[doc] 杂色曲霉素对人外周血单个核细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的影响

[doc] 杂色曲霉素对人外周血单个核细胞表面HLA-Ⅰ分子表达的影响 杂色曲霉素对人外周血单个核细胞表面 HLA-?分子表达的影响 第34卷第4期 4542005年7月 卫生研究 JOURNALOFHYGIENERESEARCH VO1.34NO.4 Ju1.2005 文章编号:1000.8020(2005)04-0454-03?论着? 杂色曲霉素对人外周血单个核细胞表面HLA一工分子表达的影响 邢凌霄张祥宏李月红严霞王俊灵王凤荣 河北医科大学基础所病理室,石家庄050017 摘要:目的探讨杂色曲霉素(sT)对体外培养的人外周血单个核细胞表面(HPBMc)HLA-1分子表达的 影响.方法采用流式细胞定量术(FCM)和免疫印迹(Westernblot)分析方法,研究不同浓度ST(0.125,0.25, 0.5,1和2mL)处理后人外周血单个核细胞表面HLA.1分子表达的变化.结果FCM定量分析结果表明, 经不同浓度ST处理24小时后,与对照组相比,各组细胞HLA.I的平均荧光强度均降低,以较高浓度(0.5,1 和2mg儿)ST处理组降低更明显(P<0.05).在0.125mg/L到2mg/L 的浓度范围内,随ST处理浓度的升高, HLA.I荧光指数逐渐降低,两者呈明显的负相关(r=一0.841,P<0.01) 免疫印迹结果也表明,随sT浓度 的增高,HLA.1分子降低越明显.结论提示在0.125mg/L到2mg/L的 浓度范围内,ST抑制人外周血单个核 细胞表面HLA.1分子的表达呈现出负的剂量一反应关系. 关键词:杂色曲霉素HLA.1分子流式细胞定量术免疫印迹分析人外 周血单个核细胞 中图分类号:TS207.4R155.51文献标识码:A EffectsofsterigmatocystinonHLA-Iexpressionofhuman peripheralbloodmononuclearcellsinvitro XingLing—xiao,ZhangXiang—hong,LiYue—hong,YanXia,eta1. LabofExperimentalPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China Abstract:0bjectiveTostudytheeffectsofsterigmatoeystin(ST)onHLA-Iofhumanperipheralblood mononuelearcells(HPBMc)invitro.MethodsTheexpressionofHLA.IofHPBMcbySTpretreatmentatsixdifierent dosages(0,0.125,0.25,0.5,l,2mg/L)weredetectedwithFloweytometry(FCM)andWesternblotrespectively.Results FCMquantitativeanalysisrevealedthattheexpressionsofHIA.IofHPBMci nvitroasrepresentedbyfluorescence intensityafterSTtreatmentfor24hrsatallthefiveexperimentalconcentrationswerealllowerthanthatoftheeontrol group.Theinhibitingeffectsatrelativelyhigherconcentrationgroups(0.5,land2mg/L)wereofsignificance(P< 0.05).Adose-effectrelationshipbetweenSTconcentrationandtheinhibitingeffectonHLA—Iexpressionwasfoundatthe concentrationrangefrom0.125mg/Lto2mg/L(r=0.841,P(0.01).WesternBlottingresultsfurtherconfirmedtheabove 55.65mg/kg….由于桔青霉素的产生与发酵用菌种,生产方 法,工艺条件和基质成分有关,与国外研究结果相比较,本次 调查国产红曲制品中桔青霉素含量高于国外,说明中国红曲 菌种产桔青霉素能力高于国外菌种,生产条件利于桔青霉素 的产生,迫切需要改进生产工艺,推广低产或不产桔青霉素的 红曲菌种.本次研究结果仅代表红曲原料和少部分保健终产 品中桔青霉素的含量,由于红曲红色素粉和红曲米常用于食 品,药品和保健食品的配料,在终产品中占的份额较低,因此 含有红曲红色素和红曲米粉原料,供人类食用的最终产品中 桔青霉素水平可能较目前的检测结果低,桔青霉素在这一类 终产品中的污染水平尚待进一步研究. 基金项目:河北省自然科学基金重点资助项目(No.301350);国家 科技部基础研究重大项目前期研究专项资助项目 (No.2001CCCO0500) 作者简介:邢凌霄,女,讲师,医学博士 1通讯作者:张祥宏,男,教授,博士生导师 4参考文献 1BlancPJ,LaussacJP,LebarsJ,eta1.CharaeteraizationofmonascidinA formMonascusascitrinin.IntJFoodMierobiol,1995,27:201.213 213本食品添加物协会.食品添加物公定书.第7版.红曲红色素. 1999,1238.1241 3GtM926.85红曲米国家标准 4UeharaH,HasegawaN,ChangYJ.ThetrendofMonascuscolorin Japan.2000东方红曲国际学术研讨会论文集,2000,201.203 5BlancPJControloftheProductionofCitrininbyMonascus.法国图卢兹 红曲生产及应用研讨会论文集,1998,1.18 6Sabatar?VilarM,RoelFM,Fink.GremmelsMJ,Mutagenieityof commercialMonascusfermentationproductsandtheroleofeitrinin contamination.MutRes+1999.444:7.16 7李凤琴,许赣荣,李玉伟,等.食品工业用红曲菌株产桔青霉素能 力的研究.卫生研究,2003,32(6):602.606 (2005.04.27收稿) 第4期刑凌霄,等.杂色曲霉素对人外周血单个核细胞表面HLA-1分 子表达的影响455 resu1ts.ConclusionWithinthed.sagera”gefrom0.125mg/Lt.2mg/L,STcou ldinhibittheexpressi.n.fHLA-I.f HPBMcinvitronegativedose-dependently. I,flowcytometry,WesternBlotting,ha Keywords:sterigmatocystin,HLA— manperipheralbloodmononuclearcell HL,.I类抗原是参与机体免疫的重要的细胞表面分子. 研究发现,许多肿瘤中可见HL,一I类分子的不表达和低表达 现象”‘.离体实验结果显示,环境因素可影响正常细胞表面 HL,.I的表达].因此,环境因素在恶性肿瘤发生中的意义 逐渐引起学术界的关注. 杂色曲霉素(sterigmatocystin,ST)是具有致癌作用的真菌 毒素,在粮食和饲料中的污染非常普遍,是河北省南部太行山 恶性肿瘤高发区居民粮食中的重要优势污染霉菌毒素之 一 l4”] .有人发现潮湿居所的地毯灰尘也可检出杂色曲霉素 的污染”].本研究组的初步研究表明,sT除具有致癌作用 外,对机体的细胞免疫功能可产生一定程度地抑制作用. 为进一步探讨sT对机体免疫功能的可能影响,本研究采用流 式细胞术(flowcytometry,FCM)和免疫印迹(WesternBlotting)方 法,观察了sT对体外培养的人外周血单个核细胞表面HL,一 1分子表达的影响. l材料与方法 1.1主要仪器与试剂 杂色曲霉素(ST),小鼠抗人HLA.I单克隆抗体为Sigma 公司产品,新鲜健康成年人外周静脉血由河北省血液中心提 供.预染标准蛋白Marker为NEWENGLANDBiolabs产品.淋 巴细胞分离液购自上海试剂二厂.FACS420型流式细胞仪为 美国BD公司生产.杂色曲霉素溶液的配制:每1mgST中加 入1mlPBS(pH7.4)配制1mg/ml的STPBS溶解液,分装后于一 20~(2保存. 1.2人外周静脉血单个核细胞的分离与培养 取健康成人新鲜血200ml,采用聚蔗糖.泛影葡胺密度梯 度离心法分离单个核细胞,主要步骤如下:新鲜抗凝静脉血 200ml加等体积的PBS稀释,吸取淋巴细胞分离液15ml置于 50ml离心管中.然后小心将2倍体积的稀释血加在淋巴细胞 分离液上,2000r/min离心25min,小心吸出分层液与血浆交界 处的灰白色浑浊层(单个核细胞),PBS洗涤2次,按1×106个 细胞/ml的浓度接种于含10%胎牛血清,10U/L青霉素, 100mgCL链霉素的RPMI.1640培养基中,加入植物血凝素 (PHA)至终浓度300gg/m1,37?,5%CO,培养. 1.3实验分组与处理 将单个核细胞按上述方法培养48h后,更换不含PHA的 新的RPMI.1640培养基,随机分为1个阴性对照组和5个实验 组,实验组加入STPBS溶解液,使终浓度分别达到0.125, 0.25,0.5,1和2mg/L,对照组加入等体积的PBS.孵育24h后, 用PBS洗涤细胞2次,更换不含sT的RPMI.1640培养基,继续 培养24h,1000r/min离心收集细胞待测. 1.4流式细胞定量术样品的制备及mA.I检测 1000r/min离心收集细胞,PBS洗3次,1%多聚甲醛固定, 4~C保存待测.HL,.I检测采用间接免疫荧光法,离心收集 细胞以冷PBA(PBS中加入牛血清白蛋白和叠氮钠使其终浓 度分别为2%和0.1%)洗涤,1000r/min离心弃上清,加入 200tdPBA稀释的小鼠抗人HLA.I单克隆抗体轻吹混匀,4~C 孵育30n1in,PBA洗涤1次,加入200tdPBA稀释的荧光素标 记的第二抗体,轻吹混匀,避光4~C孵育30min,冷PBA离心 洗涤2次,细胞重悬于200taPBS,混匀,置流式测试管中,以 FACS420型流式细胞光度仪进行定量检测.以荧光强度示细 胞HLA.I的相对含量,以平均荧光值计量各组细胞HLA-I 的表达量. 1.5细胞膜蛋白的提取及定量 采用非离子型去污剂提取淋巴细胞膜蛋白,1000r/min离 心收集1×10个细胞,以4~C预冷的PBS洗涤2次,将细胞沉 淀重悬于100taTritonX.100裂解液(300mmol/LNacl,50mmol/L Tris.HCl(pH7.6).0.5%TritonX.100,1mmol/LPMSF)中,4oC放置 30min,期间轻摇,然后于4?12000r/min离心15min,小心吸取 上清(含膜蛋白),于.20~C保存备用,采用改良福林.酚法,以 BSA为标准蛋白,测定样品蛋白浓度. 1.6免疫印迹分析 根据定量结果,取各组蛋白样品80g,经10%SDS变性不 连续聚丙烯酰胺凝胶(SDS.PAGE)电泳后,电转移转膜至硝酸 纤维素薄膜(NC膜)上,将膜用5%BSA封闭过夜,加入1:100 稀释的小鼠抗人的HL,I抗体反应4h,TI’BS洗膜3次后,加 入生物素标记的二抗反应2h,TI’BS洗膜3次,加入过氧化物 酶标记链酶卵白素,室温反应1h,DAB显色. 1.7统计学处理 采用SPSS软件进行方差分析,数据用?s表示. 2结果 2.1sT对人外周血单个核细胞表面HLA.I表达的FCM定 量分析 FCM检测结果表明,经不同浓度sT处理24h后,各组人 外周血单个核细胞(HPBMc)表面HL,.I的平均荧光强度分 另U为,对照组:(6.77?0.16),0.125mg/L组:(6.43?0.52), 0.25mg/L组:(6.25?0.35),0.5mg/L组:(5.64?0.25),1rag/L 组:(5.38?045),2mg/L组:(5.36?0.23),均较对照组降低, 以较高浓度(0.5,1和2rr-g/L)sT处理组降低更明显(P< 0.05).在0.125mg/L到2mg/L的浓度范围内,随sT浓度的升 高,HL,I荧光指数逐渐降低,两者呈明显的负相关(r= 0.841,P<0.Ol,n:5). 2.2免疫印迹分析ST对人外周血单个核细胞表面HLA.I 表达的影响 细胞膜蛋白提取液经SDS.PAGE电泳,转膜及显色,阳性 条带显示为棕黄色.以蛋白标准Marker为参照确定HL,.I (43kDa)的位置.免疫印迹结果表明,各个sT处理组HL,.I 的表达均较对照组降低.以0.5,1和2mg/LST处理组HL,.1 分子的表达降低更明显(见附图). 3讨论 机体的免疫监视作用在肿瘤预防和抑制肿瘤发展过程中 发挥着关键的作用,HL,.I类分子的正常表达是维持机体免 疫监视功能的重要环节.近年来国外学者研究表明,某些环 456卫生研究第34卷 632 ?HlA.1 1:阴性对照;2:ST0.125mg/L;3:ST0.25mg/L; 4:ST0.5mg/L;5:ST1medL;6:ST2mg/L 附图免疫印迹分析不同浓度ST处理后 人外周血单个核细胞HLA.I表达 FigureHLA?Iexpressionofhumanperipheralblood mononuclearceilstreatedwithSTbyWestcrnBlot 境因素可影响正常细胞表面HLA—1分子表达,从而影响细胞 的免疫功能,促使恶性肿瘤的发生.Fine等研究发现,烟叶可 引起许多类型肿瘤的形成,烟叶提取物可导致原角质细胞表 面HLA.1表达的降低,作者认为由于细胞HLA.I的降低可能 有助于细胞逃避免疫监视,使癌变发生成为可能j. 杂色曲霉素是致癌性的霉菌毒素.目前有关sT的研究多 集中于其致癌性,生物合成和检测方面.近年来,有关 霉菌毒素对机体免疫机能的影响已经越来越多地引起了生物 医学界的重视,但国内外有关sT对机体免疫功能影响的研究 尚不多.因此,为进一步探讨河北省南部太行山恶性肿瘤高 发区居民粮食中常见污染霉菌毒素的生物学意义,研究sT除 致癌作用外是否还存在免疫毒性效应,本实验观察了不同浓 度sT对人外周血单个核细胞表面HLA—I类分子表达的影 响.FCM结果表明,在体外培养的单个核细胞经sT处理24h 后,其表面HLA.I类分子的表达下降,且随sT浓度的升高, HLA—I类分子的表达降低越明显,二者呈明显的负相关. WesternBlotting的结果也进一步表明,sT在较高浓度时可明 显抑制单个核细胞表面HLA—I类分子表达.因此,本研究从 单个细胞和细胞群体的层面上均证明了sT可抑制单个核细 胞表面HLA.I类分子表达.提示sT除其致癌作用外,还可 抑制单个核细胞表面HIJA—1分子的表达,从而影响机体的免 疫应答功能.结合本研究室既往有关sT对体外培养的人外 周血淋巴细胞凋亡和白细胞介素一?分泌影响的研究综合分 析’”,可见sT对机体可能存在一定的免疫毒性. 有关HLA—I降低的机制主要包括重链及tTl的基因突 变,表达调控异常和抗原加工分子TAP,LMP异常等.HLA—I 类分子和TAP的低表达常预示着肿瘤的临床进程加快和预 后不良.Fine等研究表明,用TAP1转染细胞,可以恢复烟 叶提取物引起的细胞表面HLA—1分子的表达;Corrias等认为 人种经母细胞瘤细胞株HLA.1分子表达的降低,可能有许多 因素参与(如TAP-1,TAP-2和tapasin等).研究组以往的 研究已证实,sT可抑制体外培养的人外周血单个核细胞TAP 1的表达,且在较高浓度时抑制作用最明显,与HIJA的变 化相似.有关杂色曲霉素处理降低人外周血单个核细胞表面 HLA.I的表达的机制尚需进一步研究. 本研究探讨了sT对体外培养的人免疫细胞一淋巴细胞 和单核细胞表面HLA.I类分子表达的影响,发现sT可降低人 免疫细胞表面HLA—I类分子表达,提示sT可通过降低免疫细 胞表面参与免疫监视作用的重要分子的表达,负面影响机体 的免疫监视作用,可能在肿瘤的发生中发挥一定的作用,应引 起肿瘤工作者的重视. 4参考文献 IDanielJH,FrancescoMM.SoldanoF.HLAclassIantigen downregulationinhumancancers:Tcellimmunotherapyrevivesanold story.MolMedToday,1999,5:178—186 2SetteA,ChesnutR,FikesJ.HLAexpressioninCDllcer:Implicationsfor 263 Tcell—basedirnmunotherapy.1mmunogenetics,2001,53:255— 3FineCI,HanCD,SunX,eta1.TobaccoreducesmembraneHLAclass Ithatisrestoredbytransfectionwithtransporterassociatedwithantigen processingIcDNAJImmuno1.2002,169(10):6012—6019 4ZhangXH,XieTX,LiSS,eta1.Preventivedetectionoffungiand mycotoxinsinCOITIfromhighriskareaofesophagealcancerinCixian 176 County.ChinJCancerRes.1995,7:172— 5ZhangXHXieTX.LiSS,eta1.Contaminationoffungiandmycotoxins infoodstuffsinhighriskaI;eaofesophagealcancer.BiomedEnvironSci. 1998.11:140—146 6楼建龙,田禾菁,盂昭赫.等.胃癌肝癌高发区和低发区粮食中杂 色曲霉素污染量调查.卫生研究.1995,24:28—32 7EngelhartS,LoockA,SkutlarekD.etalOccurrenceoftoxigenic Aspergillusversicolorisolatesandsterigmatocystinincarpetdustfrom dampindoorenvironments.ApplEnvironMicrobio1.2002.68(8):3886— 389o 8黄向华.张祥宏,严霞.等.杂色曲霉素对体外培养人外周血白细 胞介素.?分泌影响的研究.卫生研究.2002.3I(2):I12.I14 9邢凌霄.张祥宏.李月红,等.杂色曲霉素对小鼠脾细胞IL-2及 IFN.7分泌和表达的影响.中国病理生理杂志.2004.20(3):306— 310 10FengGH,LeonardTJCultureconditionscontrolexpressionofgenesfor aflatoxinandsterigmatocystinbiosynthesisinAspergillusparasiticusand 2277 A.nidulans.ApplEnvironMicrobiol,1998,64(6):2275— 1I曹文军,孙旭明,张祥宏,等.杂色曲霉素对人胚肺成纤维细胞 p53和ras基因致突变研究.卫生研究,2000,29(3):175.177 12张祥宏,王风荣,王俊灵,等.真菌及其毒素诱发肺癌的动物实验 研究.北京大学(医学版),2003.35(I):4-6 13SunXM,ZhangXH,WangHY,eta1.EffectsofSterigmatocystin, DeoxynivalenolandAflatoxinGIonApoptosisofHumanPeripheralBlood Lymphocytesinvitro.BiomedEnvironSci.2002,15:145—152 14CorriasMV,OcchinoM.CroceM.etalLackHLA.classIantigensin humanneuroblastomacells:analysisofitsrelationshiptoTAPandtapasin expression.TissueAntigens,2001,57(2):110?117 15邢凌霄,张祥宏,李月红,等.杂色曲霉素对人外周血单个核细胞 TAPI及LMP2基因表达的影响.中国肿瘤临床.2004,31(4):189. 192 (2004-08—19收稿)