【doc】酪氨酸E值计算法测定多酶片的改进

【doc】酪氨酸E值计算法测定多酶片的改进 酪氨酸E值计算法测定多酶片的改进 药物生物技水 PharmaceuticalBiotechnology2001,8(5):288--291 ? 技术交流? 酪氨酸E值计算法测定多酶片的改进’ 吴宏伟,顾以振 (厦门市药品检验所,厦门361012) 摘要用酪氨酸吸收系数E法测定多酶片中胃蛋白酶与胰蛋白酶的含量.用不同型号的紫外分光光度 计测定不同浓度的酪氨酸吸收度,计算出E值,用E值法测定胃蛋白酶和胰蛋白酶的活力单位效u.测定胃蛋 白酶时,可采用酪氪酸E{盏275nm=766(0065mot/L盐酸溶液);测定胰蛋白酶时可采用酪氪酸E{盏275nm= 75.3(02mol/L盐酸溶液).该法结果准确,精密度高,操作苘便,运用胃蛋白酶和胰蛋白酶的话力测定. 关键词多酶片i胃蛋白酶;胰蛋白酶;酪氨酸吸收系数E 中圉分类号Q629.8文献标识码:B文章编号:1005—8915c2001】05—0288—04 多酶片系含有胃蛋白酶,胰蛋白酶,胰脂肪酶 和胰淀粉酶等的复方片剂.继1989版卫生部药品 生化药品分册(第一册)J之后,仍收于1998 版标准…2中.值得注意的是,目前国际上此类制 剂发展很快,主要成份又添加纤维素酶等.故需改 进其复方片剂的测定.原药典方法中,测定各 种酶时,要分别涣f定其相应的对照品值,操作较繁. 本文依据胃蛋白酶与胰蛋白酶均采用酪氨酸对照 品的原理,直接采用酪氨酸E值法,测定准确,计 算方法简单,与中国药典法比较.精密度更高,操作 简化,提高效率,可节省血红蛋白和酪蛋白对照品. 本法不仅适用于多酶片中胃蛋白酶和胰蛋白 酶的测定,也适用于菠萝蛋白酶和木瓜蛋白酶的测 定 1仪器与试剂 1,1仪器 日本岛津uv一2201,UV-250,UV-1601,均为 日本岛津京都公司生产;美国PE.LAMBDAI2型 紫外分光光度计,为簿国BodenseewerkPerkin— ElmerGmbh生产;WFZ800紫外分光光度计, 为北京第二光学仪器厂生产;501超级循环恒温水 浴,为上海第二五金厂生产. 12试剂 酪氨酸对照品,血红蛋白对照品,酪蛋白对照 品,均为中国药品生物制品检定所提供;多酶片,为 本所留样;三氯醋酸,氧化钙,硼酸,为纯试剂. 2方法与结果 2.1预实验 2.1.1实验原理多酶片中胃蛋白酶和胰蛋白酶 均具有催化蛋白质水解能力.在规定的酸度,温 度,浓度和时间内.能催化血红蛋白或酪蛋白,水解 成不被三氯醋酸沉淀的小分子肽和氨基酸,其中酪 氨酸,色氨酸,苯丙氨酸等,最大吸收渡长均为 275nm,用酪氨酸作标准测定酶活力,计算供试品 含量. 2.12所用试液均按中国药典2000年版规定配 制【4l. 2.1,3酪氨酸E1%275~的测定取在105?干 燥至恒重的酪氨酸对照品适量,分别加盐酸溶液 (0.065mol/L)释释至浓度为40~g/ml,50~g/ml. 60~g/ral,80~g/ml,100~g/ml和120>g/ml,于 2201,250,UV-1601PE.LAMBDA12 WFZS00D2紫外分光光度计中测定酪氮酸E值 测得平均E…1%nln=76.6,n=29,;?s=76.57 ?0.27,RSD%=0.3%;同样浓度.溶剂为 0.2mol/L的HCI溶液,测得平均E}275nm= 75.3,n:29,;?s=75.29?0.32.RSD%=04%. 结果表明:用不同紫外分光光度计测定酪氨酸吸收 ?收稿日期:20C,I~I.II 作者简舟:吴宏伟,1971年6月出生,女,蒙古族,内蒙古包头市人,主管葑师,从事生化药品检验 吴宏伟等:酪氡酸E值计算法测定多酶片的改进289 系数E值无显着差异;但溶剂浓度不同.E值稍有 差别. 2.1.4血红蛋白对酪氟酸测定的影响中国药典 (2000年版)中对胃蛋白酶含量测定为使对照品与 样品测试条件一致,规定对照品酪氨酸测定中要加 入血红蛋白试液.为此测定殴计了同一测定条件 下.加八不同量血红蛋白对酪氨酸的影响观察. 取试管7支,分别加入50og/m[酪氨酸lml, 置37?0.5?水浴保温5rain,再依此加入预热至 370.5?,浓度分别为5.0,7.5,10.0,12.5.15 0,l7.5.20.0mg/ml血红蛋白试液5ml,相当于分 别加入0.0250g,00375g,0.0500g,00625g, 0.0750g.0.0875g和0.1000g血红蛋白.置37? 0.5?水浴保温10min,再加入5%三氯醋酸试液 5ml,摇匀滤过,取滤液作紫外测定,波长275nm, 以0.065mol/L~A]:酸溶液为空白.结果如表1 TablTheinfluenceofdifferentconcentrationhemoglobin onEv~dueOftymsine ofhemoglobin (×100g) Evueoftyrosine (E}275nm) 77O8 77O0 77.00 7670 76.80 77.00 7651 7690 Note:The0.2mol/LHCIaSsolventin~dTtemethod.the Ev~dueoftyroslne=7580 结果表明血红蛋白对酪氨酸测定无影响. 2.2改进的测定方法 2.2.1多酶片中胃蛋白酶含量测定的改进 (1)样品溶液制备 分别取各批号多酶片供试品各5片.置研钵 中,加0.065mol/L盐酸溶液少许,研磨均匀,用盐 酸溶液稀释至250ml量瓶中,再取10ml置25m1容 量瓶中,用盐酸溶液稀释至刻度.摇匀待测. (2)测定法 取试管3支,分别加入供试品溶液lml,置37 ?0.512水浴保温5min,再依次加入预热至37? 0.5”C血红蛋白试液5ml,摇匀,并准确计时,在37 ?0.5?水浴中反应10min,立即加入5%三氯醋酸 5m1.摇匀滤过,取滤液作紫外测定.在275nm波 长处测定吸光度,计算出平均A值.用酪氨酸Ej 275nm=766计算,计算式如下: 每片胃蛋白酶活力单位 ,?一一 E;X181.19x10×5 A为试品平均吸光度 n为供试品稀释倍数 10000为酪氨酸~g/ml改为g/lOOm1的折算 倍数 18119为酪氨酸分子质量 10为反应时间(min) 5为取样量(片) 结果如表2. Tab2TheactivityofpepsinandtrypsininMultier~yrnede— retrainedbytw.methods.U/tab 结果表明多酶片中胃蛋白酶E值法测定结果 准确.与药典法比较无显着差异,P>005. (3)精密度实验 取酪氨酸对照品各六份.用0.065mol/L盐酸 溶液均稀释为约500/~g/m]的溶液,取样品一批按 照胃蛋白酶操作方法测定.药典法测得含胃蛋白 酶活力平均为51.5.RSD%=35%;吸收系数法 (E=76.6)测定结果平均为518,RSD%= 0.95%.两者精密度有显着差异P<005.吸 收系数法测定精密度比药典法高. 2.2.2多酶片中胰蛋白酶含量测定方法的改进 (1)样品溶液的制备 分别取各批号的多酶片5片,置研钵中,加 5?以下氯化钙溶液少许,面磨均匀,移至100ml量 瓶中,加氯化钙溶液至刻度,摇匀.准确量取2ml, 蛐??;235678 290药物生物技术第8卷第5期 用5?以下的硼酸盐缓冲溶液稀释至100ml,每 lm!中含胰蛋白酶0.16U. (2){咂f定法 取试管3支,分别准确量取供试品溶液lml与 硼酸盐缓冲溶液2m1.在40?0.5?水浴保温 10rain,再各加入预热至400.5?酪蛋白溶液 5ml,摇匀,在40?0.5?水浴中准确反应30rain 后.立即加入5%三氯醋酸溶液5ml终止反应,摇 匀滤过,取滤液测定,在275nm波长处测定吸光 度.计算出平均A值,用酪氨酸E:275nm=75.3 (02mol/L盐酸溶液)计算.计算式如下: 每片胰蛋白酶活力单位 1T=?旦兰!Q E×181.19×30×5 30为反应时间(min),其余同胃蛋白酶所 示. 测定结果如表2,表明多酶片胰蛋白酶E值法 测定结果与药典法比较无显着差异. (3)比较两种胰蛋白酶浓度对实验结果的影响 在多酶片测定中,胰蛋白酶测定的最终浓度为 016U/ml,而药典中规定的浓度为0.12u/ml两 者有差别,为了观察对测定结果有无影响,故比较, 结果如表3.结果表明:两种浓度对测定无影响. P>0.05 3讨论 改进方法中酪氨酸的浓度测定范围为0. 018mg/ml--0.1mg/ml,酶的含量测定也要严格控 制好样品溶液浓度.胃蛋白酶为0.2,0.6u/ml, 麒蛋白酶浓度由012改为016u/ml,经实验证 明测定无影响.浓度范围有待进一步研究. Tab3TheactivityoftwoConcentrationoftrypsinsolutionin myDeterminingAbsorptionCo- efficientEofTyrosine WUHong?wei.GUYi—zhen (TheinstitutionofthedruginspectionofXiamen.Xiamen361012) Abstract:PurposeTheaimistostudytheassayofpepsinandtrypsin.MethodsEiofsomedifferentconcert— trationoftyrosineweredeterminedusingdifferenttypespectrophotometers.Theactivityofpepsinand trypsinwerecalculatedaccordingt0E{兰 L0ftyrosine.ResultsE}275nm=76.6(0.065moVLHC1soluti0n) andEj275nm=75,3(0.2moVLHCIsolution)canbeusedtoassaytheactlvityofpepSinand七rypsinre. 吴宏伟等:酪氨酸E值计算法测定多酶片的改进29l specfivelyConcl~ionThemethodiseasyandaccurate.andissuitabletoassayt heactivityofpepsinand t~-psininmultienzyme KeywordsMultienzyme.Pepsin,Trypsin,AbsorptioncoefficientEoftymsin ? 信息? 2001.A.109创新的海洋基因工程药物的研究开发重组海蛇毒索抗癌作用的研究.重组平颏海蛇磷脂酶A2对肿 瘤细胞毒性鉴定实验结果表明对肿瘤细胞有明显的毒性,对HL60,SK—N-SH和MGC三种细胞的IC50分别为004Stag/ m1.0057rag/ml,0.069mg/ha,可望开发成新型抗肿瘤新药.重组平颏海蛇神经毒素对醋酸扭法镇痛实验表明.对小鼠化 学臻痛(H)有一定镇痛作用,其中重组长链神经毒索作用比重组短链毒索明显,抑制率分别高达72.9%和61.8%,远高于 阳性对照盐酸哌替睫,可望开发成新型镇痛新药. 芋螺毒素的基因工程和药物研究.进行了芋螺毒素的基因克隆,毒索分离,合成,活性筛选及结构测定.获得了一种 含25干氨基酸残基三对二硫键新芋螺毒素,请毒素具有强烈的镇痛活性及提高的用药安全性.试验表明镇痛教果优于美 国产品. 2001.A.110海洋生物功能基因的研究与开发和用819主题重点支持 在中山大学建立”国家高科技术计划海洋领域 海洋生物功能基因组开放实验室”及其研究项目的开展.目前,该实验室经过1年多的建设己经在我国特有海洋生物资源 功能基因组研究方面取得了重要戚果.巳成动构建了l3个海洋动物eDNA表达文库,通过大规模预测获得了316干新基 因序列.其中包括多个潜在的药用基因,工业用酶基因和抗逆性基因.目前在Genbank上公布的海洋生物基因茹据的基础 上,建立了海洋生物基因效据库. 2001.Aq11转基因克隆技术定点整合生长激素基因鱼的研究.采用显微注射和精于携带方法.获得转基因海鲤 800余尾,筛选出快速生长转基因鱼60余尾;以13-a~n基因为靶位,neo,tk基因为选择基因,构建定点整合体,井建立细胞 有效整合参效获得外源基固定点整合细胞;GFP和BFP为选择基因,构建定点整合转基因鱼嵌合体. 克隆牙鲆鱼技术的研究.建立丁由体细胞和培养细胞核作供体培养克隆鱼的关键技术.发明了保存供胚胎移核新法. 获得16条克隆模型斑马鱼;获得9条泥鳅和斑马鱼杂种克隆鱼;获得5个牙鲆原肠期肛胎;建立了牙鲆鱼腿细胞系;已经 把外源基因导八牙鲆鱼培养腿细胞中. 对虾抗杆状病毒基因工程育种技术研究.在国际上首次测定了对虾自斑杆状病毒全基因系列(305kb).首次克隆到目 本对虾肌动蛋白基因启动子.首次构建了对虾白斑杆状痛毒反义 RNA转录载体系统,对日本对虾转基因抗病毒系统构建 也进行了探索性研究 2001-A-112分子标记技术海洋生物分子标记与选种技术课题,获AFLP特征标记80余个.其中lO上为优良性 连锁的标记片段;RAPD标记81个.其中11个与生产性状有关:完成初步AFLP图谱.课题组已获得增产3096上的群 系(家系)5个,抗逆家系3个(成活率提高30%以上).生产对比规模达200亩上.获得东方垃的特异标记,建立了东方 鲍种质鉴定技术. 2001-A-113芋螺毒素肽从我国海南岛采集的织锦芋螺中发现的14种芋螺毒素态,属于生物领域.是采用eDNA 方法获取芋螺毒素的前体肽序列(Seqxp).由前体肚列推测出成熟芋螺毒索肽列(Seqx).这些成熟毒肚可以经化学合成或基 因体外表达手段获得.具备上述序列的芋螺毒素肽,由于毒素序列相差一个氨基酸就可能产生新的受体特异性,因而上述 I4种新的毒素皆有其独特的受体特异性和亲和力.在受体的研究中具有价值.是新药开发的候选药物和先导药物;毒素 Seqll通过阻断钙离子通道发挥作用,具有镇痛活性强.耐受性小的优点.