IL17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中作用研究（可编辑）

IL17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中作用研究（可编辑） IL17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中作用研 究 上海交通大学 博士学位论文 IL-17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用研究 姓名:刘嘉琳 申请学位级别:博士 专业:内科学(呼吸病学) 指导教师:万欢英 201005 上海交通大学博士学位论文 IL(17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用研究 中文摘要 细胞在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中所起作用，为该类感染的 免疫防治奠定理论基础，为疾病防治寻找新干预靶位提供新思路。 方法:通过经鼻吸入临床标准铜绿菌株PA01建立急性铜绿假单胞 菌肺部感染小鼠模型。应用Real(time 法测定Thl7细胞免疫模式中的IL(17、IL(22以及儿(23mRNA和蛋白水 平的表达;应用抗IL(17抗体探究m(17在该感染模型中的作用，以流式 细胞仪技术和免疫荧光分析几(17的来源细胞;应用抗ySTCR抗体耗竭 体内俩T细胞以探讨产也(1砷6T细胞在该急性感染模型中所起的作用。 结果: 1(在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中，Thl7免疫模式中的效应 小时迅速升高并达到峰值，各细胞因子的蛋白水平则在4小时开始升 高，在8小时达到峰值。 2(在中和体内IL(17后，由?(17诱导产生的趋化因子G(CSF、KC、 ?。(17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用 研究 肺内的炎症细胞由中性粒细胞为主转变为淋巴细胞为主，且炎症程度 是对照组的十倍，在感染后16小时后是对照组的100倍。 胞更高。 明显下降，并最终导致了肺内细菌负荷量的明显增加，其增高幅度与 抗几(17抗体组小鼠相仿。 5(在耗竭体内和T细胞后，该急性感染模型中Thl7免疫模式中的其他 相关细胞因子几(22和IL(23的mRNA和蛋白水平均明显下降，同 时转录因子RORyt表达水平也出现了显著降低。 结论:本研究证实了儿(17在该类感染的早期升高，并对机体具有 清除、防御功能;并首次发现7liT细胞是该模型中IL(17的主要来源细 胞;首先证实TST细胞通过产生几(17在该急性感染胞外菌的早期免疫 应答中起着防御性的保护作用。 关键词:白介素(17，Thl7，铜绿假单胞菌，俩T细胞，急性肺部感染 7INTHEACUTE INTERLEUKIN(1 THEROLEOF INMICE INFECTION P(AERUGINOSA ABSTRACT roleof conductedtodeterminethe ective:‘The was study Obj present andIL(1 cells intheacute IL一17 play 7(producing谛T ?? ? 一 ? ? ? infectlonmmice?? aeruginosalung in anacute infection Method:Establishingpulmonary旦aeruginosa Real-time miceinfected 1 intranasally(Using by with旦aeruginosa PAO mRNAand levelsof RT ELISAtodetectthe protein PCR Taqman and vivo model??In theinfection IL(1 andIL(23inthe from 7，IL(22 lung IL一17 inthe to theroleof IL(17inorder plays neun(alizationof invesgate in flow and infection cytometry acute mice(Using pulmonary只aeruginosa 7(Invivo sourcesoftheIL-1 todeterminethe depletion in吼unofluorescence thismodelvia outif Tcell an rolein astofind of Tcells 75 playimportant 75 IL(17( Results: were IL(17andIL。22 Thl7cellls mRNAlevelsof by 1(The producd a at4hours mRNA increased，with post―infection(The significantly peak werealso Thl7cells levelsofIL(23assosiatedwith 4hours(The levelsofthese a at cytiokines increased,with protein peak 8hours( at4 on startedtobedetected hours，peaked offourchemo and foundthelevel neutralizationinfection,we 2(Following anti-IL-17 fromthe theBALF 0mndMIP一2 in (kines G(CSF,KC，MIP-1 foundiouncl100[1liles (( 1-' 11 (We夕?? wealsolso lowerL U( 一 O(0 micewas"anificantl'lo significantly allIL一1 treatedwith morebacteriaintheBALFofmice main after16hours(The the controlmice comparedIgG((treated antibody micewere rather 7一treated cellsintheanti((IL--1 lymphocytes infiltrating tissue and than damage neutrophils(Consistently,more mice intheanti????IL_-17??-treated observed inthe were changes lung P O(01 ( SOurCeSof and Tcellsarethe IL-17， 3(Thl7cells IL(17(producing丫6 inthemodel?? thanThl7cells 11,(1 Tcellsaremore 7(producing , i IL-17levels cellsand found T infection,we of丫6 4(Followingdepletion micewas 1 (Then fromthe lower p O(0 significantly anti(丫6TCR(仃eated andthebacteria the main cells the of chemokines，theinfiltrating changes 4 ( 圭塑奎望查兰苎主堂垡望茎 _-_-l__?_-?_-__-_I?_-__--_________-____? _。。。’―。’’。。。。。。。’。’’――――――――――――――――一一 7-treated theanti-IL-1 miceall like laodfromthe just anti(ySTCR(treated 一 mlCe( and themRNA Tcellsand found of infection,we y8 5(Followingdepletion levelsofIL一23and all levelsof mRNA RORTt proteiIl IL(22，the decreased dramatically( IL-17 a that Conclusion:The demonstrates plays study present inmice??The role acute infection duringpulmonary只aeruginosa protective themain IL-??1 Tcellsare demomstrate isfirstto y5 study 7-??producing present cells a role andtheIL(1 protective oftheIL(17 play souI(Ce 7(producing庐T via几(17( inthemodel l cells， KEYWORDS:几(1 7，Th7，旦aeruginosa,市T ? ? 一 一 acute mtectlon Dulmonary 5 m(17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用研究 中英文对照缩写表 英文缩略语 英文名称 中文名称 IL(17 Interleukin(17 白介素(17 Z Pseudomonas 铜绿假单胞菌 aeruginosa aeruginosa lUPCR reverse 逆转录聚合酶 链反应 transcription―PCR ELISA Enzyme-linked 酶联免疫吸附试验 immunosorbent assay IL(22 Interleukin(22 白介素-22 IL(23 Intcrleukin-23 白介素(23 related ROgrt retinoic-acid??-receptor甲酸受体相关孤 儿受体竹 Vt orphanreceptor G(CSF granulocyte 粒细胞集落刺 激因子 factor colony―stinlulatillg BALF fluid bronchoalveolar支气管肺泡灌洗液 lavage KC ehemoattractant角质形成细胞 趋化物 keratinocyte q Q m(1 巨噬细胞炎症 蛋白(1 macrophageinflammatory o protein-1 MIP(2 巨噬细胞炎性 蛋白(2 macrophageinflammatory 2 protein RORC retinoicacid 甲酸受体相 关孤儿受体C receptor-related C orphanreceptor Deetin(1 dendriticcell(associated树突状细胞相 关性C型植物血 lectin-1， 凝素(1 C―type TCR Tcells T细胞受体 receptor H Hour 小时 PMN 多形核中性粒 细胞 polymorphonuclear 6 上海交通大学博士学位论文 neutrophil Lym( lymphocyte 淋巴细胞 MON( monocytes 单核细胞 ddH20 doubledistilatedwater 双蒸水 AhR hydrocarbonreceptor 碳氢化合物受体 CCR6 chemokine6 趋化因子受体6 receptor CCL20 巨噬细胞炎性蛋白-3a macrophageinflammatory protein-3a CFU unit 菌落形成单位 colony―forming TGF―p transforminggrowthfactor-p转化生长因 子-B IL(6 Intedeukin(6 自介素(6 n T cells T辅助细胞 help G- Gram-negative 革兰氏染色阴性 IFN-y Interferon-gamma干扰素吖 IL-4 Interleukin-4 白介素4 IL(5 Interleukin-5 白介素(5 IL(13 Interleukin(13 白介素(13 OD density 光密度 optical PBS BufferedSaline磷酸缓冲液 Phosphate EDTA APC allophycocyanin 别藻青蛋白 PE Phycoerythdn 藻红蛋白 FI’rC Fluorescein 异硫氰酸 荧光素 isothiocyanate 7 上海交通大学博士学位论文 I L-I 7在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用研究 ???』r!db’ 嗣罱 肺部感染是目前我国住院治疗的主要病种，更是我国院内感染的首位疾病。它 具有病情严重，病程长，病死率高，住院花费多等特性。革兰氏阴性菌是医院获得 其中以铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、大肠埃希杆性肺炎最主要的病原茵， 菌、肺炎 克雷伯杆菌等最为常见【?。在这些G-性菌中，铜绿假单胞菌 Pseudomonas acruginosa 肺炎由于患病率高，耐药率高，病死率高等原因备受关注【2】。 各种病原菌入侵机体时，机体的免疫系统是其面对的第一道防御、清除屏障。T 淋巴细胞是哺乳动物天然和获得性免疫系统中的主要成员，它通过多种功能效应在 感染性疾病中起着抵抗入侵病原菌的重要作用。T细胞根据它所表达的T细 胞受体 T cells 的辅助性T细胞则依据其产生细胞因子的不同又可分为Thl、Th2和Thl7细胞，同时 它们也是apT细胞。 胞类型以防御、清除细胞内病原菌，同时还可调控B细胞产生IgG2。Th2细胞则主要 通过产生IL-4、IL(5和IL(13等细胞因子调控嗜酸性粒细胞，嗜碱性粒细胞和粘膜上皮 细胞，在变态反应性疾病、寄生虫的清除中起着重要作用。但这两种免疫模式显然 缺乏对胞外菌感染防御、清除的功能作用【31。 factor， 能通过诱导细胞生成粒细胞集落刺激因子 granulocytecolony―stimulating G(CSF 和干细胞因子以及CXC型炎症趋化因子趋化和活化中性粒细胞等f7一。除此 气管上皮细胞的表达【1明;诱导肺上皮细胞表达人口防御素(2和巨噬细胞炎性蛋白 m(17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用研究 Thl7细胞是其主要分泌来源之一。IL(22能诱导抗微生物肽家族的成员， 13、防御素(2 细胞生成，在n117细胞的增生分化并稳定其表型中起着重要作用。其他能促进Thl7 7细胞的效应细胞因子不 分化、成熟的主要细胞因子还包括IL(6和TGF(p115,161。从n1 难推测Thl7细胞免疫模式在胞外菌感染的机体的过程中很可能起着重要的清除、防 御作用。 在这些效应细胞因子中，IL(17是非常重要的效应细胞因子，它已被证实与细菌 感染后的机体免疫应答有着密切的关联，并在肺炎克雷伯杆菌肺部感染中起着清除、 防御的作用[13,17-191。近来的研究发现:一些非传统的T细胞在体内外水平经适当刺激 或非感染性炎症过程中同样能分泌IL(17。在有关肺部结核分枝或在感染 杆菌感染的 研究中发现，市T细胞是分泌IL(17的主要来源细胞【2们。VSl巾T细胞在腹腔大肠杆菌 感染中通过产生IL(17进而趋化了中性粒细胞最终清除了病原菌【2l】。因此产IL(17的T 细胞不仅仅是Thl7细胞，帕T细胞也是重要的来源细胞。同时，有研究提示产IL(17 的免疫应答模式，并以此免疫应答模式参与在机体对抗病原菌入侵的保护性免疫应 答e尸c2n。 和产IL(17的Y6T细胞等 很可能参与在肺部急性铜绿假单胞菌感染的机体免疫应答过 程中，并起着清除、防御的保护作用。 及相关细胞因子IL(23与急性铜绿假单胞菌肺部感染早期免疫应答的相关性，论证铜 (17等细胞因子的产生。而后，我们绿假单胞菌的急性感染确实能诱导IL 将初步证实 IL(17在肺部急性铜绿假单胞菌感染早期的清除、防御功能，并明确其细胞来源。最 后，我们将探讨产IL(17T细胞在急性铜绿假单胞菌肺部感染小鼠模型中的作用。但 产IL(17T细胞包括了多种细胞，而鉴于俩T细胞在肺脏中较为丰富的分布，且研究发 在对抗入侵胞外细菌的早期免疫应答过程中起着重要作用，且其现俩T细胞 活性较 2 上海交通大学博士学位论文 0【肛细胞更为显著。由于目前对于丫6T细胞的研究仍较为匮乏，因此我们将先对产 的作用进行初步的探讨。通过本研究有望阐明IL(17在急性铜绿假单胞菌肺部感染过 以及初步探讨产IL(17丫6T细胞在此类感染中的作用。为程中所起作用， 该类感染的免 疫防治奠定理论基础，为疾病防治寻找新干预靶位提供新思路。 IL(17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用研究 7 第一部分:在急性铜绿假单胞菌肺部感染小鼠模型中Thl 细胞免疫模式相关细胞因子的表达 引言 铜绿假单胞菌肺炎是最主要的医院内获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎，该菌具 有生存能力强、容易在机体定植和发生交叉感染和爆发流行等特点。该病原菌的耐 率与日俱增:低于50,的铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物敏感，15,药 "--20,的铜绿假 单胞菌对碳青霉烯类产生耐药【231。该菌耐药机制复杂，易形成生物被膜，在抗生素 选择性压力下易筛选出多重耐药和泛耐药铜绿假单胞菌，感染后很难被清除，是临 床抗感染治疗失败和死亡的主要原因。 近年来，在有关Th细胞对细菌的免疫机制研究中取得了新进展:发现了一类产 子等。IL-22能诱导促炎症反应，促进多种细胞产生细胞因子，集落刺激因 炎症趋化 因子等;同时还能启动多种抗微生物肽的生成包括B(防御素，$100(家族蛋白等。IL(23 由活化的树突状细胞分泌，能促进Thl7细胞的增生、分化，并稳定其表型。已有研 在细菌感染中起着介导炎症，清除病原菌的作用。但目前尚无有关Thl7细胞免疫模 式在急性铜绿假单胞菌肺炎中表达情况的报道。 因此，我们建立了急性铜绿假单胞菌肺部感染的小鼠模型，在小鼠急性感染铜 支气管肺泡灌洗液 bronchoalveolar lavage 续表达变化。 4 上海交通大学博士学位论文 材料和方法 一，主要试剂 铜绿假单胞菌临床标准菌株PA01 获赠于上海交通大学生命科学技术学院许煜 mRNA 泉教授 ;小鼠淋巴细胞分离液 CedarlaneLaboratories，加拿大 ;Trizol 美国 ;RT(PCR timePCR kit TaKaRa,中国 ;real IL-23的ELISA抗体 R,D 英国 。 二、主要仪器设备 C倪培养箱 Hralforce，中国 ;超净工作台 苏净，中国 ;低温高速离心 ELISA 机 Hettich，德国 ;分光光度计 Bio-Rad，美国 ;multiplexassaysystem DRAGONWellscanMK DENLEY time Prism7900 美国 ;PCR仪 Bio-Rad，美国 ;realPCR仪ABI SDS-PAGE凝胶电泳及转移装置 Bio-Rad，美国 。 Biosystems，美国 ; 三、建立急性铜绿假单胞菌肺部感染小鼠模型 无菌级C57BL,6成年小鼠 购自中国科学院上海实验动物中心生产许可证: 雌雄性别配对，饲养于无菌环境中，室温保持在23- -2" 2。有关实验动物的操作和处 理均遵循 实验动物管理与使用操作技术规程》 中国科学院上海生命科学研究院实 验动物中心暨国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心制定 。 nln 的波 的培养箱复苏过夜，取稳定期细菌经清洗后，应用PBS配所需菌液。在405 段以分光光度仪测定菌液浓度的OD值，并同时稀释菌液平铺于LB琼脂平板表面孵 育过夜后进行菌落计数，以确认所配菌液浓度。 m(17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用研究 在本研究中，小鼠经腹腔注射2(5,戊巴比妥钠麻醉后，经鼻吸入铜绿假单胞菌 X108,CFU左右。感染组小鼠每组5 PAOI的悬液，两个鼻孔各lOlal，菌液浓度在1 只，同时以PBS建立对照组小鼠，每组5只。 四、BALF中细胞因子的测定 PBS 含0(5mM 被处死后气管切开插管进行支气管肺泡灌洗，前后注入后回吸lml 以及IL(23的浓度。 五、肺部单个核淋巴细胞抽提及其总RNA的提取 处死后气管切开插管进行支气管肺泡灌洗后，取出肺组织予以研磨获得细胞悬液， 应用小鼠淋巴细胞分离液，获得小鼠肺组织中的单个核淋巴细胞，调整细胞浓度约 为5X 5 小心转移上层水相至另一离心管中，加入100ul异丙醇，缓慢充分混匀后，室温放 解;7 紫外分光光度计260hm测定RNA浓度，并以260,280nm比值以及1,琼脂糖凝胶 电泳检测RNA的质量。 六、realtime RT―PCR TaqMan timeRT-PCR Ex 将mRNA反转录成cDNA。参照real kit PremixTaq值，TaZaRa 的 time PremixEx 说明进行real Taq疆 2X ，0(4 PCR Taqman ，反应体系如下:lOlL ROXreference IsL 30秒预变性:而后 的PCR 10洲 (2此eDNA，以及6此dH20。PCR反应程序为95"C 6 上海交通大学博士学位论文 time threshold RT―PCR的扩增曲线和溶解曲线，进行PCR定量，得到循环阈值 cycle values，Ct 引物及探针如下: CCGTTCCACGTC M(IL(17正向引物:5’(CCTCAA AC(3， CCG TGACACA-3’ M-IL(17反向引物:5’(11rCCCT CAT GIGTTCC M(IL(22正向引物:5'-CCCAGTCAGACA AG(3’ CAGTIC M-IL-22反向引物:5'-CATAAACAGCAGGTC C(3’ ACTAG(3’ M(IL(23正向引物:5’(GCAACTTCACACCTCCCT C(3’ M(IL(23反向引物:5’(CTGCCACTGCTGACTAGAACT TCCTTCGrrG(3’ CTTTGCAGC M(p(actin正向引物:5’(CTT GCC GAGGGGAATACACG(3’ M(p(actin反向引物:5’(ATG M(IL(1 7(探针:5’(TGGACTCTCCACCGCAATGAAGAC(3’ A-3’ M(IL(22(探针:5'-CGCCTTGATCTCTCCACTCTCTCC M(IL(23(探针:5’(ACTCAGCCAACTCCTCCAGCCAGA(3’ CACCCGCCACCAGTrCG-CC(3’ Mouse(D(Actin(探针:5’(CCA 七、统计学分析 数据均以均数?标准差表示。两组间比较采用双边非配对t检验，p o(05 视为 有统计学显著性差异。 7 IL(17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用 研究 结果 一、建立了小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型 在本研究中需要建立急性铜绿假单胞菌肺部感染小鼠模型模型，我们参照国内 外文献,瑚以及结合自己的实验经验，建立了该动物模型。如图1所示经鼻吸入一定 X 浓度 1 小时后，造成其支气管周围以及肺实质中出现了多种细胞 中性粒细胞，淋巴细胞 等 浸润的急性炎症反应 见图1A ，而吸入PBS的对照组小鼠肺部则基本正常，未见 明显炎症反应 见图1B 。 二、铜绿假单胞菌急性感染小鼠肺部后Thl7免疫相关细胞因子mRNA水平的 变化 为了研究铜绿假单胞菌肺炎对Thl7细胞免疫应答模式中相关细胞因子mRNA水 平的影响，本实验采用了经鼻吸入铜绿假单胞菌造成小鼠肺部急性感染的模型，分 RT-PCR mRNA的表达水平。结果 Taqmaa 测定肺部单个核细胞中IL(17、IL(22以及IL(23 表明小鼠在急性感染铜绿假单胞菌后，肺内11117免疫模式中的效应细胞因子IL(17和 mRNA 疫相关的IL(23 的mRNA表达均在急性感染铜绿假单胞菌小鼠的肺内明显增高，且这三种细 胞因子 mRNA水平随时间变化的模式都十分相仿。 三、铜绿假单胞菌急性感染小鼠肺部后Thl7免疫相关细胞因子蛋白水平的变化 为了进一步明确铜绿假单胞菌急性感染是否也影响Thl7细胞免疫相关细胞因子 8 上海交通大学博士学位论文 中均明显增高，说明急性铜绿假单胞菌感染能诱导肺组织局部产生Thl7细胞免疫的 所升高，两者也都在84,时达到最高峰，较PBS对照组有统计学差异 见图2D和图3D ， 随后它们的蛋白水平逐渐下降。在这个急性感染过程中，IL(17和IL(22蛋白水平随时 间变化的模式也彼此十分相仿。同时，急性感染亦诱导了n117细胞免疫的相关细胞 式也与IL(17、IL(22相仿。 A PBSCon仃oI PAO1 Infection 图l急性铜绿假单胞茵肺部感染小鼠模型的建立 1(EstablishaacutePseudomonas infectioninmice Figure aeruginosalung 为1×10s,CFU。图A为小鼠感染8小时后，取肺组织固定、切片、HE染色(图 B为同一时间节 点，PBS非感染对照组小鼠肺组织HE染色(图像均为放大10倍。 IL(17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作 用研究 A B 暑 茎 饕 c譬口予盘2 《o Z 嘭 量 h - j 0 ? 8 12 盈 柏 72 g罨I蕾毒^I 暑一。盘差E卜3一 hours C D 善 曹 i 旦 营 翟 0 ^一差一co暑口3屯6毛h--1一 二 O 4 B 12 24 4e 72 4h 8h houm 图2急性铜绿假单胞茵肺部感染小鼠模型中?，17mRNA和蛋白水 平的表达 2(EffectsacutePseudomonas infectiononIL-17inmice lung Figure aeruginosa 细胞抽提RNA，以realtime mRNA的表 达变化，以p(actin作为 RT-PCR Taqman 测定IL(17 达变化(图A为IL-17mRNA在小鼠感染后各时间点的表达水平，图B为PA01感染组和PBS 对照组小鼠分别在4小时和8小时的IL(17mRNA水平比较(图c为儿(17 蛋白水平在小鼠感染 白水平比较每组小鼠:5只(数据以均教?标准差表示(所有的实验至少重 复3次，?P 0(01( 10 。 上海交通大学博士学位论文 A B 三 召 ’ a‰ 2 譬_薯。墨oi g一墨98(^I等一星差E翌一 O ? 8 12 弘 船 住 02童?-9窜。，警童。譬差暑登一 4h 8h houri C D 善 室 蔓 莒 墨 熨 童 一ltlI爱一 co爱j堇翌一 O 4 8 住 舶 棚 讫 4h 8h houm mI讯A和蛋白 水平的表达 图3急性铜绿假单胞茵肺部感染小鼠模型中?，22 acutePseudomonas infection011IL-22inmice 3(Effects lung Figure aeruginosa 细胞抽提RNA，以realthne mRNA的表达变化，以p??a瓯证作为 RT-PCR Taqman 测定IL(22 上样内参(同时在各时间点进行肺泡灌洗获得BALF，以ELISA的方法测定儿一22蛋白水平的表 达变化(图A为IL-22 对照组小鼠分别在4小时和8小时的IL(22mRNA水平比较(图C为IL(22蛋白水平在小鼠感染 白水平比较每组小鼠:5只(数据以均毒如标准差表示(所有的实验至少重复3次，?P 0(01( 1l m(17垄尘墼璺丝塑堡堡璺丝堕堕塑壁銎蔓型主丝堡旦堑塞 II--_--?__-_-____-_?l__―_――_―_――――――――――――――――――――――――――――一一 一一 A B 黑 芎 eft( 2 舌甾蟹1(-98搴一篇i叱0乏叱 E 霜 ? ? ?t ’ ’ j ' At 丘 '12 24 船 7: 4h 8h houm C D 善 室 重 营 童 A 翌 一薯JI墨一暑;譬poJd?j一 houm mRNA和蛋白水平的表达 图4急性铜绿假单胞茵肺部感染小鼠模型中II，23 on inmi? infection acutePseudomonaslung 4(Effects aeruginosa Figure I―L-23 RT-PCR Taqman 测定FL-23 细胞抽提RNA，以rcaltime mI州A在小鼠感染后各时间点的表达水平， 图B为PA01感染组和PBS 达变化(图A为IL(23 mRNA水平比较(图C 为IL??23蛋白水平在小鼠感染 对照组小鼠分别在4小时和8小时的IL(23 白水平比较每组小鼠:5只(数据以均擞土标准差表示(所有的实验至少 重复3次，?P 0??01?? 12 上海交通大学博士学位论文 讨论 铜绿假单胞菌肺炎是最主要的医院内获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎，该菌具 有生存能力强、容易在机体定植和发生交叉感染和爆发流行等特点。该病原菌的耐 药率与日俱增:低于50,的铜绿假单胞菌对喹诺酮类药物敏感，15,"-'20,的铜绿假 单胞菌对碳青霉烯类产生耐药幽】。该菌耐药机制复杂，易形成生物被膜，在抗生素 选择性压力下筛选出多重耐药和泛耐药铜绿假单胞菌，感染后很难被清除，是临床 抗感染治疗失败和死亡的主要原因。因此，为该类感染寻找新的防治措施势在必行。 机体的免疫系统是防御、清除入侵病原菌的第一道屏障，它在识别入侵病原茵 后即迅速启动并对机体予以保护。在此系统中，T淋巴细胞是哺乳动物天然和获得性 免疫系统中的主要成员，它通过多种功能效应在感染性疾病中起着抵抗侵入病原菌 近来关于细菌感染的免疫研究中发现Thl7细胞的免疫应答的重要作用。在 将有利于 机体对病原菌的抵抗。 在我们的研究结果中发现，Thl7细胞免疫应答过程中的效应细胞因子及相关细 胞因子在铜绿假单胞菌急性感染小鼠肺部的模型中均在早期迅速升高，且各细胞因 势基本吻合。在已有的研究中也发现IL(17在肺炎克雷伯杆菌肺炎的小鼠模型中升高， 而体外实验也证实了IL(22在肺炎克雷伯杆菌感染支气管上皮细胞中升高 [13,17-18】。 Dubin等【26l在慢性铜绿假单胞菌肺部感染的模型小鼠肺内以及囊性纤维化患者痰中 也发现这些因子的增高，但对于急性铜绿假单胞菌肺部感染中它们的变化，目前尚 我们的研究结果提示了急性铜绿假单胞菌的体内感染能在早期就未有报道。 能诱导 效应细胞因子IL(17的明显升高，并且很可能激活并诱导了T细胞呈现Thl7细胞免疫 力口。 在已知的Thl7细胞免疫模式中，IL(17是重要的效应细胞因子，它能诱导生成中 性粒细胞趋化因子、粒细胞集落刺激因子等。研究已证实IL(17在一些感染性疾病中 也(17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用研究 起着增强机体清除、防御入侵病原菌的重要作用。因此，这部分的结果为我们进一 步探讨IL-I?在该模型中的作用奠定了基础。 的丫6T细胞还能分泌IL(22，很可能具有与’n117细胞十分相似的免疫应答方式。因此 中相关细胞因子的激活升高，也这部分研究结果提示了Thl7细胞免疫模式 为我们进 一步探讨产IL-17T细胞，特别是产IL(1778T细胞提供了研究的可能性。 14 上海交通大学博士学位论文 第二部分:IL(17在小鼠急性铜绿假单胞菌 肺部感染模型中的作用 引言 和细胞结合并传导信号，这一受体广泛分布于间充质细胞上，如上皮细胞、内皮细 胞、成纤维细胞等[329]。 granulocytecolony―stimulating 子趋化如角质形成细胞趋化物 keratinocyte 5B MUC5B 在人支气管上皮细胞的表达;诱导肺上皮细胞表达人p防御素(2和巨噬细 蛋白(3a CCL20 。从而使肺组织对侵入病原菌的清除能力增加。由胞炎性 此可见， IL(17很可能在病原菌感染机体的免疫应答过程中起着重要作用。目前已有的研究发 现IL(17在一些病原菌感染的过程中如肺炎克雷伯杆菌肺炎，大肠埃希菌的肠道感染 等起着增强机体清除、防御入侵病原菌的重要作用。 铜绿假单胞菌是G(性菌条件致病菌，在环境中分别广泛，是院内获得性肺炎最 常见的病原菌。铜绿假单胞菌可以造成急性和慢性的肺部感染，特别是在免 疫功能 受损的患者中【301。然而目前有关IL(17在铜绿假单胞菌慢性气道感染的小鼠模型中的 研究结果却提示也(17的升高只是促进并维持了肺部的慢性炎症反应，随着IL(17水平 的降低，气道炎症指标也随之明显下降。但对于肺内细菌的负荷量没有影响，由此 认为IL(17在铜绿假单胞菌慢性感染的过程中并未起到清除、防御病原菌的功能。这 是否意味着机体对铜绿假单胞菌的清除、防御过程与IL(17这一途径无关，IL(17不具 几(17在小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型中的作用研究 有清除这一病原菌的作用?然而结合之前的其他研究结论，我们提出了这个的设想: IL(17可能在急慢性铜绿假单胞菌肺部感染的免疫应答中起着不同的作用。由此，我 们下一步的研究开始论证IL(17在急性铜绿假单胞菌肺部感染过程中所起的免疫作 用。 材料和方法 一、主要试剂 铜绿假单胞菌临床标准菌株PA01 获赠于上海交通大学生命科学技术学院许煜 泉教授 ，KC、G-CSF、MIP-1Q、MIP-2的ELISA抗体 R,Dsystems，美国 ，酵 Inc(，美国 。 艇染色试剂盒 碧云天，中国 ，Diff-Quik染色液 IMEB 二、主要仪器设备 C02培养箱 Hralforce，中国 ;超净工作台 苏净，中国 ;低温高速离心 ELISA assaysystem 机 Hettich，德国 ;分光光度计 Bio-Rad，美国 ;multiplex DRAGONWellscanMK DENLEY Fisher E600 Scientific，美国 :显微镜 NikonMicroscope，日本 。 三、抗体中和 在建立小鼠急性肺部感染模型之前，我们先给予抗小鼠IL-17抗体中和 经铜绿假 u 经腹腔注入抗小鼠IL-17单克隆抗体 50104;R&DSystems ，200g,只;时， 平 II 行对照组小鼠腹腔注射同型对照抗体IgG2a 54447，R&DSystems ，200g,R汹J。 四、建立小鼠急性铜绿假单胞菌肺部感染模型 无菌级C57BL,6成年小鼠 购自中国科学院上海实验动物中心生产许可证: 16 上海交通大学博士学位论文 雌雄性别配对，饲养子无菌环境中，室温保持在23+2" 2。有关实验动物的操作和处 理均遵循《实验动物管理与使用操作技术规程》 中国科学院上海生命科学研究院实 验动物中心暨国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心制定 。 11m 的波 的培养箱复苏过夜，取稳定期细菌经清洗后，应用PBS配所需菌液。在405 段以分光光度仪测定菌液浓度的OD值，并同时稀释菌液平铺于LB琼脂平板表面孵 育过夜后进行菌落计数，以确认所配菌液浓度。 在本研究中，小鼠经腹腔注射2(5,戊巴比妥钠麻醉后，经鼻吸入铜绿假单胞菌 X 108,CFU左右。分别感染抗IL(17 PA01的悬液，两个鼻孔各10Ul，菌液浓度在1 PBS非感染对照组 每组蹦只 。 五、BALF中趋化因子浓度的测定 小鼠经鼻急性感染PA01后，分别在8和16小时处死小鼠，进行气管切开插管 予以支气管肺泡灌洗，前后注入后回吸lmlPBS 含0(5raMEDTA 共3次。即 时离 浓度。 六、BALF中各类细胞的分类 小鼠经鼻急性感染PA01后8小时处死小鼠，进行气管切开插管予以支气管肺 泡灌洗，前后注入后回吸lmlPBS 含0(5mMEDTA 共3次。即时离心后取上清(80"C 冻存，同时将所获得的细胞放入涂片机中，甩片后获得单层细胞涂片。将细胞涂片 胞形态特性