坏细胞壁及细胞膜的完整性，影响微生物内膜电子传递、营养吸收、核苷酸合成及 ATP 活性等功 [20]能，进而制病原微生物的生长。殷彩霞等人指出，类黄酮及其衍生物一般呈弱酸性 (pH 值为 6)，其衍生物因其能使蛋白质凝固或变性而有杀菌和抑菌的效果。 [21]韩淑琴等人通过透射电镜观察，仙人掌醇提物随着时间的延长，对微生物的菌体结构造成破坏，使菌体扭曲变形，进而细胞壁破裂，内容物外漏，直至成为空壳或分解为颗粒状残渣;聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，仙人掌提取物作用使菌体内蛋白质减少，对大分子蛋白质有破坏或抑制其合成的作用。本文将对黄酮类化合物抑菌性能进行研究，探求连翘提取物单剂及复配剂对两种草莓采后病原菌的抑制作用。 1.3 常用检测方法 1.3.1 紫外-可见分光光度法 紫外可见分光光度法的原理是类黄酮化合物与铝离子形成有色、稳定的并具有 ,,22特征吸收光谱的络合物。该方法特异性差，测定结果一般是总黄酮含量。贾春 ,,23晓以槲皮素甲醇溶液为标准溶液，乙酸乙酸钾为缓冲液，利用272nm吸光度值测定银杏叶提取物中总黄酮含量。金雀异黄素标准品和大豆样品均在259nm处有最大吸收峰，且干扰较少。因此，可以金雀异黄素为标准品，在259nm波长下测定大豆 ,,,,2425总异黄酮含量。Abrosca等在350nm波长下，以槲皮素为标准物质测定苹果 ,,,,,262829总黄酮含量，结果表明:苹果皮总黄酮含量远远高于果肉。孙丽萍等以芦丁为标准物质，在360nm波长下，对聚酰胺-UV法、比色法和双波长法进行了比较，确定聚酰胺-UV法是一种比较理想的蜂花粉总黄酮含量检测方法。 1.3.2 高效液相色谱法(HPLC) 高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。该方法通过液体流动相和高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、 6 沈阳化工大学学士学位论文 文献综述 缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱。当各组分分离时，将式样送入检测器检测分析。高效液相色谱法有高压、高速、高效、高灵敏度和应用范围以及色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等优点，更易于后期加工制备纯样。对于沸点高、热稳定性差、不易气化以及具有生理活性物容易分析。该法既可直接分析黄酮苷含量，也可通过分析水解后苷元的含量来测定总含量。 7 沈阳化工大学学士学位论文 实验材料及装置仪器 第二章 实验材料及装置仪器 2.1 实验材料 2.1.1 原料预处理 实验采用沈阳化工大学7月采集连翘叶，采集后放于通风阴凉处晾干，粉碎过筛，阴凉处保存备用;防腐实验所用材料为沈阳化工大学超市购买的新鲜豆腐。 2.1.2 实验药品 实验所需主要药品见表1。 表1 实验药品 药品名称 纯度 生产厂家 硝酸铝 分析纯 天津市福晨化学试剂厂 氢氧化钠 分析纯 西陇化工股份有限公司 亚硝酸钠 分析纯 天津市福晨化学试剂厂 无水乙醇 分析纯 天津市富宇精细化工有限公司 2.2 实验仪器与设备 8 沈阳化工大学学士学位论文 实验材料及装置仪器 实验所用主要仪器与设备见表2。 仪器名称 仪器型号 仪器厂家 电子天平 上海精科天平厂 FA-1004 型数超声波清洗器 曙峰企业制造 KQ5200DE 低速离心机 北京医用离心机厂 LD4-2 高速万能粉碎机 FW100 天津市泰斯特仪器有限公司 电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9240A 上海精宏实验设备有限公司 上海天美科学仪器有限公司 紫外?可见分光光度计 UV1100 佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有格兰仕微波炉 G80F20CN2L-B8(S0) 限公司 ZDJ-4A 自动电位滴定仪 上海仪电 SW-CJ-1FD 超净工作台 苏州安泰空气技术 2.3 实验方案 2.3.1 方案确定 本实验选用蒸馏水作为提取溶剂，采用微波法对连翘叶中总黄酮进行提取。进行单因素实验并优化，将提取的溶液用于豆腐防腐的研究。 2.3.2 配制芦丁标准溶液 制定工作曲线回归方程 用电子天平准确称取3.0mg干燥至恒重的芦丁标准品 ，溶解于30%乙醇溶液中，用50ml容量瓶定容，作为芦丁标准液。然后精密量取芦丁标准液2.00ml，4.00ml，6.00ml，8.00ml，10.00ml，置于试管中，加30%乙醇溶液补足至10.00ml，加5%亚硝酸钠溶液0.75ml，摇匀，静置5min，再加10%硝酸铝溶液0.75ml，摇匀，静置5min，再加入4%氢氧化钠溶液6.00ml摇匀，静置5min，各管再用30%乙醇溶液稀释至20ml，摇匀，静置10min，测定510nm波长处吸光度值，同时做四组平行实验。另取10.00ml30%乙醇溶液，加同量5%亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，4%氢氧化钠溶液，同法操作，也用30%乙醇稀释至20ml作为空白对照。以浓度为横坐标，510nm吸光度为纵坐标绘制芦丁标准曲线。以进一步计算黄酮得率。计算方法如下: 9 沈阳化工大学学士学位论文 实验材料及装置仪器 设提取液中黄酮类化合物提取率为x，稀释以后的浓度为c，原提取液浓度为c0则有黄酮含量计算公式如下: x=c0*100ml*100,/(1.0g*1000) 其中c0=c*40 由标准曲线计算出正交优化条件下杜仲叶黄酮提取液中黄酮类化合物的含量，黄酮类化合物提取率。 2.3.3 类黄酮的提取与测定 2.3.3.1 类黄酮的提取工艺流程 将连翘叶烘干?研碎?微波辅助水提?离心?取上清液(定容到100mL) 2.3.3.2 类黄酮的测定 实验利用硝酸铝显色法，通过分光光度法测定510nm波长处吸光度值作为进行黄酮的定量比较的指标。方法步骤如下:第一步:提取液过滤，取滤液0.5ml，加入30%乙醇溶液9.5ml，对照组不加滤液，第二步:加30%乙醇溶液10ml;加入5%亚硝酸钠溶液0.75ml，混匀，静置5min;第三步:加入10%硝酸铝溶液0.75ml，混匀，静置5min;第四步:加入4%氢氧化钠溶液6ml，混匀，静置5min;再加入30%乙醇溶液2.5ml，混匀，静置10min，测定510nm两波长处吸光度值，每组测四次，再求取平均值。 2.3.4 微波水提法单因素实验 2.3.4.1 微波时间 分别称取1g连翘叶粉末4份，料液比都为1:20，微波功率为480W。以时间作为变量，即1min、1.5min、2min、2.5min、3min提取两次，同时做四组平行实验。提取液定分别容至100ml,提取液按照上述硝酸铝检测法进行检测实验。 2.3.4.2 料液比 分别称取1g连翘叶粉末4份，微波功率为480W，处理时间为2min料液比作为变量，即1:10、1:15、1:20、1:25、1:30。提取两次，同时做四组平行实验。提取液分别定容至100ml，提取液按照上述硝酸铝检测法进行检测实验。 10 沈阳化工大学学士学位论文 实验材料及装置仪器 2.3.4.3 微波功率 分别称取1g连翘叶粉末4份，料液比为1:20，微波处理时间为2min，以微波功率作为变量即160W、320W、480W、640W、800W.。提取两次，同时做四组平行实验。提取液定分别容至100ml，提取液按照上述硝酸铝检测法进行检测实验。 2.3.4.4 提取次数 分别称取1g连翘叶粉末4份，料液比为1:20，微波功率为480W，处理时间为2min，以提取次数为变量即1次、2次、3次、4次、5次。同时做四组平行实验。提取液定分别容至100ml,提取液按照上述硝酸铝检测法进行检测实。 2.3.4.5 微波水提法正交实验 通过单因素实验分析得出，料液比，提取时间，提取功率，提取次数为影响连翘花黄酮提取率的主要因素，评判指标为总黄酮提取率，采用L9(34)正交表进行实验优选方案设计，其因素水平表见表3。 表3 因素水平设计表 因素 水平 A料液比 B提取时间/(min) C微波功率/W D提取次数 1 1:17 1.7 480 1 2 1:20 2.0 560 2 3 1:23 2.3 640 3 2.3.5 连翘叶提取物对豆腐的保鲜作用研究 2.3.5.1 豆腐防腐试实验步骤 将购买的新鲜豆腐切成2cm×2cm×1cm小块，用浓缩的连翘叶提取物配制成浓度 [30]为0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml、0.0125g/ml、0.00625g/ml的系列溶液，每份50ml，把切好的豆腐坊在配置完成的溶液中浸泡3min，取出沥干豆腐表面水分放在灭菌后的平板内，30?恒温培养箱培养，空白对照组以无菌水浸泡，每个浓度梯度做两组平行试验。 11 沈阳化工大学学士学位论文 实验材料及装置仪器 2.3.5.2 连翘提取物与壳聚糖联合防腐实验步骤 将购买豆腐按2.3.5.1步骤切块，将连翘叶提取物和3%柠檬酸溶解的壳聚糖按1:1比例混合，配制成含连翘叶提取物浓度为0.1g/ml、0.05g/ml的混合液(壳聚糖和连翘叶提取液浓度按照最佳抑菌效果选择)，每份50ml，把切好的豆腐坊在配置完成的溶液中浸泡3min，取出沥干豆腐表面水分放在灭菌后的平板内，30?恒温培养箱培养，以无菌水和壳聚糖单独浸泡的豆腐作为对照，每个浓度梯度做两组平行试验。 2.3.5.3 豆腐质量评价测定方法 可以通过观察、口感、嗅觉等感官辨别豆腐质地是否变软，气味及其颜色是否异常对其进行定性分析;每隔24h观察一次，统计腐坏最严重的一面霉斑数，测量直径，按霉斑其直径大小分为5个等级:直径,1mm是一级霉斑;1-2mm的是二级霉斑;2-4mm的是三级霉斑;4-6mm的是四级霉斑;,6mm的是五级霉斑;并按下面的公式来计算豆腐受病指数: [31]病情指数(k)=?(各级霉斑数×各级级别) /M(1)，其中M=(观察样块面积/5 [31]级霉斑面积)×最高级别(2) pH值用PH试纸测量。 12 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 第三章 实验结果分析及讨论 3.1 芦丁标准曲线的绘制 根据2.3.2的方法进行芦丁标准溶液配制，以芦丁浓度为横坐标，以510nm下的吸光度值为纵坐标绘制芦丁标准曲线，其结果见图3。 图3 芦丁标准回归曲线 由图3能看出，随着黄酮类物质的浓度的增加，510nm处吸光度值呈线性的增加。得到芦丁浓度(C)与吸光度值(A)的关系的回归方程为: 计算公式: A=11.283C+0.0011 (2) R^2=0.9980 (3) 3.2 微波辅助提取 3.2.1 单因素 3.2.1.1 微波时间对总黄酮提取率的影响 按照2.3.4.1的提取方法对连翘花中总黄酮进行提取，并以总黄酮提取率为纵坐标，微波时间为横坐标作图，分析微波时间对其的影响，结果见图4。 13 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 图4 时间对连翘叶黄酮类化合物提取率的影响 由图4分析可知，随时间的增加，提取黄酮含量先上升后趋平稳，在2min提取率为14.5% ，当时间超过2.5min后提取黄酮含量又突然上升，这可能是提取时间过长，使得其中杂质溶出的原因。因此微波的最佳提取时间为2min。 3.2.1.2 料液比对总黄酮提取率的影响 按照2.3.4.2的提取方法对连翘花中总黄酮进行提取，并以总黄酮提取率为纵坐标，料液比为横坐标作图，分析料液比对其的影响，结果见图5。 图5 料液比对连翘叶黄酮类化合物提取率的影响 由图5 分析得出随着料液比的增加，提取黄酮的吸光度值也随之增加，并且在 :20条件下提取率为14.5%，随着料液比量的逐渐加大，所提取黄酮类化料液比为1 14 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 合物吸光度值虽然有所上升，但是其上升幅度几近于零，料液比越高，料液利用率越低，综合考虑在料液比为1:20处为微波提取的最优料液比。 3.2.1.3 微波功率对总黄酮提取率的影响 按照2.3.4.3的提取方法对连翘花中总黄酮进行提取，并以总黄酮提取率为纵坐标，功率为横坐标作图，分析微波功率对其的影响，结果见图6。 图6 功率对连翘叶黄酮类化合物提取率的影响 由图6可看出，随着功率的增加提取物吸光度值也随着增加，并且在功率为560W左右提取率达到15.0%，然而随着微波提取功率继续增加，黄酮提取率有下降的趋势，这可能是由于功率过大使得温度上升，黄酮成分受热分解，影响其提取率。综合可得微波提取功率取560W为宜。 3.2.1.4 提取次数对总黄酮提取率的影响 按照3上述单因素试验所得的最佳条件的提取方法对连翘叶中总黄酮进行提取次数的单因素实验，并以总黄酮提取率为纵坐标，提取次数为横坐标作图，分析提取次数对其的影响，结果见图7。 15 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 图7 提取次数对连翘叶黄酮类化合物提取率的影响 由图7可得出随着提取次数的增加，微波提取率也随着增加，在2次达到最高点，并且在3次之后趋于恒定，因此微波提取次数选2次为宜。 3.2.1.5单因素实验结果分析 根据但因素实验所得出连翘液中黄酮类化合物的最佳提取条件为:料液比1:20，提取时间2.0min，提取功率560W，提取2次，提取率为15.0%，提取黄酮含量为0.375mg/ml。 3.2.2 正交实验结果 16 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 按照表3因素水平表进行正交实验，以连翘花黄酮提取率为指标，结果见表4。 表4 微波正交实验结果 因素 实验号 提取率/% A B C D 1 1 1 1 1 13.61 2 1 2 2 2 14.23 3 1 3 3 3 15.74 4 2 1 2 3 14.92 5 2 2 3 1 14.07 6 2 3 1 2 14.74 7 3 1 3 2 15.49 8 3 2 1 3 15.60 9 3 3 2 1 13.86 K1 14.527 14.673 14.650 13.847 K2 14.577 14.633 14.337 14.820 K3 14.983 14.780 15.110 15.420 R 0.465 0.147 0.763 1.573 极差分析表明，各因素对黄酮提取率效果的影响大小顺序是:D>C>A>B，即提取次数>提取功率>料液比>提取时间。由于最优组合不在正交表中，所以要在做实验进行优化实验，实验方法参考2.3，最佳条件为ABCD，即料液比1:23，提取时3333 间2.3min，提取功率640W，提取3次。结果得到提取率为16.35%，高于正交表(表4)的数据和单因素所得最佳条件，因此选择的最佳工艺条件可行。 得到效应曲线图: 图8 微波效应曲线图 17 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 表5 微波正交试验方差分析表 方差来源 因素 偏差平方和 自由度 F比 F临界值 显著性 A 0.376 2 0.296 4.460 B 0.034 2 0.027 4.460 C 0.883 2 0.696 4.460 D * 3.783 2 2.981 4.460 注:*表示差异显著，P<0.05。 由方差分析表可以看出D(提取次数)对连翘花总黄酮提取率影响显著。 3.3.1 连翘叶提取物对豆腐防腐定性实验结果与分析 3.3.1.1 豆腐感官变化 按照2.3.5.1所述方法进行豆腐防腐实验，每隔24h按照2.3.5.3方法对不同浓度杜仲叶提取物处理后的豆腐进行感官变化评价测定，其现象见图9、其结果见表6。 18 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 图9 无菌水以及浓度为0.05g/ml、0.1g/ml提取液处理豆腐72h后的表观现象 表6 豆腐感官变化 24h 48h 72h 处理浓度/ (g/ml) 质地 颜色 气味 质地 颜色 气味 质地 颜色 气味 0.1 细嫩 无变化 豆香细嫩 无变化 豆香浓 细嫩 无明显有轻微 浓 变化 异味 0.05 细嫩 无变化 豆香细嫩 微黄 豆香浓 稍变软 有黄色有异味 浓 斑点 0.025 细嫩 无变化 豆香变软 有黄色豆香淡 变软 个别面有恶臭 淡 斑点 变黄 0.0125 变软、微黄 豆香变软 个别面有异味 腐烂变基本都有恶臭 变粘 淡 变粘 变黄 质 变黄 0.00625 变软、微黄 有异变软 深黄 有恶臭 腐烂变各面均有恶臭 变粘 味 变粘 质 变黄 0 变软、黄色 轻微变软 深黄 有恶臭 腐烂变各面均有恶臭 变粘 臭味 变粘 质 变黄 由表一可看出，随着时间的增长，同一天的豆制品腐败程度与连翘叶粗提物浓度 19 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 呈一定的线性关系。连翘叶粗提取物浓度越高，豆腐的感官指标越好，仅经过无菌水处理的豆腐存放一天就出现的变软、变粘以及产生臭味等腐败现象。其中叶粗提物浓度为0.025g/ml、0.05g/ml时，到第二天才出现腐败的现象，质量浓度为0.1g/ml时到第三天出现腐败现象，并且腐败成对象对于低浓度轻。 3.3.1.2 豆腐表面霉菌生长情况 按照2.3.5.1所述方法进行豆腐防腐实验，每隔24h按照2.3.5.3测定不同浓度提 2取液处理的豆腐的霉菌斑数。其中5级霉斑直径为6.20mm，面积为30mm。按照公 2式(2)算得M=(20mm×20mm/30mm)×5=67[31]，并按照公式(1)计算病情指数k，其结果见表7。 表7 豆腐表面霉斑数 处理浓度/ 24h各级霉斑数 48h各级霉斑数 72h各级霉斑数 -1(g.ml) 1 2 3 4 5 k 1 2 3 4 5 k 1 2 3 4 5 k 0.1000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0.030 0.0500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0.060 0.0250 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0.030 4 3 0 0 0 0.149 0.0125 0 0 0 0 0 0 3 1 2 0 0 0.164 7 2 1 2 1 0.403 0.0063 0 0 0 000 8 3 2 2 3 0.642 2 7 3 3 5 0.925 0 5 2 0 0 0 0.134 7 4 2 2 3 0.657 0 3 4 4 6 0.955 由表7可以看出，经过连翘叶粗体液处理后的豆腐表面霉菌数量明显少于无菌水，并且随着提取液浓度的增大，豆腐表面霉斑数和病情指数越小，经连翘叶粗提液处理后的豆腐延缓了菌斑生长的时间，其中0.1g/ml处理后的直到72h后才开始有一个2级霉斑，0.05g/ml在72h后出现4级霉斑的原因可能是在观察实验结果的时候不慎染菌。这充分说明通过连翘叶水提物浸泡，在一定程度上能较为有效延长豆腐的货架期。 3.3.1.3 豆腐表面的pH值变化 按照2.3.5.1所述方法进行豆腐防腐实验，图为在72h内经不同浓度的连翘叶提取液对豆腐PH值影响的趋势变化图10。 20 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 图10 pH值变化 由图10可以看出，经无菌水和浓度相对较低的连翘叶提取液处理的豆腐在72h内，随着时间的增长ph值不断升高，而浓度为0.05g/ml和0.1g/ml提取液处理的豆腐其PH值较为恒定。这是因为豆制品蛋白质含量高，微生物在无菌水或低浓度提取液条件下能够生存繁衍，并代谢生成氨，造成食品变臭以及PH值升高;而经由浓度较高的提取液处理后的豆腐由于其具有一定的抑菌效果，微生物在其环境条件下不能够迅速生长，代谢相对缓慢甚至没有，所以浓度为0.05g/ml和0.1g/ml浓度处理的豆腐其PH保持恒定。这充分说明了鲜豆腐经连翘叶叶提取物浸泡后，抑制了豆腐微生物的生长和代谢，延长了豆腐的腐败期，对豆腐保鲜有一定的作用。 3.3.2 连翘叶提取物和壳聚糖联合作用对豆腐实验结果与分析 3.3.2.1 豆腐感官变化 按照2.3.5.2所述方法进行连翘叶提取物和壳聚糖联合作用对豆腐防腐实验，每隔24h按照2.3.5.3方法对不同浓度复配溶液处理后的豆腐进行感官变化评价测定，其现象见图11、结果见表8。 21 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 图11 72h豆腐表观现象 22 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 表8 豆腐感官变化 24h 48h 72h 处理浓度/ (g/ml) 质地 颜色 气味 质地 颜色 气味 质地 颜色 气味 0 细嫩 无变化 豆香浓 变软 微黄 有轻微变软 各面均有恶臭 异味 变黄 壳聚糖 细嫩 无变化 豆香浓 细嫩 无明显豆香浓 无变有黄色有轻微0.05g/ml 变化 化 斑点 异味 壳聚糖 细嫩 无变化 豆香浓 细嫩 无明显豆香浓 无变有黄色无变化 0.1g/ml 变化 化 斑点 复配细嫩 无变化 豆香浓 细嫩 无明显豆香浓 无变有黄色无变化 0.05g/ml 变化 化 斑点 复配细嫩 无变化 豆香淡 细嫩 无明显豆香淡 无变无变化 无变化 0.1g/ml 变化 化 由表8可看出，随着时间的增长，同一天的豆制品腐败程度与复配溶液浓度呈一定的线性关系。复配溶液浓度越高，豆腐的感官指标越好，仅经过无菌水处理的豆腐存放一天就出现的变软、变粘以及产生臭味等腐败现象。而复配溶液处理后的豆腐到第三天才出现腐败的现象，且相对于壳聚糖溶液处理的豆腐其效果相对较好，质量浓度为0.1g/ml时到第三天出现轻微染菌现象，并且腐败程度相对于低浓度轻。 3.3.2.2 豆腐表面霉菌生长情况 按照2.3.5.1所述方法进行豆腐防腐实验，每隔24h按照2.3.5.3测定不同浓度提 2取液处理的豆腐的霉菌斑数。其中5级霉斑直径为6.20mm，面积为30mm。按照公 2式(2)算得M=(20mm×20mm/30mm)×5=67，并按照公式(1)计算病情指数k，其结果见表9。 23 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 表9 豆腐表面霉斑数 处理浓度/ 24h各级霉斑数 48h各级霉斑数 72h各级霉斑数 -1(g.ml) 1 2 3 4 5 k 1 2 3 4 5 k 1 2 3 4 5 k 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2 0 0 0.179 复配0.1000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 3 1 0 0.194 复配0.0500 5 2 0 0 0 0.134 7 5 2 2 3 0.687 0 2 5 5 5 0.955 无菌水0.000 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0.030 4 1 2 1 0 0.194 壳聚糖0.1000 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 0 0.030 2 3 1 2 0 0.283 壳聚糖0.0500 由表9可以看出，经过复配溶液处理后的豆腐表面霉菌数明显少于无菌水处理过的，随着浓度的增大，豆腐表面霉斑数逐渐减少，病情指数越小，且经复配溶液浸泡后延缓了长霉斑的时间。在第二天的时候复配溶液处理后的豆腐性状与处理之前的相差不大，第三天染菌严重的情况可能是因为在观察拍照的过程不慎染菌，但是通过第二天0.5g/ml和1.0g/ml复配溶液与连翘粗提取液对比效果更佳，这说明复配溶液浸泡浸泡，能有效延长豆腐的货架期。 3.3.2.3 豆腐表面的pH值变化 按照2.2所述方法进行豆腐防腐实验，经不同浓度杜连翘叶粗体溶液与壳聚糖溶液复配处理的豆腐在30?恒温箱中培养72小时，pH值随之变化趋势见图12。 24 沈阳化工大学学士学位论文 实验结果分析及讨论 图12 pH值变化 由图12可以看出，经无菌水和连翘叶提取液与壳聚糖复配后处理的豆腐在72h内产生了不同的实验现象。随着时间的增长，经由无菌水处理后的豆腐ph值不断升高，而浓度为0.05g/ml和0.1g/ml复配溶液处理的豆腐其PH值较为恒定。由于壳聚糖经柠檬酸溶解，故PH始终保持在一个较低的浓度，其虽有抑菌效果，但是豆腐酸性大，影响口感;而经浓度为0.05g/ml和0.1g/ml浓度复配溶液处理的豆腐其PH保持恒定，且拥有较好的抑菌效果。综上所述，这充分说明了鲜豆腐经复配溶液浸泡后，能够较好的抑制豆腐微生物的生长和代谢，延长了豆腐的腐败期，对豆腐保鲜有较好的作用。 综上所述:微波辅助水提法的最佳提取条件为料液比1:23，提取时间2.3min，提取功率640W，提取3次，得到提取率为16.35%;用提取液进行的豆腐防腐实验，水提取物浓度为0.025g/ml时就表现出一定的防腐效果，且防腐效果随粗提物质量浓度的增加而加强，当其质量浓度为0.1g/ml时，可使豆腐的保质期由1d延长至3d;复配溶液与壳聚糖和无菌水单独处理的相比要优于后者 25 第四章 结论 4.1 微波辅助水提法提取连翘叶中黄酮类化合物实验结论 本实验以2014年4月份连翘花粉末为原料，采取微波、超声波辅助水提法提取类黄酮物质，并测得其提取率，主要结论如下: 通过单因素实验所得结果，选取微波功率，提取时间，料液比，提取次数四个 4因素设计的L(3)正交试验，得到最佳的提取条件即料液比1:23，提取时间2.3min，9 提取功率640W，提取3次，提取率为16.35%，黄酮含量为0.409mg/ml。 4.2 连翘叶粗提溶液以及复配溶液在豆腐防腐作用实验结论 与无菌水处理相比，经连翘叶水提物浸泡后，可以明显延缓豆腐pH改变的时间，保证口感，可以抑制豆腐中微生物生长，延缓豆腐表面霉斑滋生，保证豆腐各项感官指标正常，从而延长其保存时间。其中连翘叶水提取物浓度为0.025g/ml时就表现出一定的防腐效果，且防腐效果随粗提物质量浓度的增加而加强，当其质量浓度为0.1g/ml时，可使豆腐的保质期由1d延长至3d，表明连翘叶水提取物可以作为豆制品的天然防腐剂;此外，将连翘水提溶液与壳聚糖溶液按1:1的比例复配，也可以延缓豆腐的保质期，且在相同的时间内，与无菌水和壳聚糖单独浸泡的相比，同浓度的复配溶液处理的豆腐的腐败程度更低，效果更好。本实验采取的是将豆腐在杜仲叶水提物中浸泡3min的表面处理方法，用于处理豆腐样品的水提物并没有完全发挥作用，如果采取将连翘叶叶水提物或者连翘叶水提物与壳聚糖复配液在豆腐加工过程中加入，可能防腐效果会更好。这样不仅能延长豆腐的货架期，连翘叶和壳聚糖中的保健成分也能很好的被人体吸收利用，进而提升豆腐的营养价值。这些都有待于进一步研究证实。 26 参考文献 [1]张恩户，赵子剑，张英，等(连翘及其制剂抗菌效价的生物测定法[J](中国中医基础医学杂志， 2005，11(10):782-784( 24(2):122-125( [2]张立伟，刘金，杨频(中草药连翘提取物抗氧化活性研究[J](食品科学，2003，[3]Qu H,Zhang Y,Wang Y,et al. 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