阿托品对中国仓鼠V79细胞有丝分裂过程的影响

阿托品对中国仓鼠V79细胞有丝分裂过程的影响 Carcinogenesis Teratogenesis and Mutagenesis Vol 11 No 3 1999 癌变〃畸变〃突变 1999 年第 11 卷第 3 期 ?阿托品对中国仓鼠 V79 细胞有丝分裂过程的影响 和智君 汪 旭 云南师范大学生命科学系 昆明 650092 摘要 本研究以毒蕈碱型乙酰胆碱受体抑制剂阿托品在离体情况下作用于中国仓鼠 V细胞 ,通过分析 V细胞晚末期和早 79 79 G期细胞核与细胞质构型 、双核细胞频率 ,探讨了阿托品对哺乳动物离体细胞正常有丝分裂过程的影响 。结果发现 ,阿托品1 使 V细胞的晚末期 —早 G期细胞核和细胞质分裂构型发生显著变化 、双核细胞的频率显著提高 ,提示阿托品可能通过 M 79 1 型胆碱受体阻断过程而对哺乳动物有丝分裂真实性产生影响 。胆碱受体的功能异常可能为非整倍体发生的诱因之一 。 关键词 中国仓鼠 V细胞 ;阿托品 ;有丝分裂 ;非整倍体 79 C HI NESE HAMSTER STUDY OF M ITOTIC EFFECTS OF ATROPI NE I N V 79 CELLS He Zhijun , Wang Xu De p a rt m en t of L i f e S ciences , Y u n n a n N or m al U ni ve rsi t y , Ku n m i n g 650092 Abstract VChinese hamster cells were t reated i n v i t ro by at ropine sulf ate , w hich is an antago nist to cholin2 79 ergic recep to rs and inhibito r of muscarinic recep to r . The alteratio n of late telop hase2early Gco nfiguratio n in2 1 duced by at ropine were deter mined by analyzing p resent o r lack of a cyto kinesis f urrow in late telop hase and very early Gcells , The abno r mal cyto kinesis were investigated fo r t he f requency of binuclear cells in interp hase cells. 1 The tested chemical dist urbed mitotic coo rdinatio n and induced significantly high f requency of binuclear cells. The result indicated t hat at ropine is able to inhibit mammal mito sis by blocking t he f unctio n of cholinergic recep2 to r . The malf unctio n of cholinergic recep to rs may be a mechanism of aneuploid inductio n . Key words VChinese hamster cell ; at ropine ; mito sis ; aneuploidy 79 () 3V细 胞 可 产 生 大 量 的 乙 酰 胆 碱中 国 仓 鼠 胆绞痛 , 抗休 克 和 有 机 磷 中 毒 等 病 症 。本 文 在 离 79 () Acet ylcholine。已有研究指出 , 乙酰胆碱及其受体 体情况 下 用 阿 托 品 处 理 具 有 乙 酰 胆 碱 合 成 能 力 的(1) 参与了细胞质分裂的调控 。如果乙酰胆碱及其受 V 细胞 ,通过分析 V 细胞晚末期和早 G 期细胞核 79 79 1 体介导的信号对细胞质分裂是至关重要的 ,阻断这些 和细胞质构型 、双核细胞频率 ,探索乙酰胆碱及其受 受体将导致双核细胞的发生 。双核细胞在继后的细 体在哺乳动物细胞有丝分裂过程中的作用 。 细胞松胞分裂中易于导致异常纺锤体功能 ,质裂的抑制 ,因 ( ) 驰素 B Cytochalasin B , CB是真菌的一 此构成了细胞染色体异常分离的风险 。 材料与方法次 ,然后加入 4 ml Hank’s 平衡盐溶液并按剂量加入 1 受试物 :硫酸阿托品购自 Sigma 公司 ,用前以无菌 受试药物 ,37 ?处理 2 h 。 μμ双蒸水溶 解 , 受 试 剂 量 分 别 为 5 . 8g/ ml 和 2 . 9g/ 213 制片 :将处理后的细胞以 0 . 125 %的胰酶消化 ml ,分别设溶剂对照和阳性 对 照 。阳 性 对 照 物 细 胞 脱壁 , 800r/ min 离心 3 min ,弃上清液 ; 3 ?1 无水乙醇 松驰素 B 购自 Sigma 公司 , 用前以无菌 10 %DM SO —冰醋酸固定液固定 10 min ,800r/ min 离心 3 min ,将 μμ 溶解 ,受试剂量分别为 3g/ ml 、1 . 5g/ ml , 10 %DM2 单细胞悬 液 滴 于 冷 冻 载 片 上 , 室 温 干 燥 , 4 % Giemsa SO 为相应溶剂对照 。染色 8 min 。 2 方法 :214 镜检 21411 末期 —G期细胞核和细胞质构型分析 : 每一 211 细胞培养 : V中国仓鼠成纤维细胞购自中国科 1 79 学院上海细胞生物学研究所细胞库 。细胞以含 20 % 样本检测 100 个染色质进入晚末期 —早 G细胞 ,并 1 μ 根据染色质浓缩程度及胞质分裂的协调情况将其分新生牛血清 、100g/ ml 双抗 、p H6 . 9 的 M EM 培养液 6 (( ) ) 37 ?培养 。实验前 24 h 在 25 ml 培养瓶接种 10细胞 为异常 图 1a - c和正常 图 1d - f 构型 。晚末期细 进行单细胞培养 。 胞具有质裂绉 、早 G期细胞胞质完全分裂视为正常 1 构型 。 212 细胞染毒 : 将培养细胞中培养液移弃 , 用 37 ? ( ) 预热的 Hank’s 平衡盐溶液 Ph6 . 9 ,37 ?荡洗细胞 2 图 1 a - c :异常构型细胞 。a :细胞无质裂绉但具有已分裂的晚末期细胞核 ; b :细胞无质裂绉但二极具有去凝聚的 G1 期样细胞 核 ;c :细胞具质裂绉和二极去凝聚的 G1 期样细胞核 ; b - f :正常构型细胞 。d :正常末期细胞 ; e : 具有末期样染色质 、已质裂的 早 G1 细胞 ;f :具有早期样染色质 、已质裂的早 G1 细胞 。 The alterat ion of telopha se/ G1 conf igura2 弱于细胞松弛素 B 。Ta ble 1 t ion in V79 treated with chemical s ( treatment inter2 讨 论 val : 2 h ; No. of scored cell s per group :100) Chemical Do se Catego ries of co nfiguratio n 据报道 ,乙酰胆碱及其受体参与了细胞质裂的调 (1) ()( )Abno r mal a - c Sum. No r mal d - e Sum. 控 。鉴于细胞 质 裂 的 异 常 尤 其 质 裂 的 抑 制 , 将 导 (μ)a b c d e f g/ ml 致双核细胞的产生 ,而双核细胞在继后的细胞分裂中 3 3 C B 3 47 27 17 3 4 2 9 91 易于导致异常纺锤体功能 。因此质裂的抑制 ,构成了 31 . 5 16 . 13 13 11 22 25 58 42 细胞染色体异常分离的一种诱发因素 。乙酰胆碱及 10 %DMSO 3 6 19 22 16 34 72 28 其受体功能的正常发挥 ,是否是保证细胞有丝分裂尤 3 3 At ropine 5 . 8 10 10 18 24 38 10 62 38 其染色体正常分离的机制之一 ? 也就是说 ,乙酰胆碱 3 3 sulfate 2 . 9 6 5 26 33 25 5 63 37 及其受体功能的异常是否会导致双核细胞产生进而 0 2 2 12 16 41 27 16 84 诱发非整倍体 ? 这一问题是本研究的核心 。 2 阿托品是一类 M - 胆碱受体阻断药物 , 其是乙 χ)( 3 P < 0 . 05 , 3 3 P < 0 . 001 Yates校正测验 酰胆碱及其他胆碱类化合物受体的拮抗 剂 ,在临床 上主要有解除平滑肌痉孪 ,抑制腺体分泌 ,扩大瞳孔 , Ta ble 2 The result of cytokinesis exa minat ion in V79 兴奋呼吸中枢等功效 。本研究通过该化合物对 M 受 treated with chemical s 体的阻断作用及其所引起的各种异常有丝分裂效应 , Chemical Do se No . of sco red Binuclear (μ) ( ) g/ mlint erp hase % 初探了乙酰胆碱及其受体在 V细胞正常分裂中的 79 3 3C B 3 1 000 6 . 6 作用 。研究发现 , 阿 托 品 处 理 能 够 合 成 乙 酰 胆 碱 的 3 31 . 5 1 000 5 . 3 V细胞后 ,细胞出现质裂抑制的一系列典型特征 ,即79 末期细胞无质裂绉 、早 G期仅出现质裂绉而未完成 1 10 %DMSO 1 000 1 . 6 质裂等细胞构型改变 、双核细胞频率提高 。证明乙酰 3At ropine 5 . 8 1 000 1 . 6 胆碱及其受体在维持正常质裂 、保证有丝分裂的真实 3sulfate 2 . 9 1 000 2 . 2 性上具有积极的作用 。结果同时提示该途径是体细 0 1 000 0 . 6 胞非整倍体产生的可能机制之一 。 2 χ)( 3 P < 0 . 05 , 3 3 P < 0 . 001 Yates校正测验 参考文献 μ如表 1 所示 ,在 3g/ ml 的剂量时 ,细胞松驰素 B 1 Onfelt A , So derpalm2Berndes C , Wiberg K. Antago nistes to choliner2 能极显著地诱发 V细胞中异常构型即 a - c 类细胞 79 gic recepto rs increase t he f requency of binuclear m in VChinese ham2 ( μ) 产生 P < 01001 ; 在 1 . 5g/ ml , 该 化 合 物 也 具 有 同 79 ster cells. A mechanism fo r inductio n of aneuploidy. M ut at Res , ( ( μ) ) 样效应 P < 0105。阿托品在高剂量 5 . 8g/ ml时 , 1992 ;281 :267 ( 所 诱 发 的 异 常 构 型 细 胞 显 著 高 于 溶 剂 对 照 P <张德成 1 动力细胞受体学基础 1 北京 : 中国农业出版社 , 1996 : 74 2 ) ( μ) 01001,在低剂量 2 . 9g/ ml时 ,异常构型细胞也显 - 84 周永自 , 王世祥 1 新编药物手册 1 第二版 1 北 京 : 金 盾 出 版 社 , ( ) 著增加 P < 0105。由表 2 得知细胞松驰素 B 在受 3 1992 :140 - 142 试剂量范围内 ,使 V间期细胞中的双核细胞频率显 79翟中和 1 细胞生物学 1 北京 :高等教育出版社 ,1996 :243 - 244 4 ( ) 著提高 P < 01001;阿托品在受试剂量范围内 ,也表 ( ) 1998 - 10 - 12 收稿 ;1999 - 03 - 01 修回( ) 现了显著的诱发 V双核细胞的能力 P < 0105,但 79