脐带血,成人外周血的干祖细胞检测及CFU—GM与CD34^＋细胞百分率？…

脐带血,成人外周血的干祖细胞检测及CFU—GM与CD34^＋细胞百分率？… 脐带血,成人外周血的干祖细胞检测及CFU —GM与CD34^，细胞百分率,… 『-j 辽宁医学杂志1998年第12卷第5期 脐带血,成人外周血的干祖细胞检测及 CFU—GM与CD34+~HI胞百分率相关性研究 中国医科大学第二临床学院输血科(110003)刘显智张锦华 I/13 尺 摘要文利用桥联酶标APAAP技术,用CD34单抗QBEND10标记脐血和外周血造血干知胞,同 时采用体外半固体培养法检剖脐血和外周血CFU-GM产率血,并对两者的相关性进行了分析结果表 明:(1)体外培养CFU—GM产率,脐血为96.06土63.37+外周血7.24+6.20,两者差异显着,尸< 0?O1(2)CD34细胞百分率,脐血为h69士1.06,外周血为o.0065+0.oo4r,两者差异显着,尸 <0.01.(3)脐血CFU—GM产率与CD34知胞百分率呈正相关+R=0.759,尸<0.?,回归l音程Y一 0.Ol27x+0.4649.外周血不相关R一0.0447+尸<0.05. 提示采用桥联酶标法检测CD$4细胞百分率可以代替CFU—GM用干预剖脐血造血重建E力,由 干试法简便,?陡速,敏捷,不需昂贵设奋+值得推广和应用 美犍词CFU-GM — CD — 34+相关性堡苎查千瘟国细艟I. 本文利用APAAP~脐带血和正常人 外周血中的CD34细胞进行检测,井通过对体 外培养CFU—GM与CD34+细胞百分率相关性 的研究,对两种实验进行了讨论和比较, 目的是探索一种简便,快速,准确,稳定的检 测造血干细胞的方法,为开展脐血干细胞的富 集,体外扩增及临床脐血干细胞移植奠定良好 基础. l与方法. 1.1材料 1.1.I标本脐血:采自率院产科正常产酪 儿脐静脉胎盘侧,胎龄33-~41周,男性?O.名, 女性7名.成l^外周血;率院输血科献血员静 脉血,年龄18~35岁,男性8e各,女性0一名. 上述标本均采用ACD抗凝,抗凝剂;血液;1 :t(V/V)..-F 1.1.2试剂抗CD34QBIhND10由法国IM— MuN0TI,cLL公司提供,APAAP桥联免疫 试剂盒rhGM—CSF,~hSCF由军科院基础所提 供.r? 1.2方法-: 1.2.1体外CFU—GM培养 1.2.1.1单个核细胞悬液制备将ACD抗 凝的脐血或静脉血4?离心,3000转/分,20分 钟,取出自膜层,用164o稀释后加入淋巴细胞 分离液中,再次离心,2000转/分,2O分钟,取 出单个核细胞层,用1640洗涤3次,计数备 用. 5m1)1640培养液 1.2.1.2建立培养体系( 2.5ml,小牛血清2.0ml,3琼脂0.5ml,单个 核细胞1×10.个,rhGM—CSF100ng, rhSCF100ng. 1.2.1.3将上述培养体系分别加入5只直径 30mm的培养皿中,每皿加lml. 1.2.1.4将培养皿放入5CO,100湿度, 37?的CO培养箱中,l4天观察,4O个细胞以 上的细胞克隆作为一个集落计数在内. 1…22CD34细胞APAAP桥联免疫检测法 (1)将分离出的单个核细胞用PBS (o_01M,pH7.2)洗2次调至1×10/ml,离 心涂片,使每片细胞数控制在1×10个左右, 室温干燥.(2)戍二醛固定1分钟.(3)加入 抗CD34.单抗2QI,4?不少于4小时.(4)加 入羊抗鼠IgG20gl,室温3O分钟.(5)加入A一 PAAP复合物20/~1,室温3O分钟.(6)加入底 物液显色37~C15分钟(7)自来水冲洗,终止 显色.以上每步骤间用PBS洗涤3次.(8)加 苏木索复染1分钟后用自来水冲洗.(9)显赣 镜下观察,细胞核呈蓝色,细胞表面有红色标 记物的细胞为CD34细胞,脐血计数500个细 胞,外周血计数全片细胞,计算CD34细胞百 分率._ 1.3数据处理根据方差齐性检验结果,用 校正t检验和相关回归进行统计学分折,P< O.05有显着性意义. 2结果 2.1体外培养CFU-GM结果表1结果显 示,脐血CFU—GM产率为96.O6士63..37/2× 10MNC(30,285.5),外周血为7.24士6.20/ 2×10~,MNC(2,21),5.63,t一2.g5 P<0.01.两者差异极显着.见表t 衰1,CiFU-GM,C[~34知胞挂洲结果 脐血.周血 氍.CFU—GMCDMhCFU—oMcD34 号2x10MNC2×10MNC% 2.2CD34+细胞百分率脐血为1.69士 辽宁医学杂志1998年第12卷第5期 1.O6(O.2,4.4),外周血为0.0065士 0.0047(O.002,0.02),t一6.55,t0. 一2.95,P<0.01两者差异极显着. 2.3CFU—GM与CD34细胞百分率关系 经检验,脐血CFU—GM产率与CD34细胞百 分率呈显着正相关.r=0.759,P<0.01.直线 回归方程为:Y一0.0127X+O.4649.相关关系 如图1. 外周血CFU—GM与CD34细胞百分率不 相关r----0.0447,P>0.05 蓉 薹 藿 , 橐藉枯 . 1,一-一?.,l 圈1脐血CFu?GM与qD聃哪睦细胞首旁率釉共性分析 3讨论 造血干细胞没有特异的形态学特点,无法 辩认,也没有直接检测人类造血干细胞的集落 定'量培养方法因此实践中常甩体外培养 CFU—GM数量多少间接地预测造血千祖细胞 的水l平由于采用的单个按细胞的分离,培养 方法及试剂种类,制量不同,因而得出的结论 亦有所不商..;.. 本文采用比重1.077的淋巴细舱分离作 为单个核细胞分离{葭用体半固体培养法加 l入GMCSF:4-frhSCF(每ml培养体系各 20rig3,得出结果有显蓉性差异,P<0.01,与 某些文献报道一致...证实脐血中含有大量 的造血干祖细胞,是成人外周血的13倍.. CD34抗原是一种膜糖蛋自单悻,分子量 辽宁压学杂志1998年第12卷第5期 为11万,编码基因位于第1号染色体长臂 (1Q32y,基因长约26,28kb:含有8个外显 子,CD34基因至少可表达4种抗原决定簇.针 对CD34抗原的单抗亦有多种,如:MY10, .12.8,1.3C5,ICH3,QBEND10,TUK3,.115.2 等,本文用QBEND10采用桥联酶标的方法检 测单个核细胞中CD34细胞百分率其中脐血 与文献报道一致,而外周血则明显低于报 道".可的原囱是:(1>外周血本身含 CD34细胞少',计数时误差叉较大;(2)外周 血CD34抗原与QBEND10单抗亲合力较差. '国内蓝丰硕等用另外两种单抗(抗HP— CA一2和TUK3)标记脐血抗原,用流式. CD34 细胞仪检测技术比较了两种单抗标记的 CD34细胞与_体外培养cFU_GM的相关性, 发觋尽管两种单抗标记饷CD34细胞百分率 有明显盖异..(分刷为1.05士0.72和2.们士 1.25,P|<nO5j.,但两者与体外培养l的 CFU—GM产率明显相关(r值分别为O7,P <0.,0k和0.738,<0.05)本研究用 QBEND10标记CD34抗原,采用桥联酶标技 术和体外培养观察两者关系,亦得j{j相同结论 (T=0.759,Pd0.01,'回归方程为y--.04649 _ 0.017X). . _1 在连血干祖细胞的研究过程中,检测 CD34~. 细胞预测体卅培养的.集蒋戢晕可大大 地简化实验程序,减少实验耗时但预测含受 到干祖细胞来源,测定所用试剂以及测定方浩 的影响.在于细胞的分化过程中,.不同时期舶 CD34一细胞抗原表达程度也存在着差异迄 今为止有多种单抗可识别CD34,当标记同一 份标本时,不同抗体识别的抗原定簇不同, 因而阳性率也有所不同".尽管如此,用抗 HPCA,TUK,QBEND10检测的CD34抗原均 与体外培养的CFU—GM产率有良好的线性关 系,表明在脐血干祖细胞的研究中,用CD34 ? 253? 细胞百分率预测体外培养CFU—GM产率是可 行的.另外,除了正常的造血干祖细胞外,某 些细胞如血管内皮细胞,成纤维细胞,破骨细 胞,骨髓基质细胞以及部分急性白血病细胞也 可表达CD34抗原.由于脐血中不含上述 细胞,避免了实验结果假阳性干扰,因此在脐 血研究中用CD34细胞百分率预测造血重建 能力更具准确性和合理性.t 4参考文献 lNe?nLro帆:dcordht~odbankiag;dertshy?e函atn andcryopre'erv&tnofcordblood岬gecorsE卸 Hto10gy,1993.21:671. 2FalkeaburgJ{既aI.Separation?enfichn~ntandcbaracteri一 ~ationofhuman]~ematopolettcprogenitorcellsfromum— bilicalcorablood.AnnHemtaol【-1993.67{291. 3Gabbiaael[M,etalPurehumanhematoi~omticprogeni— tors;per. missiveactionofbasictibroblastg~awthfactors. :' Science.1990.249:156. DooleyDC.1P.Detectionandquarititionollong— tercu1Irdtjatgcellsha'normalhuma~【peripheral ? bloodExf,Heto1.1992.20,156. 5蓝毕硬.辟.脐血CD3{/CD19一细胞与悻外培养寮落的相 关性硅析一华血液学杂京?1994?15:627.' 6CivincI..Trhr,hn~naTM.ReportantheCD34cluster _. hj丑kuk . ayypIV?InIKa~ppW—Whitecell differentia~:inaptigen?t.ond. ~ " n,OxlordUnivemlt.v啊s? 】t989?818一 7Suth~landDR.eta1DifferentialsensitivityofCD34ep__= topescocleavagebylpastearel[~lh?1a1y脯glycOpr0一 teas:{"lkatiohs/orp6rif—lfibd:of'cposter0一 J】jt叮cells.ExpHemato].1斡20:590.,: 8PulCH-.etala嘣agtlcaaceCD3e)【p$sf?in :如hooda山tetymphohlast~cleukeraia,Blood.1993.82: 889.. Clonogeamp.掣ebidleukemi~【 9YinDMtetal— ,eUsiavitroisrestrictedcoleukademiacellsexpressing theCI)34amige~.EurJCancer.1993?29A:2279 10S~therlandDR.e,alACD94tn吨en:molecularIe=tures ?一曲~entialclinicalapplications.StemCells,1999.L1 (supp13)l50? (本文编辑羡子光)