相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究

相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的 研究 中山大学 博士学位论文 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 姓名:李嘉丽 申请学位级别:博士 专业:药理学 指导教师:黄民 20100602相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司 个体化用药的研究 业: 专 药理学 博士研究生: 李嘉丽 导 师: 黄 民教授 摘要 据最新统计,目前国内大约有万名终末期肾病患者,并以每年./ 万的发生率在增长,而肾移植是治疗肾衰竭的最有效的方法,但发生排斥反 应是 导致肾移植失败的主要原因,因此免疫抑制剂能否合理应用成为左右肾移植预后 的关键。 他克莫司,是目前防治肾移植术后免疫排斥反应的一线 免疫抑制剂,然而治疗窗窄、药动学个体差异大一直是困扰该药临床用药的难题。 目前临床上虽然进行常规的治疗药物监测 ,, 根据血药浓度来调整用药剂量,但其最大的弱点是滞后性,部分患者在监测前就 出现血药浓度过低或过高导致的不良反应,这对于移植术后初期的患者尤为危 险。 因此找出他克莫司药动学个体差异大的产生原因,实现他克莫司的个体化 应用,才是解决该问题的关键。 同时,他克莫司价格昂贵,终身服用给患者造成了沉重的经济负担,因此也 制约了它的使用,地尔硫卓常作为其节约剂在临床上配伍使用,而我们在临床观 察中也发现合用中药护肝药五酯片每片含五味子酯甲. 能显著提高他克 莫司浓度,有望成为新一代的节约剂。因此,如能从遗传药理学与合并用药两个 方面考虑他克莫司的个体化用药,以制定他克莫司的剂量预测方程,将有可 能实 现他克莫司安全、有效、经济的个体化用药。目前国内外仍未有类似的报道。 多年的研究表明%~%的药物反应和处置的个体差异是由遗传因素引相关基因 多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 起的。目前国内外有关他克莫司的个体化用药研究主要集中在药物代谢酶 、及转运蛋白.,由基因编码的遗传多态性上, 然而目前结论比较一致的只有与他克莫司浓度密切相关。虽然 幸也被证明与他克莫司药动学相关,但是中国人群中并未发现该突变, 因此该突变不可能是造成中国人他克莫司药动学差异大的主要原因。而 基因多态性的影响则仍无定论。是新近发现的在中国人群 基因中发生频率最高的单核苷酸多态性 ,, 国内有研究发现其与酶活性升高相关,因此该位点也可能与他克莫司 药动学相关。 此外,近年来,核受体作为关键的转录调控因子在药物代谢酶及转运蛋白的 表达调控中所起的重要作用逐渐被认识。其中,孕烷受体 , ,由基因编码被发现能同时调控/、的表达。因 此的基因多态性也可能通过影响/、的表达从而间接 影响他克莫司的药动学。 目前国内外有关、、的基因多态性的特点和发生频 率的研究较为系统,在不同种族都有较为详尽的报道。但对于基因多态 性目前只有针对非裔美国人和高加索人的研究资料,无完善的亚洲人/中国 人的 相关研究,而且从目前的研究结果可知 的突变种族差异极大。 综上,本课题将首先对中国健康人群 基因的进行筛查,并对位 于关键区域的进行功能研究,随后将根据文献与本课题前期研究结果确定 在肾移植患者中各个基因待研究的位点,通过回顾性研究综合分析、 、、的基因多态性及合并用药地尔硫卓、五酯片与他 克莫司浓度的关系,筛选出有统计学意义的影响因素,建立剂量预测方程,并通 过临床应用进行验证,希望能在首次给药前制订出最适合该患者的给药,使 血药浓度尽早达到治疗窗,从而降低患者由于多次剂量调整导致浓度波动而产生 的风险,实现他克莫司的个体化应用。 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 第一部分/基因多态性研究 目的: 研究中国健康汉族人/的基因多态性,并对位于关键调控区域的 进行功能研究。 方法: 采用.直接测序法,对 基因的、、各外显子及近端 内含子的已知与未知的进行筛查:采用报告基因的方法检测两个位于启动 子关键调控区域的的功能。 结果: .在中国健康汉族人群基因中共发现种,突变频率为.%..%。 经检验,这些基因型均符合?平衡。一与为新发 现的。的发生频率与高加索人及非裔美国人存在显著的种族差异。 ..与.位于基因启动子的关键调控区域。. .重组质粒荧光素酶活性比野生型重组质粒高.%阄., .重组质粒荧光素酶活性比野生型重组质粒高.% .。 结论: 中国健康汉族人群的基因中共发现个,其中位于基因 启动子关键调控区域的.与.能使自身转录表达增强。中国健 康汉族人群 的的种类及发生频率与高加索人及非裔美国人存在显著 的种族差异。 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 第二部分全血中他克莫司的//分析方法的建立与 肾移植患者药动学研究 目的: 建立并验证他克莫司的质谱检测方法,并应用于肾移植患者药动学研究中。 方法: .建立他克莫司检测的质谱方法、液相方法及全血样本的萃取方法。 .进行全面的方法学验证:包括方法的精密度、准确度、线性及最低检测限、 稳定性及基质效应等。 .研究地尔硫卓对他克莫司药动学的影响。 结果: .建立了他克莫司的//的检测方法。萃取方法以子囊霉素为内标,两 步蛋白沉淀后,以乙酸乙酯为萃取剂。质谱条件为:离子源,正离子扫描及 / .?.他克莫司 选择多反应监测模式,监测离子为: 和/ ..子囊霉素。液相条件:分离柱为 . 乙酸铵 ,..,, ,,流动相为甲醇/水含 。 ,/,流速为肚,/。色谱保留时间为 .他克莫司的线性范围为.? /。萃取回收率为..%.他克莫司的 日内及日间精密度、准确度、稳定性的及偏离度均小于%,符合生物样 本检测的要求。 .地尔硫卓可以提高他克莫司的浓度,非地尔硫卓组与地尔硫卓组他克莫司 与均较好,相关系数分别是.尸.与..。 结论: 建立了//分析方法检测人全血中他克莫司浓度,该方法灵敏、特 异、可靠、快速,并成功应用于他克莫司一地尔硫卓药物相互作用试验。合 用地 尔硫卓可以提高他克莫司的浓度,并且与的相关性仍较好。 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 第三部分相关基因多态性及地尔硫卓与早期肾移植患者他克莫 司浓度的相关性研究 目的: 回顾性研究遗传因素、、及基因多态性 及地尔硫卓对他克莫司浓度的影响,为实现他克莫司的个体化给药提供依 据。 方法: 采用.法检测、及基因多态性,采用 直接测序法检测基因多态性,术后第七天全血谷浓度为临床 数据,分析各基因型及地尔硫卓与他克莫司浓度的相关性。 结果: .使用地尔硫卓的患者的他克莫司剂量校正谷浓度显著高于不合用地尔硫卓 者 .。 .无论是否合用地尔硫卓,非表达型木产型患者他克莫 司剂量校正谷浓度显著高于表达型幸严型及/型患者砌.。 .多重回归分析发现枣产基因型、地尔硫卓与他克莫司剂量校正谷浓 度相关。 .以基因型分层后发现,在非表达型患者中,宰产 基因型、 基因型与”盯单倍型组合与他克莫司剂量校正谷浓 度正相关,./基因型与他克莫司剂量校正谷浓度负相 关;然而在表达型者中, 佴单倍型组合却与他克莫司剂 量校正谷浓度负相关。 .基因型对他克莫司一地尔硫卓相互作用程度有影响,表达 型患者对地尔硫卓提高他克莫司浓度的作用更敏感。 结论: 基因型与他克莫司浓度密切相关,且与、 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 、之间存在基因型相互作用。地尔硫卓能显著提高他克莫司浓度, 影响程度受幸基因型影响。可根据幸及地尔硫卓构建他克莫 司剂量预测方程。 第四部分五酯片对表达型患者他克莫司药动学的影响 目的: 本部分研究将以表达型患者作为研究对象,以地尔硫卓作为阳性 对照,比较五酯片和地尔硫卓对他克莫司药动学的影响情况。 方法: .例经鉴定为表达型的肾移植患者在服用他克莫司至两周待血药浓 度到达稳态后随机分为地尔硫卓组与五酯片组,每组各例。 .在试验第天,在给他克莫司前 和给药后.,,.,,,,, , 取血。之后合用地尔硫卓 ,每天三次或者五酯片. ,每 天三次,合用两周后即试验第天进行第二次取血,取血时间点同试验第 天取血。全血中他克莫司浓度采用//法检测。 结果: .与合用地尔硫卓前相比,他克莫司的平均/、/和. / 分别提高了.%.、.%:.和.%.,而他克 莫司的平均每日剂量降低了.%.。与合用五酯片前相比,他克莫司 分别提高了.%尸.、 的平均/、咖/和 .%氏.和.%氏.,而他克莫司的平均每日剂量降低了.% .。 .在五酯片组,合用五酯片前后他克莫司与的相关系数分别为. .与..。 结论: 五酯片能显著影响表达型患者他克莫司的药动学,降低他克莫司 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 的用量,且五酯片的作用较地尔硫卓更显著。合用五酯片时他克莫司与 相关性仍较好。 第五部分基因型联合地尔硫卓/五酯片干预他克莫 司用药的前瞻性研究 目的: 通过前瞻性研究,验证结合基因型及地尔硫卓/五酯片预测剂量 的他克莫司给药方案。 方法: .试验分组 地尔硫卓组 肾移植患者术前进行基因型检测,表达型与非表达型患 者各例,随机分入试验组与对照组,试验组与对照组各含表达型及 非表达型患者各例。试验组合用地尔硫卓,采用方程预测剂量给药;对照组不 合用地尔硫卓,采用常规剂量给药.. /,。 五酯片组 肾移植患者术前进行基因型检测,例表达型患者随 机分为试验组与对照组,每组各例。试验组合用五酯片,他克莫司每次剂量 为临床最低剂量. /;对照组采用常规剂量给药。 .评价指标: 他克莫司起始剂量仅五酯片组、首剂他克莫司稳态谷浓度、首剂稳态谷 浓度超出治疗窗的比例、达治疗窗前剂量调整次数、达治疗窗时他克莫司所 需剂 量、术后两周内的急性排斥发生率及术后两周第天的血肌酐水平。 结果: .地尔硫卓组:对于表达型患者,与对照组比较,试验组中首剂他克 莫司稳态谷浓度显著升高,首剂稳态谷浓度超出治疗窗的比例显著降低、达 治疗 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 窗前剂量调整次数显著减少、达治疗窗时他克莫司所需剂量显著降低。两组间术 后两周内的急性排斥发生率以及术后两周第天的血肌酐水平均不存在显 著性差异。而对于非表达者,两组间各指标无显著性差异。 .五酯片组:与对照组比较,试验组中他克莫司起始剂量显著降低、首剂他克 莫司稳态谷浓度显著升高,首剂稳态谷浓度超出治疗窗的比例显著降低、达治疗 窗前剂量调整次数显著减少、达治疗窗时他克莫司所需剂量显著降低。两组间术 后两周内的急性排斥发生率以及术后两周第天的血肌酐水平均不存在显 著性差异胗.。 结论: 对于表达型患者,地尔硫卓方案和五酯片方案均能更准确地预测 他克莫司的给药剂量,减少剂量调整次数,使谷浓度更快地达到治疗窗,同时能 显著减少他克莫司的用量;且五酯片降低他克莫司剂量的作用更显著。而 非表达型者对地尔硫卓的节约作用不敏感,验证了第三部分的发现。因 而可以根据基因型成功地指导肾移植患者他克莫司的临床应用。 关键词: 细胞色素 ,细胞色素 ,多药耐药基因,孕烷受 体,单核苷酸多态性,单倍型,他克莫司,地尔硫卓,五酯片,肾移植,回顾性 研究,前瞻性研究 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 ? ? .??? ?? ? ? ???: :.洫 ? ?/,,? , 叫. . .. ,嘲., . ; .. .。 。。 ? .如,鼢诧, 侬娥, 锄 萨 ’ , 。 。 . . %%腩 僦 .玎、饷 ’, . . 仃 , . 、 盯 ,. 铲 盯 嘣 , . 咖, , , . 阳 . ,/, /., . . 恐 .相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究, ,, , , . . , ., ?., . , .%一.%. ?’一 ,一 , ... .一 一相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究., 一, .%. .%.,. , 一 . .// //. . ,, . . ., // . /×. ,.., . .?./ ..?./ . ?相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 . 巧.%./. ./.%//, , /. .... , . , .,, .?强 , ,. . .相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 .? 、?...? /毒/严尸如.. .、析 ?. . ,/ , . 、, ? ?’ .?, ..幸 . . 幸/ . / ?. ? .相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 , 、 .. , , . .,.,,.,,,,,, . , . , . , . // . ..% ,默 ,? . . ,.%妒. .%. ,. .%怍.. ,眦 ,?.% .%?.,.%妒.. .%畔. ,.. .鸭.. ; ,. 卢.. , . . ?.去 /:宰 / 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 . : . . . ‘’’‘, . , , . ,.. / . 幸 . ‘’’ . “’,. , , . /. , ... . ., , ,, . . , . ? . .相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 .. , . . , ... . ./ ,幸 ,. ., ,? . 幸 . , : ,”/ , , , ,,,, 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 缩略词表 三磷酸腺苷结合盒 . 血药浓度.时间曲线下面 钔 谷浓度猷 峰浓度 钙调磷酸酶抑制剂 变异系数 细胞色素细胞色素 细胞色素 脱氧核苷三磷酸 地尔硫卓 乙二胺四乙酸 酶联免疫吸附法电喷雾离子化 //液相色谱一串联质谱 定量下限 ,检测限 / 质荷比多药耐药基因 微粒子酶免疫分析法 多反应监测 多药耐药相关蛋白 多药耐药相关蛋白 .;’ , 核受体亚家族,组, ’ 悔里 有机阴离子转运多肽 .有机阴离子转运多肽 、,;聚合酶链式反应 . 聚合酶链式反应.限制性 爿.?; ?乌 .几/.瞎???卜知. 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 一糖蛋白 ? 孕烷受体 相关系数参考 相对标准差 嗽视黄醇类受体 标准差 单核苷酸多态性治疗药物监测戤 啪 达峰时间 三羟甲基氨基甲烷 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸 /.罩争瑞 , ?盘非编码区 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名:撕 日期: 如口年月日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的,即:学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅。有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索。可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 保密论文保密期满后适用本声明。 学位论文作考签名:苑嘉丽导师签名:一认 日期: 汐忉年‘月日相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研 究 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化 用药的研究 .?上.一 刖 吾 据最新统计,目前国内大约有万名终末期肾病患者,并以每年?/ 万的发生率在增长,而肾移植是治疗肾衰竭的最有效的方法,但发生排斥反 应是 导致肾移植失败的主要原因,因此免疫抑制剂能否合理应用成为制约肾移植 预后 的关键。 他克莫司,又名是从链霉菌的代谢产物中分离得到的 一种大环内脂类新型强效免疫抑制剂,与环孢素同属于钙调磷酸酶抑制剂 倍【】。因其作用 ,,其药效强度是环孢素的. 强,不良反应较环孢素少,目前他克莫司已成为防治肾移植术后免疫排斥反应的 一线免疫抑制剂。然而,治疗窗窄全血谷浓度需控制在~ /、药动学 个体差异大口服生物利用度为/%,平均约为%】一直是困扰他克莫 司临床用药的难题。常规按体重剂量进行给药,部分患者由于给药剂量过低导致 “免疫抑制不足”造成移植物的免疫排斥导致移植失败,或者给药剂量过高造成 “免疫抑制过度”导致感染易发及肝肾毒性。临床上需进行常规的治疗药物监测,,根据血药浓度调整给药剂量。尽管根据 进行剂量调整使他克莫司浓度控制在治疗窗内已明显地提高了移植后效 果,但是最大的弱点便是存在滞后性,部分患者在监测前就出现血药浓度 过低或过高导致的不良反应,这对于移植术后初期的患者尤为危险。 针对如此大的药动学个体差异以及常规的的滞后效应,是否能够在不相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 良反应出现之前提前预警,亦即找出导致药动学个体差异大的内在原因,从而在 患者用药前制定个体化给药方案,成为全世界研究的热点。 此外,由于他克莫司价格昂贵,终身服用给患者及社会医疗保险机构造成沉 重的经济负担。研究配伍药物与他克莫司的合理联用,寻找能提高他克莫司血药 浓度以减少其用量的“节约剂”,也是目前国际器官移植领域关注的焦点。 .他克莫司的遗传药理学 药物代谢酶和转运体活性的差异是造成不同个体之问药代动力学差异的主 要原因。而多年的研究表明%%的药物反应和处置的个体差异是由遗传 因素引起的【,而单核苷酸多态性 ,,即 序列上发生的单个核苷酸碱基之间的变异,是人类基因组中最广泛的多态性现 象,也是造成个体差异的最主要的遗传原因。因此编码药物代谢酶、药物转运体 的基因序列的不同是引起同一种药物相似剂量在不同个体间产生不同反应的重 要原斟,。 他克莫司主要经肝脏和肠道的细胞色素 和、 进行去甲基和羟基化等氧化代谢反应【】,同时也是一糖蛋白?, .,由基因编码的底物。目前有关他克莫司遗传药理学的研究也主 要集中在、及的基因多态性上。 研究表明个体间活性的差异的%是由遗传因素决定的【】迄今, 已在人类基因中发现了种单核苷酸多态性 ,。在已发现的中,研究得最深入的是位于启动子区域 的 .发现 ,该突变能升高酶活性。 /型与宰/型患者他克莫司谷浓度显著低于?/型患者【, 然而该突变未在中国人群中发现【,因此该突变不可能是造成中国人他克莫 司药 动学个体差异大的丰要原因。~个新发现的位于第内含子的 是目前在日本人和中国人中发现的发生频率最高的,突变频率分 别为.%和.% ,国内有研究报道该突变能升高酶活性,/ 型患者环孢素浓度剂量比显著高于幸/型患者,,目前国内外暂未有该 与他克莫司药动学相关性的研究。 在%.%的人群中表达,在有表达的人群中其活性占体内 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 。表达呈多态性,被认为是个体间 总活性的%%, 活性差异的最主要因素四。位于第内含子的, 能引起可变剪切,产生不稳定的蛋白质,从而使携带基因为幸产的人 不表达 ,因此被认为是决定蛋白表达水平的最主要因素。 大量的研究表明该与他克莫司药动学密切相关,表达型幸/或 /型患者他克莫司浓度剂量比显著低于非表达型宰严型患者,这也是 目前有关他克莫司遗传药理学研究中最为一致的结论【’。 许多研究证实了遗传因素在个体间.表达和功能的差异中扮演了重要角 色。目前,已在人类基因中发现了超过个,其中,位于号与 号外显子的两个/与最被广泛研究,被证明与..的研究发现这两个 的低表达与低活性相关。 .及与他克莫司的浓度相关【‘,然而 .及 .的研究 则未 发现这两个与他克莫司浓度存在相关性【,。此外,有研究表明, 单倍型分析比分析更优于反应基因型与表型之间的关系【’。 /、与位于号外显子的组成的单倍型与他克莫司药 .发现..与他 动学的相关性也成为了研究热点。 .、.的研究则 克莫司高剂量相关【,而 /.及 未发现单倍型与他克莫司药动学存在相关性。因此,直至目前,对 于 /单倍型与他克莫司药动学的相关性,国内外的研究仍未有定论。 由此可见,目前他克莫司遗传药理学研究中结论一致的只有/ 与他克莫司高浓度相关。研究表明,不同个体间活性差异相差达倍 ,而中国人基因突变率普遍偏低,发生率最高的中 国人中发生率为.%也未必是造成个体间活性差异的最主要原因。 此外,基因多态性与他克莫司药动学的相关性一直存在着矛盾的结果。因 此,除了本身遗传因素的影响外,/及.的活性是否还受到其他 遗传因素的影响呢 ,,由基因编码 近年研究发现孕烷受体 作为关键的转录调控因子在编码药物代谢酶及转运蛋白的基因的表达调控 中起 到重要作用,包括/及等。正因为在药物的 代谢及转运中发挥重要的作用,任何影响自身表达的因素都可能会影响其相 关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 靶基因的表达和功能从而影响药物的代谢与转运,因此/的基因多态 性也引起了关注。目前已有部分被证明能影响其靶基因的表达与功能,如’ 与 非编码区 及号内含子的与一 表型相关;位于号和号内含子的和与肠 蛋白含量相关:位于’非编码区的和与睾酮.羟化酶诱导活 性降低相关,而和则与肠?,一糖蛋白的 蛋白含量相关【;位于外显子区域的 、、和能 改变基础和化学物诱导的启动子报告基因的转录活化作用【】,而 、和则会导致基础状态和利福平诱导状态下对 的诱导能力低下】。这些很可能通过影响/的表达及功能从而 间接影响他克莫司的代谢与转运。目前国内外有关 基因多态性与他克莫司 药动学相关性的研究仅见三篇, .分别发现 .与 和与肾移植患者他克莫司的清除率有关【,蛔,而 以则未发现 和 与肝移植患者他克莫司的药动学存在相关性。对于 基因多态性目前只有针对非裔美国人和高加索人的研究资料,无完善的亚洲 ~ 中国人的相关研究,而且从目前的研究结果可知的突变种族差异极大。 由于种族差异是导致药物代谢、疗效和不良反应个体差异的重要因素【‘,这些 发生率未明的是否也会影响我国患者他克莫司的药动学仍有待进一步的研 究。 .他克莫司的药物相互作用 他克莫司是及的底物,合用能抑制或诱导或的药 物均可能使他克莫司的浓度升高或降低【?。如唑类抗真菌药陋、钙拮抗剂【.、 大环内脂类抗生素【,、氯霉素等被证明能提高他克莫司的浓度;而利福平 、苯妥英】等则被证明能降低他克莫司的浓度。钙拮抗剂地尔硫卓便常作为 他克莫司的节约剂在临床上使用。 此外,随着中草药在国际上应用的日渐广泛,中草药与化学药物合用的情况 也越来越普遍,因此,中草药与化学药物的药物相瓦作用也成为近年来国际关注 的热点。研究发现,合用和.的强诱导剂圣约翰草能显著降低他克莫 司的浓度【;合用和.的抑制剂葡萄柚汁则会显著提高他克莫司的 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 浓度。而近年来我们在临床上也发现某些肝功能异常的肾移植患者在合用中药 护肝药五酯片五味子乙醇提取物制剂,每片含五味子酯甲. 后,他克莫 司的谷浓度明显提高。为此,本实验室先前的研究对五酯片及其活性成分影响他 克莫司药动学的机制进行了系统研究。发现五酯片及其活性成分能显著地抑制 和,而抑制肠首过效应是提高他克莫司生物利用度最主要的原因【】。 该研究还发现多次合用五酯片虽然能显著升高血液中他克莫司的浓度但对其在 组织中的浓度影响却不大,且不会因为各组织药物浓度略有升高而引起机体主 要器官如肝和肾功能的损害,为临床用药的安全性提供了依据。由于肾移植患者 合用药物众多,而大多数药物都具有肝毒性,并且他克莫司本身也具有肝毒性, 因此很多患者也需要同时服用护肝药。五酯片在临床上主要用于慢性、迁延性肝 炎谷丙转氨酶升高者。因此,五酯片与他克莫司的配伍使用既能护肝又能降低他 克莫司的用量,减轻患者的经济负担,一举两得。 .研究内容及意义 综上,药动学个体差异大及价格昂贵是困扰他克莫司临床应用的两大难题, 本研究将一方面从遗传药理学的角度探索造成其药动学个体差异大的原因,另一 方面探索节约剂的合理联用,拟最终建立结合遗传因素及合并用药的他克莫司剂 量预测方程,从而在首次给药前制订出最适合该患者的给药方案,并以此指导肾 移植患者的他克莫司用药,使血药浓度尽早达到治疗窗,从而降低患者由于多次 剂量调整导致浓度波动而产生的风险,实现他克莫司的安全、有效、经济的个体 化用药。目前国内外仍未有结合这个两个方面一起考虑他克莫司个体化用药的研 究。 由于基因多态性目前只有针对非裔美国人和高加索人的研究资料, 无完善的亚洲人/中国人的相关研究,而且从目前的研究结果可知 的突变 种族差异极大。因此,本课题也将对中国健康汉族人的基因的进行 系统筛查,并对位于关键区域的进行功能验证,为进一步在肾移植患者中 进行基因多态性与他克莫司药动学相关性的研究提供基础。 本研究丰要包括以下几部分内容:洲基因多态性研究; 全血中他克莫司的//分析方法的建立与肾移植患者药动学研究; 相关基因多态性及地尔硫卓与早期肾移植患者他克莫司浓度的相关性研究;相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 五酯片对表达型患者他克莫司药动学的影响;基因型联 合地尔硫卓/五酯片干预他克莫司用药的前瞻性研究。 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 /基因多态性研究 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 第一部分/基因多态性研究 亚家族 孕烷受体 ,是核受体超家族中的 成员,由 基因编码。主要分布在肝脏,其次是结肠和小肠【引。当 受到特定配体激活时,形成受体.配体复合物,然后与视黄醇类受体,形成异 二聚体,结合到靶基因启动子内的外源性化 合物反应元件,从而对基因的转录加以调控。 近年研究发现,作为关键的转录调控因子在编码药物代谢酶及转运蛋 白的基因的表达调控中起到重要作用。据报道,受其调控的基因主要包括: 药物 代谢酶包括细胞色素酶系如、、,、 与 。】等及尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶等; 药物转运蛋白如多药耐药基因、多药耐药相关蛋白与 等】、有机阴离子转运多肽与陬】等。由此可见, 在药物的代谢及转运中发挥重要的作用。 研究表明%一%的药物反应和处置的个体差异是由遗传因素引起的。 由于药物代谢酶和转运体活性的差异是造成不同个体之间药代动力学差异 的主 要原因【】,一直以来遗传药理学的研究主要集中在编码药物代谢酶与转运 体的基 因多态性上。近年来,在药物代谢酶及转运蛋白的表达调控中的重要作用 逐渐被认识,任何影响自身表达的因素都可能会影响其靶基因的表达和功 能,因此的基因多态性也引起了关注。 截至目前,在 数据库上已收录个人类基因的。 .首先对高加索人和非裔美国人的基因的进行筛查,发现 两个种族人群的种类及发生频率均存在显著的差异。随后对位于关键区域 的进行功能验证,发现:能降低对的活化作用; 与. 与表型相关;和与肠蛋白含量 相关;和与睾酮.羟化酶诱导活性降低相关,而 和 .对高加索人与非洲人 则与肠?的蛋白含量相关 基因外显子区域的进行了筛查及功能验证,发现、、相关基因多态性与肾移植 患者他克莫司个体化用药的研究 和能改变基础和化学物诱导的启动子报告基因的转录活化作用 .对日本人基因的所有编码外显子进行检测,发现 】。 、 和会导致基础状态和利福平诱导状态下对的 诱导能力低下。可见,基因的功能与及的表达和 功能密切相关,因此推测这些可能会间接影响及.底物的代谢 及转运。 在本试验开展前暂未有对中国人群 基因进行系统筛查的报道, 且从目前的研究结果可知 的突变种族差异极大。本部分研究将以汉族健 康志愿者为对象,对基因的’、’、各外显子及近端内含子的 已知与未知的进行筛查,明确汉族人群 基因的种类及发生频率, 并对某些位于重要功能区的特征性进行功能研究。 中国汉族人基因检测 .材料与仪器 ..试剂 提取试剂碘化钠、缓冲液上海生工生物工程技术服务有限公司, 氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇均为市售分析纯产品。 扩增试剂 ,,引物合成上海生工生 物工程技术服务有限公司 琼脂糖凝胶电泳试剂普通琼脂糖,,三羟甲基氨基甲烷 、硼酸、乙二胺四乙酸二钠.上海生工生物工程技术 服务有限公司,? 北京赛百盛牛物工程公司 , , ..主要试剂的配制 ... . 溶液的配制 称取. 烧杯中,加入约 的去离子水, .,置于 充分搅拌,加氢氧化钠调节值.,继续搅拌完全溶解,加去离子水将溶液 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 。 定容至 ... 溶液的配制 ,. 称取 硼酸,置于烧杯中,加双蒸水搅拌溶解,加入. 溶液 ,加双蒸水定容至 ,制成储备液。储备液需稀释 倍制成.工作液使用。 ... 碘化钠溶液的配制 称取 ,避光 碘化钠,置于烧杯中,加双蒸水搅拌溶解,定容至 保存。 ...氯仿,异戊醇:溶液的配制 量取氯仿 ,异戊醇 ,混匀即成。 ... %乙醇溶液的配制 。 量取 乙醇溶液,加双蒸水定容至 ..仪器设备 ?, ? 型水平电泳槽京六一仪器厂 一型稳压稳流电泳仪北京六一仪器厂 超低温冰箱?, 凝胶成像系统 .型高压灭菌锅合肥华泰医疗设备有限公司 低温离心机吒 ., , 微量取液器 旋涡振荡器海门麒麟医用仪器厂 .真空干燥箱上海一恒科技有限公司 富华.型恒温振荡水浴器常州菲普实验仪器厂 紫外分光核酸蛋白分析仪, 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 .实验方法 ..研究对象 名无直接血缘关系的健康汉族受试者来自中山大学,其中男性名,女 性名,年龄.岁平均年龄.岁,不吸烟、不嗜酒,无心、肝、肾、 消化道和血液等疾病史,试验前进行全面体格检查身高、体重、呼吸、心率、 血压、体温等和试验室检查血常规、血生化、尿常规、大便常规正常者。 试验前得到中山大学医学伦理委员会批准,并签署了知情同意书。 ..外周血白细胞的提取 等的方法【。 参照并优化 取抗凝全血 .,加无菌双蒸水 混匀; 加入碘化钠 .,混匀; , 加入氯仿/异戊醇:皿,反复混匀,静置 离心 小心吸出上清液至另一离心管,向上清液加入异丙醇 混匀,静置 , ,弃上清; 离心 加入冰冷的%乙醇 , ,倒掉乙 ,静置 离心 醇; 重复步骤一次,倒置片刻; 以溶解。 待管壁晾干后,加入缓冲液山,放?水浴中 .. 浓度及纯度测定 取样品此加缓冲液至 .,充分混匀后用紫外分光光度计测定波 长分别为 和 时的值,通过公式计算的浓度和纯度。 浓度岭/:稀释倍数/ 纯度:/?..,表明有污染;.,表明有蛋白质 等污染 .. 反应 ...引物设计相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 基因的、’、各外显子及近端内含子的扩增引物均参考文 献提供的序列旧,具体见表.,并经.软件及 验证引物序 列的合理性与特异性。 ... 反应体系 反应体系为“,包括此,酶缓冲液“, /,上、下游引物各 此. ./, .此 /,用补充总体积此。 ... 反应条件 ? 钳?.璺 ? 如 ; ? 如 ; 次循环 ? .星 、?,?、, ? ? 饥保 盯卜.存 ... 产物鉴定 和 %琼脂糖凝胶,加入终浓度为.“/的,将 混有上样缓冲液的产物上样后, 电压条件下电泳 ,紫外灯下 观察电泳结果并与凝胶成像系统上自动成像。 ..基因型检测 采用直接测序法,产物由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测 序。 ..统计分析 计算中国汉族人各检测位点基因型频率,并验证是否符合? 平衡。采用在线软件://.../.进行连锁 不平衡分析。中国汉族人与已报道的其他人群的等位基因频率的比较采用检 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 验,以.为显著性差异标准。 .实验结果 ..基因型分析 基因型测序结果见图.至?。 .. 基因分布情况 中国健康汉族人 基因分布情况见表。本试验共发现了个 ,.、.、.、.与. 位于’非编码 区 ,,位于号内含子,与 位于号内含子,位于号内含子,、与位于 号内含子,、、 与 位于’,然而未发 现位于外显子区域的。其中,.、.、一与 个未发现纯合突变。这 个的突变频率分别为:. .%, ..%,..%,一.%, .%,. .%, .%, .%,.%, .%, .%, .%, .%, .%, .%, .%。经检验,这些基因型均符合?平衡。 ..连锁不平衡分析 经在线分析发现,位于的.、 与位于号 内含子的. 完全连锁不平衡,位于号内含子的与完全 连锁不平衡’。 ..中国健康汉族人的基因多态性与已报道的其他人群比较 由表.可见,除了.、.、与在亚洲人群 中未见报道外根据 数据库,其余个的发生频率在本试验 人群与已报道的亚洲人群间无显著差异尸.。 .、.、在高加索人及非裔美国人中均未见报道; 一突变频率与高加索人及非裔美国人无差异尸.;.突变 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 频率与非裔美国人无差异,但高加索人中未见该位点的报道;.突变频 突变频率显著低于高加 率显著低于高加索人与非裔美国人尸.; 索人舢.而与非裔美国人无差异尸.;突变频率显著低于高 加索入闷.与非裔美国人砌.;突变频率显著低于高加索人 .,而非裔美国人中未见该位点的报道;突变频率与高加索人无 差异户.,但非裔美国人中未见该位点的报道;突变频率显著低于 非裔美国人.而与高加索人无差异删.;突变频率显著高 于高加索人尸.而与非裔美国人无差异尸.; 突变频率显 著低于高加索人.而与非裔美国人无差异脚.;突变频 率在三个人群间无差异删.:、突变频率显著高于高加 索人尸.和非裔美国人.。 .讨论 本研究发现的个中,位于’区域的有个,位于内含子区域 的有个,位于区域的有个,并未发现位于外显子区域的。虽然 其他研究分别在高加索人、非裔美国人及日本人中发现了位于外显子区 域的并进行了功能验证,但是确证有功能的个的发生率都较低低 于%。曾有研究报道在不同个体的肝脏组织中的表达水平差异高 达倍‘,且表达水平的差异也同样存在于空肠组织中。因此推测这些低发生 率的不是造成表达差异以至其靶基因表达及功能差异的主要原因。 高加索人中未见.、.、.与四个位点的报 道,而非裔美国人中未见.、.、、与 五个位点的报道。然而,在高加索人及非裔美国人中发现的一些也未在本 试验人群中发现,除了上面提到的位于外显子的外,还包括其他有功能的 如位于’被证明与睾酮.羟化酶诱导活性降低相关的和 ,以及位于号内含子与肠蛋白含量相关。由此可见, 基因的种类存在显著的种族差异。本研究发现的.与 未在 数据库中收录,属于新发现的,由于发生率低于%,属于 罕见变异。 然而,其他在本试验人群、高加索人及非裔美国人中均有发现的的发 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 生频率也存在显著的种族差异。如本人群中.的突变频率显著低于高加 索人,而这个位点被证明与的表型相关。由于基因的发 生频率不高,但是不同个体肝内基因的表达可差一倍而其底物在 体内的代谢可差倍以上,因此推测该位点‘匕‘是造成中国人与高加索人 表达及活性差异的主要原因之一。又如本人群中的突变频率显 著低于非裔美国人,而该位点被证明与肠道含量相关。再如本人群中、 的突变频率均显著高于高加索人与非裔美国人,而这两个位 点被证明与肠道?含量相关。 此外, .确定了基因启动子的重要调节区域~ 【】,本研究中发现的但未见功能报道的刚好处在此区域,而 另一个 .也临近于此区域,推测这两个可能会影响自身 的表达,从而影响靶基因的表达及功能,后续的研究将会对这两个进 行功能研究。 由此可见中国健康汉族人群的的种类及发生频率与高加索人及 非裔美国人存在显著的种族差异。由于种族差异是导致药物代谢、疗效和不 良反 应个体差异的重要因素,因此除了药物代谢酶及转运蛋白本身的遗传多态性 外,基因的也很可能是造成其靶基因如及表达 及功能的差异从而导致其底物药物代谢、疗效和不良反应个体间及种族间差 异的 原因。 .小结 中国健康汉族人群的基因中共发现个,发生频率为 .%.%,其中,.与为新发现的。 中国健康汉族人群的的种类及发生频率与高加索人及非裔美国 人存在显著的种族差异。相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药 的研究 .与.功能研究 .材料与仪器 ..试剂 凝胶回收试剂盒?,,. , ,,, , , , , 研, 琼脂粉,异丙基硫代...半乳糖苷,.溴氯一.吲哚...半乳 糖苷?,氨苄青霉素北京鼎国生物技术有限责任公司 质粒提取试剂盒, ,? 一,? , 胎牛血清杭州四季青生物材料有限公司 培养基, ,, 扩增试剂、琼脂糖凝胶试剂,同本论文第一部分。 ..主要试剂的配制 参照《分子克隆实验指南》第三版,配制培养基、固体培养基、 异丙基硫代一一半乳糖苷、一溴氯一吲哚?一半乳糖苷?与 氨苄青霉素。 ..仪器 .型显微镜重庆光学仪器厂 .型双人单面净化工作台 苏州净化设备有限公司 型二氧化碳培养箱, .型电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司 免疫发光检测仪 , 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 ?全温恒温振荡培养箱哈尔滨东联电子科技开发有限公司 其余仪器同..。 .实验方法 .. 一重组表达质粒的构建 基因组来源 本部分..研究对象的样本,所选样本为.与.位 点均无突变或仅含其中一个突变的样本。? 反应 .引物设计 .软件设计,序列为: 正向引物’? 引物经 .’与反向引物’一 .’,目的片段长度为 。 . 反应体系与条件 同...与...。 .... 产物鉴定 同...。 ... 产物纯化 参照凝胶回收试剂盒说明书进行。 克隆 载体链接 .目的片段与 及 说明书进行。 按 .转化 说明书进行。 按. 相关基因多态性与肾移植患者他克莫司个体化用药的研究 .挑选阳性克隆 于固体培养基上挑选白色菌落,扩增,提取质粒按照质粒提取 试剂盒说明书进行,经酶切判断连接方向,测序验证。 酶切体系: 此 .“ . 肛 .斗 酶切条件为。水浴.小时。 一克隆 测序验证为目的序列的克隆产物及.经和 双酶切,凝胶回收后进行连接连接按 说明书进行。转化入感 受态细胞按. 说明书进行,挑选克隆,经和 双酶切鉴定并测序验证。 双酶切体系: “ .?.“ 此 酶切条件为?水浴小时。 ..双荧光素酶报告系统的构建 ... 细胞培养 用含有%灭活胎牛血清的培养基培养,置于?, 含量% 为培养箱中培养。 ... 一重组质粒与?海肾荧光素酶报告基因载体共转染 使用作为转染试剂。海肾荧光素酶报告基因 载体共转染以校正转染效率。