AO／EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL—60细胞凋亡

AO／EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL—60细胞凋亡 AO,EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL —60细胞凋亡 际脚相鳓 中华血液学杂志1998年1月第l9卷第1期 L一乏钴 壤毙包翘 卜^?经验交流? AO/EB荧光染色法测定阿糖胞苷诱导HL一6O细胞凋亡 陈丽娟盛瑞 __—_一——__一 细胞凋亡与肿瘤的发生和治疗之间的关系是近年 来国际上研究的热点,目前细胞凋亡的检测方法有 DNA凝胶电泳法,电子显微镜法,染料透过法, TUNEL法和流式细胞仪法等我们用染料透过检测 法0测定阿糖胞苷(Ara-C)诱导的HL一6O细胞凋亡,取 得了满意的结果,现报道如下= 材料和方法 1原理吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞,嵌入 细胞核DNA,使之发出明亮的绿色荧光.溴乙锭(EB) 仅能透过胞膜受损的细胞,嵌入核DNA,发橘红色荧 光.凋亡的细胞呈现为染色增强,荧光更为明亮,均匀 一 致的圊状或固缩状,团块状结掏.非凋亡细胞核呈现 荧光深浅不一的结椅样特征.二者形态迥然相异,很易 判别.在荧光显微镜下观察,可见四种细胞形态:活细 胞(VN),棱染色质着绿色并呈正常结构;早期凋亡细 胞(VA),拔染色质着绿色呈固缩状或圆珠状;非凋亡 的死亡细胞(NVN),核染色质着橘红色井呈正常结构; 晚期凋亡细胞(NVA),拔染色质为橘红色井呈固缩状 或圆珠状.细胞凋亡率由以下计算: 凋亡率一VA+NVA +NVN+VA+ 2材料细胞来源:HL一60细胞株,由南京铁道医学 院血液科研究室提供. A0/EB染料:精确称取AO(Fluka产品),EB (Fluka产品)各]mg,分别溶于10mipH7.2PBS中使 之配成100~,g/mi的储备液,用前等量混合,备用. izg,~朱广荣/777,J, 3方法 3.1HL一60细胞培养:将1×1O/mlHL一60细胞接种 于含2o小牛血清的RPMI1640培养{夜中,加Ara—C 终浓度为10ttg/ml,置37V,5"CO浓度及饱和湿度 孵育后分别于3,6,12,24及 的恒温培养箱中悬浮培养, 48小时观察结果 3.2AO/EB染色及观察结果;取细胞悬液100gl,加 入AO/EB染科4I混匀,置l滴于载玻片,上覆盖玻 片,荧光显微镜下观察结果并计数ZOO个细胞 3.3DNA抽提及电泳:用酚,氯仿异皮醇抽提DNA, 1.5琼脂糖凝胶电泳(0.5×TBE缓冲液,电压30V, 电泳7,8小时),在紫外透射仪下观察结果并拍照 结果 AraC诱导IlL6O细胞凋亡,在0,3,6,12,24和 4B小时其凋亡率分别为1.5,14,57.5,66, 70.5和60.5.实验显示于第6小时开始,随诱导时 间延长,其凋亡率增高,但观察至48小时,凋亡率却减 低,此时显微镜下可见许多细胞碎片(附表).DNA电 泳在Ara—C诱导6小时后均见梯形条带. 讨论 Ara—C是作用于细胞S期的特异性抗代谢药物,临 床上用于各种白血病的治疗,过去认为其作用机制是 杀细胞性的,怛近年来认为小剂量Ara—C有诱导分化 作用;本实验显示Ara—C的作用机制是诱导细胞凋亡, 且诱导作用在24小时内随诱导时间延长,其凋亡率 附表Ara—C诱导的HL60细胞凋亡 怍者单位:210029南京医科大学第一附属医院 逐渐增高,而经药物作用48小时后细胞凋亡率反而减 低,并且在显微镜下可见较多的细胞碎片,考虑为细胞 凋亡后继发性坏死所致,由于碎片无法计数,故导致计 数时凋亡细胞相对减少,凋亡率相对下降 在人体内凋亡细胞常被邻近的吞噬细胞所吞噬清 除,因此不会发生继发性坏死奉实验亦显示经Ara-C 诱导的HL60细胞于6小时后DNA电泳均显现梯形 条带,此结果进一步证实了Ara—C对HL一?细胞的诱 导凋亡作用. 测定细胞凋亡的方法有多种,其特点各不相同. DNA电泳法仅可定性,但无定量作用,而AO/EB染色 法则可以半定量,它不但可以检测细胞的凋亡率,而且 还能了解膜受损细胞率.AO/EB法所需设备步,简便, 快捷,经济,便于推广.其主要缺陷是仍难避免操作者 的主观因索.最好由两位操作者同时计数,每次实验重 cbinJHemato]一January1998,Voli9,Noi 复3次,计算平均凋亡率.电镜检测法设备昂贵,操作 复杂,且仅有定性作用{TUNEL法和流式细胞仪法虽 也有定量作用,但TUNEL法也带有主观性,且 TUNEL法和流式细咆仪价格昂贵.难以普及我们舟 绍的AO/EB染色法是研究细胞凋亡的重要检测方洼, 随着此法的应用和推广,对抗肿瘤药物作用机制的研 究及临床用药的指导将起重要作用 参考文献 1WangCY,EshlemanJ,LutterbaughJ.fa1.sp?)t?us apoptosisinhumancolontU~OHrcelllinesandthe~]ation 0fwTp53tOapoptosisChinMedJ,1996,109{537541. (收稿:1996—12—16修回:1997—05C8) (校对:张吉贤) 深低温保存的自体Rh阴性血液输血一例 胨洪涛肖露露赵阳戴丽蓉 孕妇31岁.1990年第1胎孕8个月时因宫内死 胎,引产后输过血,经过不详.1992年第2胎孕7个月 时,1993年第3胎孕5个月时,均发生胎儿水日中而官内 死亡1996年7月6日第{次怀孕3个月就诊,血型血 清学捡查:孕妇血型为AB,ccdee,血清中含有抗一D抗 体,效价在孕3个月时1:64,孕5个月时1:1024丈 夫血型为AB,CCDee.夫妻间Rh(D)不相舍.患者系 Rh新生儿溶血(Rh—HDN)病患儿的母亲.于7月19日 和8月24日给予置换血浆治疗,同时共采集自体血液 40Oral,一80?预先去甘油法探低温保存,以备分娩之 需.1O月5日(孕7个月)在广州市工』,医院检查时发 现,孕妇尿蛋白++一,血压16/11kPa(1kPa一 7.5mmHg),血红蛋白l13g/L}B超见巨大胎盘,胎儿 腹水并且已宫内死亡,诊断为胎儿Rh溶血病致孕妇妊 娠高血压综台征,行引产术.同时将已保存的孕妇自体 作者单位:510095广州血液中心 血400ml,经120分钟复苏和洗涤制备成红细胞悬液. 孕妇于次日娩出一男性死眙.出血约lO00ml,血红蛋 白降为67g/L,立即回输全部400ml自体血,经过顺 利.10月8日壹血红蛋白上升为87g/L,15天痊愈出 脘 讨论:自体血无须交叉配血试验,制备出后可立即 使用,节省输血前的试验.输血后第二天血红蛋白从 67g/L上升为87g/L,说明自体玲冻血输血安全有效 在传播病毒的威胁日益突出的今天,自体输血日渐得 到重视.我】预先去醣甘油深低温保存技术既能长期 血渣保存,义避免空间局限性,并适宜临床急救或择期 手术,是将稀有血型血液及自体血成功应用于临床输 血的病例. (收稿:199612-25修回199704—29) (授对:强吉贤)