1.穴居狼蛛毒素lystoxin Ⅱ的结构与功能研究 2.非洲

1.穴居狼蛛毒素lystoxin Ⅱ的结构与功能研究 2.非洲 1.穴居狼蛛毒素lystoxin ?的结构与功能研究 2.非洲 1.穴居狼蛛毒素lystoxin ?的结构与功能研究 2.非洲 第一部分穴居狼蛛毒素lystoxin?的结构与功能研究使用羧甲基阳离子交换色谱和反相色谱相结合的方法，从采自新疆的穴居狼蛛(Lycosa singoriensis)的毒液中分离到一个细胞毒性肽，命名为Lystoxin?。Lystoxin?约占毒液干重的1,。经MMALDI-TOF MS鉴定，Lystoxin?的分子量为733 5.35Da。Lystoxin?由65个氨基酸残基组成，其C端是酰胺化的。通过Edman降解测序测得N端的33个氨基酸残基的序列，并以测得的序列设计引物，采用RACE方法进行cDNA克隆，确定Lystoxin?的氨基酸序列为: KECIPKHHECTSNKHGCCRGNFFKYKCQCTTVVTQDGEQTERCFCGTPPHHKAAELVVG FGKKIF-NH2。其cDNA开放阅读框编码107个氨基酸的毒素前体肽，此前体肽包括20个氨基酸残基组成的信号肽序列，21个氨基酸残基组成的Pro区域和65个氨基酸残基组成的成熟肽，还包括一个在发生C端的酰胺化反应后去除的氨基酸残基Gly。lystoxin?是一个碱性多肽，理论值为 8.69。生物信息学分析显示，与lystoxin?氨基酸序列相似度最高的两个肽是CSTX-1和CSTX-9，lystoxin?的8个cys均参与分子内二硫键的形成，形成四对二硫键。二硫键的配对方式可能与CSTX- 1、CSTX-9一致，按C1-C4;C2-C5;C3-C8;和C6-C7形成二硫键，是一种ICK(抑制剂半胱氨酸结)模体的结构。在50μM的浓度下，Lystoxin?可以造成非洲爪蟾卵母细胞漏电流的急剧增大。在100μM的浓度下，Lystoxin?可使42,的人红细胞溶解。用MTT法检测，Lystoxin?对Hela细胞生长的半有效抑制浓度()IC_(50)为2 2.0μmol,L。对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌进行了抗菌实验，结果发现在1 2.5-50μM浓度范围内Lystoxin?对本文所测试的细菌的生长没有明显的抑制作用。第二部分非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳技术的建立非洲爪蟾的卵母细胞可以高效、忠实地达外源的基因并能将亚基装配成受体或通道，然后将受体或通道整合到细胞膜上。这些整合 在细胞膜上的受体或者通道可以产生可兴奋的电生理反应，从而成为一种有力的分子神经生物学研究手段。现在，已经能在卵母细胞上表达许多离子通道、离子泵和受体，因此，卵母细胞也成为研究编码离子通道、离子泵和受体基因的工具。将从组织中提取的mRNA或者从cDNA体外转录的mRNA显微注射到卵母细胞内，卵母细胞的蛋白质合成系统将mRNA翻译为蛋白质，这些蛋白质合成后被整合到细胞膜上。运用这种方法，人们已经成功地将许多种类的配体门控离子通道和电压门控离子通道在卵母细胞上表达。一旦配体门控离子通道或电压门控离子通道在卵母细胞上表达，就可以用电生理或生物化学的方法来进行研究。这比直接用神经元细胞作为实验材料的难度大大降低了。本实验室建立起卵母细胞(电压钳系统，就可以研究毒素对离子通道的亚型的作用，从而把毒素对离子通道的作用研究推向深入。 缩写表3-5中文摘要5-8Abstract8-12第一部分 穴居狼蛛毒素lystoxin?的结构与功能研究12-72第一章 节肢动物的抗菌肽与细胞毒性肽研究进展12-36 1. 前言12-14 2. 节肢动物血淋巴中的抗菌肽14-16 3. 节肢动物毒液中的抗菌肽与细胞毒性肽16-30 4. 来自血淋巴与来自毒液的抗菌肽的相似性与差异30-31 5. 为什么毒液中会有细胞毒性肽?31-34 6. 结论34-36第二章 穴居狼蛛毒素lystoxin ?的分离、鉴定、cDNA克隆、表达与生物学功能研究36-72 1. 前言36-38 2. 材料和试剂、仪器38-39 3. 方法39-59 4. 结果与分析59-70 5. 结论70-71 6. 进一步研究设想71-72第二部分 非洲爪蟾卵母细胞双电极电压钳技术的建立72-97 1. 前言72-75 2. 材料、试剂与仪器75-77 3. 方法77-83 3.1 对包含通道基因的质粒进行扩增77 3.2 对包含通道基因的质粒进行线性化77-79 3.3 体外转录获得信使RNA79-81 3.4 获得卵母细胞81-82 3.5 将信使RNA显微注射到卵母细胞中82 3.6 电压钳记录离子通道电流82-83 4. 结果与分析83-86 4.1 滤泡膜上的酸敏感离子通道电流83 4.2 表达的Kv 2.1通道电流83-86 5. 讨论86-97论文发表97-98致谢98-99