大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘及其共附生微生物的化学成分的研究（可编辑）

大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘及其共附生微生物的化学成分的研究（可编辑） 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘及其共附生微生物的化 学成分的研究 上海海洋大学硕士学位1 0 2 6 4 学校代 码: 研究生学号: M100204321 上 海 海 洋 大 学 硕士学位论文 大洋纵列 海鞘和硬突小齐海鞘 及其共附生微生 目: 物的化学成分研究 Study on Chemical Constituents from Symplegma 英文题目: oceania, Microcosmus exasperatus and Their Associated Microorganisms 专 业: 应用化学 研究方向: 海洋天然产物 姓 名: 赵树明 指导教 师 : 于慧娟研究员 二 ? 一三年 五 月 二十五 日I 上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学学位论文原创性声明 本人 郑重 声明 : 我恪 守学 术 道德 ,崇 尚 严谨 学风 。所 呈交 的 学位 论文 , 是本 人在 导 师的 指导 下, 独 立进 行研 究 工作 所取 得的 成果 。除 文 中已 经明 确 注明 和引 用 的内 容外 , 本论 文不 包含 任 何其 他个 人 或集 体已 经发 或 撰写 过 的作 品及 成 果的 内容 。 论文 为本 人 亲自撰写,我对所写的内容负责,并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位 论文 作者 签 名 : 日期:年 月 日 上海海洋大学学位论文版权使用授权书 学位 论文 作者 完 全了 解学 校 有关 保留 、 使用 学位 论文 的规 定 ,同 意学 校 保留 并向 国 家有 关部 门或 机 构送 交论 文 的复 印件 和电 子版 ,允 许 论文 被查 阅 或借 阅。 本 人授 权上 海 海洋大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密?,在年解 密后 适用 本 版 权书 。 本学 位论 文属 于不保密? 学位 论文 作者 签名 :指导教师签名: 日期:年 月 日 日期:年 月 日 II 上海海洋大学硕士学位论文 上海海洋大学硕士学位论文 答辩委员会成员名单 姓名 工作单位 职称 备注 宁喜斌 上海海洋大学 教授 主席 樊成奇 东海水产研究所 副研究员 委员 王朝瑾 上海海洋大学 副教授 委员 欧杰 上海海洋大学 副教授 委员 东海水产研究所3 号楼 2013.5.26 答辩地点 答辩日期 会议室 III 上海海洋大学硕士学位论文 大洋纵列 海鞘 和硬突小齐海鞘 及其 共附生 微生物 的化学 成分 研究 摘 要 本文以 大 洋 纵 列 海 鞘 ( Symplegma oceania Tokioka )和硬突小齐海 鞘 (Microcosmus exasperatus Heller )及其共附生微生物 为研究对象, 分离 鉴定其中 的化学成分 ,并 对 两种 海 鞘及 其共 附 生微 生物 的 活性 物质 研 究 进行 了 探讨 。采用 现代 柱色 谱技 术 (正 相硅 胶柱 色谱 、 多种 凝胶 柱 色谱 、树 脂柱 色谱 及 高效 液相 色 谱等) 对 海鞘及其共附生微生物提取物 进行分离纯化, 并运用 波谱学技术EI-MS 、 1 13 1 1 HR-ESI-MS 、 H-NMR 、 C-NMR 、 H- H COSY 、HSQC 、HMBC 、UV 等 和物理 化学方法, 分离鉴定了18 个化合物, 分别为6- 甲氧基-7- 甲基-8- 氧鸟嘌呤 (FHQ-01)、 2- 甲 基 亚 氨 基-3- 甲基-6- 甲 基 氨 基-9- 氢- 嘌呤 (FHQ-02)、1,2,3,4- 四氢- ?- 咔啉 (FHQ-03)、1- 甲基四氢- ?- 咔啉 (FHQ-04 )1,2,3,4- 四氢- ?- 咔啉-3- 羧酸 (FHQ-05)、 ?- 咔啉(FHQ-06)、 胆甾-5- 烯-3β- 醇 (FHQ-07)、 十六碳烷基甘油醚 (FHQ-08)、 Microexasperin A (FHQ-09)、Microexasperin B (FHQ-10)、 环 (脯 氨酸- 苯丙氨酸) (FHW-01)、 环 ( 脯氨酸- 亮氨酸) (FHW-02)、 环 ( 脯氨酸- 异亮氨酸) (FHW-03)、 放线菌素D (FHW-04)、N-1- 羟基异丙基- 邻羟 基 苯甲 酰胺 (FHW-05)、N-1,3- 二羟基异丙基- 邻羟 基苯 甲酰 胺 (FHW-06)、Lobophorin A (FHW-07)、 Lobophorin B (FHW-08) ; 其中化合物FHQ-02~05均为首次从Symplegma 属海 鞘中 获 得 , 嘌 呤、 咔啉类是该种海鞘中生物碱成分的主要类型 ; 另外 发现 菌株35-2的主 要代谢产物是 放线菌素D (FHW-04 ) ;化 合物FHW-05~08 也是 首次 从海 鞘来 源的 微 生物 发酵 液 中分离得到。 关键词 : 大洋纵列海鞘 , 硬突小齐海鞘 , 共附生微生物 ,化学成分,生 物活性 I 上海海洋大学硕士学位论文 Study on Chemical Constituents from Symplegma oceania, Microcosmus exasperatus and Their Associated Microorganisms ABSTRACT Two ascidian species, Symplegma oceania and Microcosmus exasperatus and their associated microorganisms were investigated to study the chemical constituents and assess the activity of these compounds. The chemical constituents were obtained by the column chromatography including chromatography on normal-phase silica gel, reverse-phased silica gel, Sepadex LH-20, MCI gel and macroporus resin, and semi-preparative HPLC. Their structures have been identified on the basis of 1 13 1 1 spectroscopic analyses including EI-MS, HR-ESI-MS, H-NMR , C-NMR, H- H COSY, HSQC, HMBC and UV, and by comparison with the literatures. 18 compounds were identified as 6-methoxy-7-methyl-8-oxoguanineFHQ-01, 2-methylimino-3- methyl-6-methylamino-9H-purineFHQ-02,1,2,3,4-tetrahydro- ?-carbolineFHQ-03,1, 2,3,4-tetrahydro-1-methyl- ?-carbolineFHQ-04, 1,2,3,4-tetrahydro- ?-carboline- 3-carboxylic acid FHQ-05, ?-carboline FHQ-06, cholesterol-5-ene-3 ?-ol FHQ-07, hexadecyl glyceryl etherFHQ-08, Microexasperin AFHQ-09, Microexasperin BFHQ-10, cyclo-Pro-PheFHW-01, cyclo-Pro-LeuFHW-02, cyclo-Pro-Ilue FHW-03, actinomycin DFHW-04, N-salicyloyl-2-aminopropan-1- olFHW-05,N-salicyloyl-2-aminopropan-1,3-diolFHW-06, Lobophorin AFHW-07, Lobophorin BFHW-08; Among them, compounds FHQ-02~05 were reported from the ascidians of Symplegma genus for the first time. The purine and carboline were the major alkaloid types of S. oceania. Actinomycin D is the main metabolite of strain 35-2Compounds FHW-05~08 were isolated from ascidian-derived microorganisms firstly KEY WORDS: Symplegma oceania, Microcosmus exasperatus, Associated Microorganisms, Chemical Constituents, Biological ActivityI 上海海 洋大学硕士学位论文 目录 目录.I 引 言..1 第一章 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘的化学成分研究2 第一节 纵列属和小齐属海鞘的天然产物研究和开发利用研究进展..3 1 、纵列属(Symplegma )海鞘的天然产物研究和开发利用.3 2 、小齐属(Microcosmus )海鞘的天然产物研究和开发利用..3 3 、大洋纵列海鞘和硬突小齐海 鞘天然产物研究的必要性和意义..5 第二节 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘天然产物的提取分离.6 1 、材料来源与鉴定.6 2 、仪器和试 剂..6 2.1 仪器6 2.2 色谱填料和试剂6 3 、大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘化合物的提取与分离.7 3.1 大洋纵列海鞘化合物的提取(流程图见图 1-3)..7 3.2 大洋纵列海鞘甲醇提取物的分离(流程图见图 1-4).8 3.3 硬突小齐海鞘化合物的提 取(流程图见图 1-5)..9 3.4 硬突小齐海鞘化合物的分离10 3.4.1 硬突小齐海鞘甲醇提取物的分离(流程图见图 1-6 )10 3.4.2 硬突小齐海鞘乙酸乙酯提取物的分离(流程图见图 1-7 )..11 4 、天然产物肿瘤细胞毒 性测试..12 4.1 生物材料和试验样品13 4.2 肿瘤细胞株的细胞毒 性实验方法..13 4.2.1 SRB 法13 4.2.2 MTT 法(噻唑兰法).13 第三节 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘天然产物的结构鉴定和生物活性..14 1 、核磁共振谱NMR 解析方法简介..14 2 、化合物的理化性质和波谱数据15 3 、化合物生物活性20 第四节 总结与展望.22 1 、主要结论22 2 、后期研究与展望22 第二章 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘共附生微生物的化学成分研究..23 第一节 海鞘共附生微生物的化学成分和生物活性研究进展.25 1 、萜类化合物.25 2 、生物碱..27 3 、肽类化合物.29 4 、芳香族化合物..30 5 、海鞘共附生微生物资源利用..32 第二节 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘共附生微生物天然产物的提取分离 34 1 、材料来源与鉴定34 I 上海海洋大学硕士学位论文 2 、仪器和试剂.34 2.1 仪器..34 2.2 培养基、色谱填料和试剂35 3 、大洋纵列海鞘共附生微生物菌株的分离和培养.35 3.1 菌株 35-1 和 35-2 的分离纯化..35 3.2 菌株发酵培养35 4 、菌株 35-1 和 35-2 天然产物提取制备和分离纯化..35 4.1 菌株 35-1 化合物的提取分离(流程图见图 2-5)35 4.2 菌株 35-2 化合物的提取分离(流程图见 图 2-6)36 5 、硬突小齐海鞘共附生微生物菌株的分离、鉴定与培养.38 5.1 菌株 13-1 的分离鉴定38 5.2 菌株发酵培养38 6 、菌株 13-1 天然产物提取制备和分离纯化38 6.1 菌株 13-1 化合物的提取制备(流程图见图 2-7)38 6.2 粗提物的分离纯化..38 第三节 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘共附生微生物天然产物的结构鉴定 40 第四节 总结与展望.43 1 、主要结论43 2 、后期研究与展望44 参考文献..45 附录51 附录一 英文缩略语.51 附录二 化合物谱图.52 论文发表情况.59 致谢60 II 上海海洋大学硕士学位论文引 言 海鞘(Ascidian ) 为 脊 索 动 物 门 Chordata 尾 索 亚 门 Urochordata 海鞘纲 Ascidiacea 动物 , 营固 着生 活, 在我 国各 海区 均是 主要 附着 的 海 洋污 损生 物之 一 [1-2] 。近年来,从海鞘中发现了诸 如 生物碱 、 甾醇、大环内脂、核苷、环肽、 醌类 [2] 和类胡萝卜素 等 结构新颖的次生代谢产物, 使其成为天然产物化学和药物化学的 研究热点 ;在生 物活 性领 域, 涉及 抗 肿瘤 、抗 病 毒、抑菌 等重要 活性 ,是 海洋 药 物先 导化 合物 , 特别 是抗 肿瘤 药物 的 主要 来源 之 一 。目前 进入 过 二期 、三 期临床 研究的 7 个海洋抗肿瘤药物中就有 3 个是来源于海鞘, 分别是 ET 743 、 Didemnin B [3-5] 和 Aplidine 。 同时,海洋微生物活性物质研究是 近年来国内外新结构的 海洋天然产物及活 性成 分的 主要 增 长点 ,海 洋微 生物 为 了能 够适 应 特殊 的海 洋生 存环 境 ,往 往能 够 [6-7] 产生结构新颖、活性显著的天然产物 。近期研究发现部分活性显著、具有开发 前景 的海 洋天 然 产物 ,其 真正 来源 不 是海 洋生 物 ,而 是由 其共 生附 生 微生 物产 生 [8] 的 。 海洋微生物生源学说认为, 某些活性物质的最初前体化合物可能是产 生于共 附生微生物,通过食物链再传递给海洋生物体 。 前苏联学者研究发现,20% ~50% [7] 的海鞘、海参共附生微生物可产生具有细菌毒活性和抑菌杀菌活性的化合物 。 本课题以 大 洋 纵 列 海 鞘 ( Symplegma oceania Tokioka )和硬突小齐海鞘 (Microcosmus exasperatus Heller )及其共附生微生物 为研究对象, 分离鉴定其中 的化学成分 ,并 对 两种 海 鞘及 其共 附 生微 生物 的 活性 物质 研究 进行 探 讨 。 采用 现 代 柱色 谱技 术( 正相 硅胶 柱色 谱、 多 种凝 胶柱 色 谱、 树脂 柱色 谱及 高 效液 相色 谱 等) 对 海鞘 及其 共附 生微 生物 提取 物 进行 分离 纯 化,以期 分离 鉴定 结 构新 颖活 性 显著的海洋天然产物 。主要内容如下: 1 、 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘的天然产物提取分离 2 、 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘的天然产物结构鉴定和生物活性测试 3 、 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘共附生微生物的天然产物提取分离 4 、 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘共附生微生物的天然产物结构鉴定1 上 海海洋大学硕士学位论文 第一章 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘的化学 成分研 究 大洋纵列海鞘 Symplegma oceania Tokioka 为瘤海鞘科 Styelidae 纵列属 Symplegma 动物 , 属复 海鞘 类, 广泛 分布 于 我国 罗源 湾、 厦门 港、 东山 岛、 南澳 岛、 [9] 大亚 湾、 香港 、 湛江 和西 沙永 兴岛 等水 域 , 也常见附着在渔排的网绳、 塑料泡沫 乃至 牡蛎 、贻 贝 、其 它海 鞘等 附着 生 物的 表面 , 形成 红色 、黑 色或 者 灰色 的薄 片 状覆盖 ; 硬突 小齐 海鞘 Microcosmus exasperatus Heller 为 脓 海鞘科 Pyuridae 小齐属 Microcosmus 动物 , 属单 海鞘 类 , 广泛 分布 于我 国厦 门港 、 东山 湾 、 汕头 港、 南澳 岛、大亚湾、香港、湛江和 榆林港等水域。大洋纵列海鞘(S. oceania )和硬突小 [2] 齐海鞘(M. exasperatus ) 是我国东海水养殖 区的主要海鞘优势种 。 通过查阅文献发现,迄今为止中国产 大洋纵列海鞘(S. oceania )和硬突小齐 海鞘(M. exasperatus )属种的化学成分研究尚未有较为全面的文献报道。 为系统 了解两种海鞘相关属种的国内外研究背景,以利于促进中国纵列属(Symplegma ) 和小 齐属 (Microcosmus ) 海鞘的化合物活性筛分研究 。 本文结合有关文献 , 对 2012 年 12 月以前 纵列属和小齐属 海鞘的天然产物研究和开发利用 研究进展做一综述, 对开展大洋纵列海鞘(S. oceania )和硬突小齐海鞘(M. exasperatus ) 资源活性物 质研究的进行可行性探讨 。 2 上海海洋大学硕士学位论文 第一节 纵列属和小齐属海鞘的天然产物研究和开发利用研究进展 1 、 纵列属 (Symplegma ) 海鞘的天然产物研究和开发利用 [10] 1999 年 Lindsay B. S 等 从巴西东南海岸采集到的 S. rubra 海鞘进行提取分离 时,得到 1 个新的嘌呤碱 6-methoxy-7-methyl-8-oxoguanine (1,图 1-1 )和 2 个已 知嘌呤碱(2~3,图 1-1) ,其 结构 通过 波谱 数据 分析 得以 确证 。 图 1-1 纵列属(Symplegma )属化学成分 Fig.1-1 Compounds from genus Symplegma [11] 2005 年王瑞等 曾报道大洋纵列海鞘 (S. oceania ) 醇提物体外抗乙肝 HBsAg 和 HBeAg 作用 , 研究 发现 当海 鞘醇 提物 的浓 度大 于 0.5 g/L 时, 对 HBeAg 具有良 好的 抑制 作用 , 呈现 出一 定的 量效 相 关性 ;另 推 测了 海鞘 醇提 物的 两 类抗 乙肝 病 毒成 分: 一类 是 类似 抗体 的结 构, 另 一类 是对 抗 原具 有明 显抑 制作 用 同时 对抗 体 也具有一定程度的抑制作用。 [12] 2007 年 Seleghim M. H. R 等 对采自巴西的 349 种海洋无脊椎 动物的甲醇粗 提物进行抗菌活性、细胞毒活性和蛋白酶抑制活性筛选时,发现 1 种纵列属海鞘 提取物表现出潜在的细胞毒活性, 另 其对结核分枝杆菌 H37 Rv 的 MIC 在 10~200 μg/mL 之间。 [13] 2012 年樊成奇等 曾对大洋纵列海鞘 (S. oceania ) 油脂 中的 脂肪 酸含 量进 行 了相对含量成分分析,发现海鞘油脂中含有 EPA 、DHA 两种多不饱和脂肪酸 ω-3 [14] PUFAs , 含量 分别 为 18.2% 和 7.73% 。 据文 献报 道 ω-3 PUFAs 具有降血脂的功效, 因此大洋纵列海鞘有望成 为新的 ω-3 PUFAs 的来源,进而开发出新的具有降血脂 活性的海洋保健食品和药物。 2 、 小齐属 (Microcosmus ) 海鞘的天然产物研究和开发利用 [15] 1997 年 Aiello Anna 等从地中海 M. vulgaris 海鞘中分离得到一种新的对细胞 增殖具有抑制活性的链烯烃硫酸酯化合物 4 3Z-4,8-dimethylnon-3-en-1-sodium sulfate (图 1-2) ,其对体外牛内皮细胞株 GM7373 和鼠纤维瘤细胞株 WEHI164 的3 上海海洋大学硕士学位论文 IC 约为 50 μg/mL , 对鼠 单核 细胞/ 巨 噬细 胞株 J774 和鼠白 血病 细胞 株 P388 的 IC 50 50 约为 110 μg/mL 。 [16] 2002 年 Aiello Anna 等 从地中海 M. vulgaris 海鞘中分离得到一种新的对细胞 增殖具有抑制活性的生物碱 5 sulcatin ( 图 1-2) ,其结构通过波谱数据得以鉴定, 活性测试表明 sulcatin 对鼠单核细胞/ 巨噬细胞株 J774 的 IC 约为 2 μg/mL 。 50 [17-18] 2002 和 2003 年 Aiello Anna 等 从地中海 M. sulcatus 海鞘中分离得到四种 新的糖基神经酰胺糖苷 (鞘糖脂,glycosphingolipid )6~9 ( 图 1-2) , 其结 构通 过乙 酰化 反应 和波 谱 数据 得以 确证 ,而 作 为从 海洋 无 脊椎 动物 中提 取到 的 鞘糖 脂一 部 分的三糖基团也是极不寻常的结构单元。 图 1-2 小齐属(Microcosmus )属化学成分 Fig.1-2 Compounds from genus Microcosmus [19] 2006 年 Perrine Senger-Emonnot 等 对 M. sulcatus 海鞘提取物的气味活性风味 化合物进行了研究,通过运用 GC-MS 、GC 等分析方法,确定了 29 个嗅觉区域, 鉴定了 20 种气味活性成分,并发现了其中 10 种含硫的挥发性化合物是气味活性 的贡献者,三甲胺作为 M. sulcatus 海鞘的一种重要的风味化合物,是其鱼腥风味 的主要贡献者。 [20] 2009 年 Zlatanos Spiros 等 对 5 种极少见的地中海海洋动物的近似组分、脂 肪酸含量和氨基酸范谱进行了深入研究,发现 M. sulcatus 海鞘的饱和脂肪酸含量 占全部脂肪酸含量的 62.2% , 而其中含量最多的谷氨酸在每百克冷冻干燥样品中的4 上海海洋大学硕士学位论文 含量为 1.05 ?0.3 g 。 [21]2010 年 Karthikeyan M. M 等 对海鞘 M. exasperates Heller 的营养价值进行 了研究,结果表明干重条件下蛋白质、 碳水化合物和油脂含量为 23.5 ?2.65~17.3 ?2.11% 、14.11 ?2.42~11.15 ?2.12% 和 2.67 ?0.21~2.01 ?0.41% ;对海鞘油脂进行 脂肪酸成分分析时发现饱和脂肪酸 (SAFA ) 、 单一 不饱 和脂 肪酸 (MUFA ) 和多 不 饱和脂肪酸(PUFA )含量为 1.664~0.1110 、1.565~1.034 和 1.786~1.293 mg/g ;含 量最 多的 必需 氨 基酸 和最 少的 非必 需 氨基 酸分 别 是亮 氨酸 和天 冬氨 酸 。同 时, 研 究也 表明 该种 海 鞘的 生物 化学 成分 和 营养 价值 不 仅由 遗传 信息 决定 , 还受 其成 熟 状态和膳食类型影响。 3 、 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘 天然产物研究 的必要性和意义 纵列 属和 小齐 属海 鞘的 化 学成 分结 构类 型以 生 物碱 和神 经酰 胺糖 苷为 主, 体 [10-18] 外测 试表 现出 显著 的细 胞 毒活 性、 抗 病毒 和抗 细胞 增殖 等 生物 活性 ,表明这 些物种具有 潜在 的重 要药 用价 值。 目 前国 内对 纵 列属 海鞘 的天 然产 物 研究 主要 集 中于 其醇 提物 的 活性 筛分 ,研 究发 现 其粗 提物 表 现出 了潜 在的 细胞 毒 活性 和抗 乙 [11-12] 肝病毒的活性 ;其次,国 外学 者对 小齐 属海 鞘 的次 生代 谢产 物进 行了 深入 的 [15-16] 研究,发现了 2 个新的具有抑制细胞增殖活性的化合物 和 4 个结构新颖的神 [17-18] 经酰胺糖苷 。 [1] 通过查阅文献还发现,在中国沿海海域纵列属和小齐属海鞘各有 2 种海鞘 , 而国内尚未有该 2 属海鞘的次生代谢产物报道,尤其是 大洋纵列海鞘和硬突小齐 海鞘 国内 外均 未 见小 分子 次生 代谢 产 物基 础研 究 。 因此 , 很 有 必要 对 中国 产 大洋 纵列 海鞘 和硬 突 小齐 海鞘 资源 开展 系 统 的活性 物 质应 用基 础研究 , 有 望从 中发 现 [22] 与重大疾病相关的活 性成分乃至药 物先导结构 ,因而学术价值较高,具有重要 意 义。 5 上海海洋大学硕士学位论文 第二节 大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘 天然产物 的 提取分离 目前 国内 对大 洋纵 列海 鞘 的天 然产 物研 究主 要 集中 于其 醇提 物的 活性 筛分 , [11,12] 研究发现其粗提物表现出了潜在的细胞毒活性和抗乙肝病毒的活性 , 且国 内外 尚未 有硬 突小 齐 海鞘 天然 产物 研究 的 报道 。为 分 离获 得结 构新 颖活 性 显著 的海 洋 天然产物,在前期工作积累的基础上,开展了该 2 种海鞘的天然产物和生物活性 研究,同时填补了国内外对该 2 种海鞘天然产物研究和开发利用的空白。 1 、材料来源与鉴定 新鲜海鞘分别 于 2008 年 4 月 和 2008 年 6 采自南海大亚湾东山渔村海域,采 集后以大量海水冲洗, -18 ?C 快速 冰冻 , 低温 条件 下运 回实 验室 备 用 。 品种 由国 家海洋局第三海洋研究所郑成兴研究员鉴定,为大洋纵 列海鞘 (S. oceania )和 硬 突小齐海鞘 M. exasperatus 。 标本 保存 于中 国水 产科 学研 究院 东 海 水产 研究 所NoFDZ-200806-DS 和 No. FYT-200804-DS 。 2 、仪器和试剂 2.1 仪器 紫外光谱仪(UV ) :Shimadzu SPD-M20A PDA detector ; 核磁共振波谱 仪 (NMR):Bruker AM-400 spectrometer TMS 内标 ; 电喷 雾 质谱HR-ESI-MS :Waters Q-TOF ultima mass spectrometer Finnigan LCQDECA instrument ; EI-MS :Finnigan MAT95 mass spectrometer ; 半制备高效液相色谱仪(HPLC ) :Shimadazu LC-20AT pump ,SIL-20A auto sampler ,SPD-M20A PDA detector 以及 YMC-Pack ODS-AQ column 25010 mm , S-5 ?m ,12 nm ; 紫外分析仪UV :ZF-I 型三用紫外分析仪 , 上海顾村电光仪器厂; 旋转蒸发器 (RE-2000): 购自上海亚荣生化仪器厂 ; 精密分析天平:XP105 DeltaRange (十 万分 之一 ) ; 电子 天平:FA 2004 型电子天平( :200 g ) ,上海精天电子仪器有限公司 ; 酶标仪(SPECTRA 190 ),Molecular Devices 公司。 2.2 色谱填料和试剂 ODS 反相柱层析硅胶 150-200 目 :Merck 公司; 凝胶 Sephadex LH-20 :Pharmacia Biotech ,Sweden ; MCI gel (CHP 20P,75-150μm):Mitsubishi Chemical Ltd ; 6 上海海洋大学硕士学位论文 大孔吸附树脂(HP-20) :日 本三 菱化 学公 司; LiChrospher RP-18: Merck Chemicals 公司; 层析硅胶和硅胶薄层色谱TLC 预制板(GF254 ) :青 岛海 洋化 工有 限公 司; 玻璃培养皿 : 上海国药集团化学试剂公司 ; 培养基(RPMI-1640 ) :Gibco BRL 公司; 胎牛血清(SH30406.02HI ):Hyclone 公司; SRB (磺酰罗丹明 B ):Sigma 公司; MTT (噻唑兰 ) :Amresco 公司; 溶剂:分析纯(甲醇 ,乙醇,氯仿,乙酸乙酯 等), 上海国药集团化学试剂公 司 ,液相色谱级 (乙 腈, 甲醇 ) ,J&K chemical LTD ; 水:乐百氏纯净水 ,屈臣氏蒸馏水。 3 、大洋纵列海鞘和硬突小齐海鞘化合物的提取与分离 3.1 大洋纵列海鞘化合物的提取( 流 程图见图 1-3) 大洋纵列海鞘湿重 1.3 kg ,剪切成碎片,用甲醇浸提 5 次,每次 3 L ;合并 甲 醇提取液,45 ?C 水浴下真空浓缩回收甲醇溶剂, 得到含大量海盐的总浸 膏。 将总 浸膏以 1.2 L 60 %甲醇水溶液溶解得到悬浊液,石油醚(60 ~90 ?C ,250 mL ?4) 萃取 , 合并 浓缩 石油 醚相 得到 低极 性的 油脂 部分 FDZ-PE 9.7 g ; 甲醇/ 水相减压浓 缩除去甲醇至小体积, 再以水稀释至 600 mL , 用氯 仿萃 取 4 次, 每次 300 mL,氯 仿相浓缩得 FDZ-CL 6.0 g ; 将甲醇层浓缩,去除甲醇后,加入 400 mL 乙酸乙酯 分别萃取 4 次,收集、浓缩得乙酸乙酯萃取物 FDZ-EA1.6 g ; 将剩余水相减压浓 缩得到甲醇粗提物 FDZ-Me6.3 g 。 FDZ-PE 和 FDZ-CL 部位通过进一步分离, 薄层色谱(TLC )检测,发现主要 成分为甾体和脂肪酸 ;从 FDZ-EA 部位分离得到的化合物尚在进行结构鉴定,以 下仅详述甲醇粗提物 FDZ-Me 的分离过程。 7 上海海洋大学硕士学位论文 图 1-3 大洋纵列海鞘提取流程 Fig. 1-3 Extraction procedure of S. oceania 3.2 大洋纵列海鞘甲醇提取物 的分离(流程图见图 1-4) 将 甲醇部位 FDZ-Me2.3 g ,用 MeOH/H O 溶解后, 经 MCI Gel 柱色谱分离, 2 先用 水 1.2 L 洗 脱 除 去 无 机 盐 、 多 糖 和 蛋 白 质 等 大 分 子 化 合 物 ,然后依次以 MeOH/H O 溶液 (20:80?30:70?45:55?60:40?80:20?100: 0 ,v/v,共 6 L ) 梯度 2 洗脱, 按照薄层色谱(TLC ) 检测结果分段浓缩,得到 Me-I ~V 。 向 Me-I 中加 200 mL 正丁醇萃取 2 次,回收有机相,合并入 Me-II 浓缩得 1.1 g ,然后经葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 色谱柱,70%EtOH/H O 溶液洗脱,洗脱液 2 根据 薄层 色谱 (TLC ) 检测结果 合并 、 浓缩 , 得到 Me-IIa 和 IIb 。Me-IIa 经半制备 高效 液相 色谱 (semi-preparative HPLC ) 反复 制备 纯化 , 以 20 %0 min ?35 %10.0 min ?70 %22.5 min ?70%27.0 min ?20%27.5 min 的 乙腈/0.1% 三氟乙酸水 -1 溶 液洗 脱, 流速 2.5 mL? min , 在液 相 14.53 min 和 17.45 min 出峰 , 收集 得 到化合 物 FHQ-04 和 FHQ-5 。 Me-III (0.7 g )上 RP-C 反相柱 色谱分离 ,ACN/H O 溶液梯度洗脱(20 : 18 2 80?27:73?35 :65,v/v,共 1800 mL),HPLC 检测 分析 , 得到 Me-IIIa 、Me-IIIb , Me-IIIb 经 HPLC 反复制备 纯化 , 以 25%0 min ?42 %12.0 min ?75%24.0 min ?75 %29.0 min ?20 %29.5 min 的 乙腈/0.1% 三 氟 乙酸 水 溶 液 洗脱 , 流速 2.5 -1 mL? min ,在液相 21.60 min 出峰,得到化合物 FHQ-03 。 Me-IV ( 1.7 g ) 上 正 相 硅 胶 柱 色 谱 分 离 , CHCl /MeOH 梯度洗脱 3 (30:1?20:1?15:1?12:1?8:1 ,各 500 mL ) ,得 到 Me-IVa ~IVe ,Me-IVb 经半制8 上海海洋大学硕士学位论文 备 HPLC 纯化, 以 18 %0 min ?33%11.0 min ?60 %20.0 min ?60%25.0 min -1 ?20 %25.5 min 的乙腈/0.1% 三氟乙酸水溶 液洗 脱, 流速 2.5 mL? min , 在液 相 11.25 min 出峰, 得到 化合 物 FHQ-02。 Me-IVc 经半制 备 HPLC 纯化 , 以 23%0 min ?45 % 15.0 min ?70%19.0 min ?70 %24.0 min ?20%24.5 min 的乙腈/0.1% 三 氟乙 -1 酸水溶液洗脱,流速 2.5 mL? min , 在液相 15.08 min 出峰,纯化, 最终得到化合 物 FHQ-01。 图 1-4 甲醇部位分离流程 Fig. 1-4 Isolation procedure of MeOH extract 3.3 硬突小齐海鞘化合物的提取( 流 程图见图 1-5) 硬突小齐海鞘湿重 1.8 kg ,剪切成碎片,用甲醇浸提 6 次,每次 3 L ;合并甲 醇提取液,45 ?C 水浴下真空浓缩回收甲醇溶剂, 得到含大量海盐的总浸膏。 将总 浸膏 用 600 mL20% 甲醇水溶液溶解得到悬浊液,用氯仿萃取 5 次,每次 400 mL , 氯仿相浓缩得 FYT-CL 13.5 g ; 将甲 醇层 浓缩 , 去除 甲醇 后, 加入 450 mL 乙酸乙 酯分别萃取 4 次, 收集 、 浓缩 得乙 酸乙 酯萃 取物 FYT-EA25.0 g ; 将剩余水相减压 浓缩得到甲醇粗提物 FYT-Me7.8 g 。 从氯仿部位 FYT-CL 分离得到的化合物尚在鉴定中, 以下仅详述 乙酸乙酯萃取 物 FYT-EA 和 甲醇粗提物 FYT-Me 的分离过程。 9 上海海洋大学硕士学位论文 图 1-5 硬突小齐海鞘提取流程 Fig. 1-5 Extraction procedure of M. exasperatus 3.4 硬突小齐海鞘化合物的分离 3.4.1 硬突小齐海鞘甲醇提取物的分离 ( 流程图见图 1-6) 将 甲醇部位 FYT-Me7.8 g ,用 MeOH/H O 溶解后, 经 MCI Gel 柱色谱分离, 2 先用 水 1.2 L 洗 脱 除 去 无 机 盐 、 多 糖和蛋白 质 等 大 分 子 化 合 物 ,然后依次以 MeOH/H O 溶液 (20:80?40:60?60:40?80:20?100: 0 ,v/v,共 5 L ) 梯度 洗脱, 按 2 照 薄层色谱(TLC ) 检测结果分段浓缩,得到 Me-I ~V 。 Me-II0.5 g 上 正 相 硅 胶 柱 色 谱 分 离 , CHCl /MeOH 梯度洗脱 3 (10:1?8:1?6:1?4:1, 分别为 250 、200 、200 、250 mL ) 得到 Me-IIa ~IIe ,Me-IIe 与 Ac O/Py48h ,常温 进 行 乙 酰 化 反 应 , 后 经 半 制 备 高 效 液 相 色 谱 2 (semi-preparative HPLC )反复制备纯化 ,以 17 %0 min ?30 %12.0 min ?70 % 21.5 min ?70%27.0 min ?17 %27.5 min 的乙腈/0.1% 三氟乙酸水溶 液洗 脱, 流 -1 速 2.5 mL? min , 在液 相 17.80 min 和 17.00 min 出峰 , 收集 得到化合物 FHQ-03 和 FHQ-04。 Me-III0.6 g 经葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 色谱柱, 70%EtOH/H O 溶液洗脱, 2 洗脱液根据薄层色谱(TLC )检测结果合并 、浓缩,得到 Me-IIIa 和 IIIb。Me-IIIa 经半制备高效液相色谱(semi-preparative HPLC )反复制备纯化 , 以 25 %0 min ?35 %9.5 min ?65 %23.5 min ?65%28.0 min ?20%28.5 min 的 乙腈/0.1% -1 三氟乙酸水溶 液洗脱,流速 2.5 mL? min ,在液相 14.60 、29.00 min 出峰,收集 得 到化合物 FHQ-05 和 FHQ-06 。 Me-IV 经葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 色谱柱,70%EtOH/H O 溶液洗脱, 洗脱 210 上海海洋大学硕士学位论文 液 根据薄层色谱(TLC )检测结果 合 并、 浓缩 , 得到约 0.1 g 样品,后上正相硅胶 柱色谱分离 , CHCl /MeOH 梯度 洗脱 (15:1?12:1?10:1, 分别为 150 、 200 、 250 mL ) , 3 根据薄层色谱(TLC )检测 结果,杂点样品同 Me-V 一起合并 至 FYT-EA 。 图 1-6 甲醇提取物分离流程 Fig. 1-6 Isolation procedure of MeOH extract 3.4.2 硬突小齐海鞘乙酸乙酯提取物的分离 ( 流程图见图 1-7) 向乙酸乙酯部位 FYT-EA (25.0 g ) 中加 入 60 g 硅胶 粉 (200 ~300 目) , 拌样 , 干法 装柱 , 以 PE/EA 溶液 (1:0?16:1?10:1?8:1?4:1?2:1?1:2,共 8 L ) 梯度 洗 脱,得到 EA-I ~X 。 将 EA-V0.2 g 上 RP-C 反相柱色谱分离 ,MeOH/H O 溶液梯度洗脱(25: 18 2 75?30:70?40 :60,v/v ,共 1500 mL ) ,得 到 EA-Va ~Vc ,EA-Vc 上正相硅胶柱 色谱分离 ,DCM/EtOAc 梯 度洗 脱(12:1?10:1?8:1,各 500 mL), 得 到化 合物 FHQ-07。 将 EA-VI0.3 g 上 RP-C 反相柱色谱分离 ,MeOH/H O 溶液梯度洗脱(27: 18 2 75?35:70?45 :55,v/v,共 1200 mL ) , 得到 EA-VIa 、VIb , 根据 薄层 色谱 (TLC ) 检测结果,分别合并至 EA-Va 和 EA-Vc 。 EA-VII 经葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 色谱柱,无水 EtOH 洗脱,洗脱液 根据 薄层色谱(TLC )检测结果合并 、浓缩 , 得到 EA-VIIa ~VIIc ;将 EA-VIIa 上正相 硅胶柱色谱分离 ,CHCl /MeOH 梯度洗脱(100:0?80:1?60:1 , 分别为 100 、80 、 311 上海海洋大学硕士学位论文 90 mL), 得到 EA-VIIa1 和 EA-VIIa2 ; EA-VIIa1 上 正 相 硅 胶 柱 色 谱 分 离 , DCM/EtOAc 梯度 洗脱 (16:1?12:1?10:1,各 300 mL), 得到 EA-VIIa1a ~VIIa1d ; EA-VIIa1a 经半制备高效液相色谱 (semi-preparative HPLC ) 反复 制备 纯化 , 以 25 % 0 min ?37%11.5 min ?75 %19.5 min ?75 %26.0 min ?25%27.5 min 的 乙 -1 腈/0.1% 三氟乙酸水溶液洗脱,流速 2.5 mL? min ,在液相 10.80 min 出峰,收集 得 到化合物 FHQ-10;EA-VIIa1d 经半制备高效液相色谱(semi-preparative HPLC ) 反复制备纯化 ,以 40 %0 min ?70 %15.0 min ?100 %22.5 min ?100 %27.0 -1 min ?40 %28.0 min 的 乙腈/0.1% 三氟乙酸水溶 液洗脱,流速 2.5 mL? min ,在液 相 12.20 min 出峰,收集 得到化合物 FHQ-08 。 EA-X1.0 g 经葡聚糖凝胶 Sephadex LH-20 色谱柱, 无水 EtOH 洗脱, 洗脱液 根据薄层色谱(TLC )检测 结果 合并 、浓缩 ,得到 EA-Xa ~Xc ;EA-Xc 经半制备 高效 液相 色谱 (semi-preparative HPLC ) 反复 制备 纯化 , 以 30 %0 min ?50 %14.0 min ?75 %23.0 min ?750 %28.0 min ?30%28.5 min 的 乙腈/0.1% 三氟乙酸水 -1 溶 液洗脱,流速 2.5 mL? min ,在液相 18.80 min 出峰,收集得到化合物 FHQ-09。 图 1-7 乙酸乙 酯提取物分离流程 Fig. 2-5 Isolation procedure of EA extract 4 、天然产物肿瘤细胞毒活性测试为了 筛查 分离 得到 的天 然 产物 的 生 物活 性, 且 近年 来从 海鞘 中获 得的 天然 产12 上海海洋大学硕士学位论文 物生 物活 性研 究 热点 之一 便是 抗肿 瘤 活性筛选, 我们选择 较为常见的 肿瘤细胞株 Bel-7402 和 K562 作为本次活性测试的对象。 4.1 生物材料和试验样品 肿瘤细胞毒性试验的供试细胞株见表1-1。 表1-1 细胞来源及类型 Table 1-1 Experimental Cell Strain 接种密度 细胞株 来源 组 织学来源和类型 培养条件 /mL 4 Bel-7402 5 ×10 含 10%FBS 的RPMI-1640 细胞所 人肝癌细胞 4 K562 ATCC 人慢性粒细胞白血病细胞 5 ×10 含 10%FBS 的 RPMI-1640 注:ATCC: American Type Culture Collection 提取物FHQ-03~06 、FHQ-09 和FHQ-10, 分别 用 DMSO 溶解 , 配成 20mM 的 溶液,-20 ?保存,使用时用不含血清的培养液配成所需浓度,作为抗肿瘤细 胞毒 测试样品,阳性对照化合物 阿霉素ADR 。 4.2 肿瘤 细胞株的细胞 毒 性实验方法 细胞与不同浓度化合物温育 72 小时,采用 SRB 、MTT 法化合物对细胞 增殖的抑制程度, 计算抑制率, 根据抑制率采