创伤感染时巨噬细胞表面模式识别受体表达, 相互作用及其与炎症反应发生的关系

创伤感染时巨噬细胞面模式识别受体表达, 相互作用及其与炎症反应发生的关系 . 创伤感染时巨噬细胞表面模式识别受体表达、相互作用及其与炎症反应发生的关系 杨 策～陈永华～黄 宏～王海燕～谢国旗～蒋建新 (第三军医大学大坪医院野战外科研究所第四研究室,全军交通医学 研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室,重庆 400042) 摘 要: 目的 从免疫细胞表面模式识别受体水平揭示创伤感染条件下炎症反应的发生机制，为探寻有效调控炎症反应的措施提 供新思路。 方法 选择小鼠内毒素血症、盲肠结扎穿孔、肺泡巨噬细胞免疫刺激模型，以免疫组织化学法和RT-PCR法检测主要模式 识别受体的表达;利用细胞转染模型研究CD14、TLR4、MD2相互作用及其与跨膜信号转导的关系。 结果 免疫细胞清道夫受体和CD14、 TLR4、MD2，分别呈现下调和上调表达，且转染CD14、TLR4和MD2 3种表达质粒的HEK293细胞株对FITC-LPS结合率最强(P < 0.05)， 在内毒素刺激后NF-κB活性、TNF-α分泌最显著(P < 0.05)。 结论 免疫细胞表面防御性受体下调和效应性受体上调参与炎症反 应失控过程，调控模式识别受体表达对减轻机体炎性损伤有重要意义。 关键词:模式识别受体; 内毒素; 创伤和损伤 中图法分类号:R631.1 文献标识码:A Expression of pattern recognization receptors on macrophages, their interaction and relationship with development of inflammatory response in traumatic infection YANG Ce, CHEN Yong-hua, HUANG Hong, WANG Hai-yan, XIE guo-qi, JIANG Jian-xin (State Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Research Institute of Surgery, Research institute for Traffic Medicine of PLA, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China) Abstract: Objective To investigate the possible mechanism of traumatic infection-related inflammation via the pattern recognization receptors (PRRs) in innate immunocytes and provide the new idea for the new measures in modulating the excessive inflammatory responses. Methods The models of endotoxemia mice, cecal ligation and puncture, and immmuno-stimulated alveolar macrophages were used for the assay of PRRs with immunohistochemistry and reverse transcription PCR method. HEK293 cells co-transfected plasmids expressing CD14, TLR4 and MD2 or two of them were stimulated with 100 ng/ml lipopolysaccharide (LPS) for the determination of NF-κB and tumor necrosis factor (TNF)-α. Results SR was up-regulated while the expression of CD14, TLR4 and MD2 were down-regulated in innate immunocyte. The HEK293 cells co-transfected three types of plasmids enhanced the sensitivity to LPS binding and stimulation compared with HEK293 cells co-transfected two of them (P<0.05), followed with the significant translocation of NF-κB and TNF-α secretion (P<0.05). Conclusion Our data strongly indicate that the significant correlation between uncontrolled inflammatory responses and the imbalance between defensive receptors and effector receptors. The strategy of moderate regulation of PRRs can be a promising strategy in immuno-modulating inflammatory injuries. Key words: pattern recognization receptors; endotoxin, innate immune; trauma and injury 基金项目: 国家重点基础研究发展(973计划)(2005CB522602，1999054203)，全军“十一五”科技攻关项目(06G080) supported by the National Basic Research Program (973 Program) of China (2005CB522602), and the Tackling Project of the “Eleventh Five-Year Plan” for Sci & Tech Project of PLA (06G080) 作者简介:杨策，男，山西省大同市人, 博士, 助理研究员, 主要从事创伤基础方面的研究。E-mail:yangce@mail.tmmu.com.cn 通信作者:蒋建新, E-mail:jiangjx@cta.cq.cn 收稿日期:2008-11-07;修回日期:2008-11-17 . . 度>90 %, 台盼蓝染色鉴定细胞活力 ? 95%。将AM接种于预模式识别受体是宿主天然免疫系统识别病原菌相 置玻片的24 孔培养板，于37 :C，5% CO2孵箱培养12 h。以关模式分子(PAMPs)、清除病原菌及其毒素以及天然[6]细胞因子刺激后，行SP法染色，同法半定量分析蛋白表达。 免疫细胞活化的首要环节。机体对细菌细胞壁成分的 炎症反应主要由模式识别受体SR、CD14、TLR4等介导。1.5 肺组织和肺泡巨噬细胞SR mRNA、CD14 mRNA和SR和CD14分别在灭活、清除内毒素和巨噬细胞激活[1-3]TLR4 mRNA 检测 中发挥重要作用，TLR4-MD2复合物能介导CD14传 mRNA以半定量逆转录PCR检测。总RNA按RNA提取试剂盒递的细胞膜信号，并将信号进一步传递给接头分子[4](Omega, 美国)说明提取。引物(表1)自上海申能博采公司合MyD88。因此，免疫细胞PRRs的数量及其相互作用 成。二步法逆转录反应参照试剂盒(TaKaRa, 日本)方法进行。对于损伤后宿主防御细菌感染非常关键。本研究通过 按94 :C预变性2 min，94 :C变性60 s，57 :C退火30 s，观察创伤及感染因素刺激后免疫细胞表面PRRs受体 72延伸8 min，循环33次。扩增产物电泳后以Quantity One的表达变化及其相互作用，探讨从PRRs角度调控机体 软件计算光密度值。 炎症反应，旨在深入揭示创伤感染早期机体天然免疫 表 1 模式识别受体基因PCR引物 功能变化规律，以期为防治创伤后感染、促进创伤患 指标 序列 长度(bp0 者康复提供实验依据。 上游:5'- CCAAGTCCTTGCAGAGTCTG -3' SR 307 1 材料和方法 下游:5'- GTCTGAGGTCGTTGGTGATG -3' 上游:5'- CGCTCAATCTGTCTTTCAC -3' 1.1 实验动物和分组 CD14 384 下游:5'- GACTGCCTTTCTTTCCTTAC -3' 健康昆明小鼠102只，雌雄不拘，体重18 , 22 g。由本上游:5'- CCGGAAGGTTATTGTGGTAGTGTC -3' 院实验动物中心提供。分为空白对照组(4只)、创伤组、创伤TLR4 300 下游:5'- AGGGCATTTTTAAGTCTTCTCCAG -3' ，内毒素组、盲肠结扎穿孔(CLP)组和假手术组(4只)。创上游:5'- CGGTGCTGAGTATGTCGT -3' 组(2、4、6、9、13 h)、创伤，内毒素组(2、4、6、9、伤GAPDH 613 下游:5'- GGTGGAAGAGTGGGAGTT -3' 13 h)和盲肠结扎穿孔组(8、12、24 h)。各时间点4只动物。 SR: 清道夫受体; TLR4: Toll 样受体4; MD2: 髓样分化蛋白2 细胞因子刺激实验分为空白对照组(3只)，细胞因子刺激量效 1.6 转染CD14、TLR4和MD2质粒的HEK293细胞对LPS和时效组。TNF-α(Sigma, 美国)、IL-6(Sigma, 美国)、IL-10 结合率变化 (Sigma, 美国)量效实验有0.01、0.1、1、10、100、1 000 ng/ml 将处于对数生长期的HEK293细胞消化后，以DMEM(Roche，组;时效实验有2、4、6、8、12、16、24 h组，各剂量组和4美国)完全培养基调整细胞浓度至5×10/ml，接种于24孔培时间点3只动物。 4养板，每孔细胞数为5×10，培养至60,的汇合率。细胞分71.2 动物模型建立 组:?转染CD14质粒组(pcDNA3/HCD14, 本室保存);?转染1.2.1 创伤及合并内毒素血症模型 麻醉小鼠行单侧股骨中TLR4质粒组(pFLAG-CMV-1-TLR4, Muzio教授惠赠，Mario Neg段闭合性骨折，经尾静脉按5 mg/kg注入LPS (E. coli 026: B6, 研究所, 意大利);?转染MD2质粒组(pEFBOS-MD2, KensukaDIFCO, 美国)，复制创伤合并内毒素血症模型, 空白对照组注教授惠赠，日本);?共转染CD14、TLR4质粒组;?共转染CD14、入等量生理盐水。 MD2质粒组;?共转染TLR4、MD2质粒组;?共转染CD14、TLR4、1.2.2盲肠结扎穿孔(cecal ligation and puncture, CLP)模MD2质粒组。D-Hanks漂洗后，先加1 ml DMEM无血清培养基，型 参照文献[5]方法行CLP术，模拟小鼠脓毒症。假手术组随后各组分别加入含相应质粒、转染剂Fugene 6(Roche, 美除未行CLP外操作同CLP组。 国)的转染液，继续培养36 h。最后再加入现配的终浓度为1 1.3 创伤感染时组织巨噬细胞SR、CD14、TLR4检测 µg/ml的FITC-LPS(Sigma, 美国)，37 :C孵育2 h。以胰蛋 [2]白酶消化细胞，收集并漂洗后，流式细胞仪检测细胞对伤后相应时间点，麻醉小鼠，以全身灌注法初步固定肝、 FITC-LPS的结合率。 肺组织，按常规取肝、肺组织标本，固定、脱水后制备蜡块， 切片后行免疫组织化学染色。以TECBIAS 6803真彩色生物医1.7 转染NF-κB反应性d2EGFP的HEK293细胞荧光蛋学图像分析系统分析，以积分吸光度( IOD)平均值表示蛋白表白表达 达的相对强度。 含有NF-κB结合位点的不稳定型绿色荧光蛋白质粒1.4 肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages, AM)表面p4κb-d2EGFP(本所王付龙硕士惠赠)同法转入HEK293细胞。以SR、CD14和TLR4检测 含600 µg/ml G418的选择性培养基筛选7,10 d。挑取阳性克 隆涂板扩增，并以200 µg/ml G418继续筛选28 d。随后按上法参照文献[6]方法，分离小鼠AM，Gimesa染色显示AM纯 . . 转染各种组合质粒。转染后36 h，再以终浓度为100 ng/ml LPS? 0.07)]。IL-6刺激后4 h，CD14 mRNA表达明显增多，至12 h刺激。流式细胞仪检测阳性细胞率。 达峰值[实验组(0.58 ? 0.04) vs 对照组(0.38 ? 0.04)]。 在0.01,100 ng/ml之间，SR和CD14mRNA表达随IL-6浓度增加分1.8 TNF-α测定 别呈不断下降或上升变化。SR蛋白表达则随IL-6刺激时间延长在LPS刺激转染不同质粒的HEK293细胞3 h后，收集上清。而逐渐降低，至16 h最弱[实验组(24.60 ? 4.00) vs 对照组严格按ELISA试剂盒(Bendor公司, 美国)说明书操作，TNF-α(42.20 ? 3.10)]。IL-6刺激2 h，CD14蛋白表达增强，至16 h按表示其稀释浓度范围的曲线予以定量，以样品吸光度值最明显[实验组(39.40 ? 3.80) vs 对照组(24.4 ? 2.60)]，求得TNF-α浓度。 至24 h仍高于正常对照。量效实验显示，SR表达随着IL-6剂量1.9 统计学分析 的增加而逐渐降低，至100 ng/ml最低[实验组(25.80 ? 4.30) 实验数据用均数?标准差表示，以SPSS 11.0进行单因素vs 对照组(42.70 ? 4.20)]。细胞表面CD14表达随着IL-6刺方差分析和t检验。 激剂量增加逐渐增强，至100 ng/ml表达最强[实验组(41.5 ? 4.60) vs 对照组(25.7 ? 3.30)]。 2 结果 2.2.3 IL-10对SR、CD14表达的影响 胞内CD14和SR mRNA表 达与IL-10呈明显的时效和量效关系，即随IL-10刺激时间延长2.1 创伤感染时巨噬细胞表面模式识别受体表达变化或刺激浓度增加，CD14 mRNA表达呈进行性下降[实验组(0.48 与局部炎症反应的关系 ? 0.06) , (0.25 ? 0.08) vs 对照组(0.49 ? 0.05)]， 结果显示，内毒素血症、创伤合并内毒素血症时动物肝、SR mRNA表达则进行性增加[实验组(0.72 ? 0.05) , (1.22 肺组织SR mRNA及其蛋白表达呈进行性下调，CD14、TLR4 mRNA? 0.06) vs 对照组(0.67 ? 0.05)]。随IL-10刺激时间延长，及其蛋白表达呈进行性上调，其中以创伤合并内毒素血症13 hCD14蛋白表达未见明显变化，SR蛋白表达则随着IL-10刺激时受体表达变化最明显[肝SR: 实验组(17.23 ? 2.12) vs 对照间延长而逐渐增多，至16 h达峰值[实验组(50.10 ? 3.60) vs (39.15 ? 4.24);肝CD14: 实验组(37.31 ? 5.28) 对对照组(37.30 ? 2.10)]。量效实验显示，随着IL-10浓度的组vs 照组(17.14 ? 1.69);肺SR: 实验组(17.48 ? 1.75) 对增加，CD14蛋白表达无明显变化，SR蛋白表达则逐渐增多，至vs 照组(33.29 ? 2.40);肺CD14: 实验组(14.49 ? 1.93) vs 对10 ng/ml达峰值[实验组(52.70 ? 3.90) vs 对照组(39.20 ? 照组(39.17 ? 5.06)]。CLP后12 h，SR呈下调变化[SR mRNA: 2.50)]。 实验组(0.22 ? 0.03) vs 对照组(0.65 ? 0.04)]。肺组织2.3 模式识别受体对免疫细胞的调控作用及其跨膜信CD14、TLR4呈不同程度上调表达[CD14 mRNA:实验组(1.31 ? 号转导模式 0.11) vs 对照组(0.50 ? 0.06);TLR4 mRNA: 实验组(0.91 ? 0.06) vs 对照组(0.45 ? 0.05)]。体外实验结果显示，随着通过PRRs基因转染，发现单个基因转染时，CD14与LPS结LPS剂量增加，小鼠肺泡巨噬细胞SR mRNA呈明显的下调表达，合率最强，其次为MD2，TLR4与LPS结合率很弱。在两两联合转LPS刺激可使小鼠细胞内CD14、TLR4 mRNA均呈不同程度的上调染时，CD14，TLR4组细胞与LPS结合率与CD14组相近，CD14，表达[CD14 mRNA:实验组(1.69 ? 0.09) , (1.00 ? 0.16) MD2组细胞与LPS结合率强于CD14组和MD2组,TLR4，MD2组细胞vs 对照组(0.35 ? 0.09);TLR4 mRNA: 实验组(0.65 ? 与LPS结合率强于TLR4组和MD2组。3种联合转染时，细胞对0.16) , (0.21 ? 0.03) vs 对照组(0.41 ? 0.10)]。 FITC-LPS结合率最强，明显高于两两或单个基因转染组(表2)。 表 2 转染携带不同模式识别受体基因的质粒后HEK293细胞与FITC-LPS2.2 细胞因子对模式识别受体表达的调控作用 结合率的变化 2.2.1 TNF-α对SR、CD14、TLR4表达的影响 肺泡巨噬细胞转染基因 阳性细胞百分率 SR mRNA表达逐步减少，并在刺激后6 h已明显低于对照水平[实空白对照 3.72 ? 0.96 验组(1.09 ? 0.09) vs 对照组(1.35 ? 0.11)]。TNF-α刺bCD14 19.63 ? 3.02 激3 h，CD14 mRNA表达明显增多[实验组(0.83 ? 0.05) vs 对TLR4 3.28 ? 0.74 照组(0.37 ? 0.15)]，并随刺激时间延长，CD14 mRNA表达呈aMD-2 10.86 ? 2.67 a增多趋势，TLR4 mRNA表达无明显变化。TNF-α刺激后，肺泡CD14，TLR4 20.19 ? 3.94 巨噬细胞内SR、CD14、TLR4蛋白表达与mRNA表达变化一致[SR: b cCD14，MD-2 26.60 ? 3.92 实验组(21.50 ? 4.50) vs 对照组(38.50 ? 3.90); CD14: bTLR4，MD-2 30.78 ? 9.22 b e实验组(41.30 ? 3.90) vs 对照组(20.5 ? 4.00)]。 CD14，TLR4，MD-2 55.44 ? 2.07 2.2.2 IL-6对SR、CD14表达的影响 SR 和CD14 mRNA表达与a:P < 0.05～b:P < 0.01～与空白对照组比较,c:P < 0.05～与CD14IL-6也呈明显的时效和量效关系。SR mRNA表达在IL-6刺激8 h和MD2组比较,d:P < 0.01～与TLR4和MD2组比较,e:P < 0.01～与其明显降低，至12 h最低[实验组(0.28 ? 0.07) vs 对照组(0.64 他组比较 . . 进而发现，单个基因转染的细胞对LPS刺激反应均很弱。此，防御性受体SR和兴奋性受体CD14存在一定的功能 CD14-MD2共转染时细胞对LPS刺激反应较单个基因转染无明显联系。 变化，CD14-TLR4或TLR4-MD2共转染时细胞对LPS的刺激反应较TLR4和目前认为，巨噬细胞表面至少存在CD14、 单个基因转染均有所增强。在三者共转染时效应最强，表现为MD2介导LPS激活细胞。为揭示3种受体是否都能结合 NF-κB结合位点的不稳定型绿色荧光蛋白表达最强(图1)和LPS，以单独或协同方式介导LPS跨膜信号，通过不同 TNF-α分泌水平最高(488.26 ? 54.41 pg/ml，表3)。 组合的PRRs基因转染研究表明，单个PRR不能独立完成 表 3 LPS刺激转染携带不同模式识别受体基因的质粒的HEK293细胞LPS跨膜信号转导，需要相互间的协同作用。天然免疫 TNF-α水平(pg/ml) 细胞识别LPS可能需3种受体共同参与，且三者共转染转染基因 阳性细胞百分率 时对PAMPs的刺激反应最强，表现为NF-κB的显著激活空白对照 68.22 ? 13.95 与核转位，以及TNF-α的高水平分泌。结果提示巨噬CD14 79.29 ? 13.15 细胞识别LPS及LPS激活细胞至少需要3种受体共同参 TLR4 74.32 ? 8.70 与，即CD14结合LPS，TLR4将LPS刺激信号传入细胞内，MD-2 65.58 ? 8.13 MD2可能协同TLR4结合LPS并转导LPS信号。 CD14，TLR4 79.45 ? 21.97 本研究结果也表明:创伤感染时，免疫细胞表面CD14，MD-2 72.43 ? 3.14 防御性受体下调、效应性受体上调参与炎症反应失控aTLR4，MD-2 123.75 ? 16.39 过程，CD14、TLR4和MD2对免疫细胞识别病原分子具有b cCD14，TLR4，MD-2 488.26 ? 54.41 协同作用，合理调控模式识别受体表达对于增强机体 a:P < 0.05～b:P < 0.01～与空白对照组比较,与其他组比较: c:P < 0.01 免疫，防御感染具有重要意义。 3 讨论 参考文献: 体内、外实验表明，内毒素血症、创伤合并内毒[1] 蒋建新,姚咏明,郑江. 细菌内毒素基础与临床[M].北京:人民军医 素血症及CLP时，组织巨噬细胞表面呈现SR表达下调，出版社, 2004:90. CD14、TLR4表达上调的变化规律。与此同时，内毒素[2] Jiang J, Xie G, Chen Y, et al. Intra-hepatic expression of 血症时肝、肺组织内TNF-,、IL-6、IL-4、IL-10释放scavenger receptor and CD14 and their relationship with local 增加，LPS刺激培养肺泡巨噬细胞产生TNF-,、IL-6、inflammatory responses in endotoxemia in mice[J]. Shock, 2001, IL-10增加与组织内CD14表达增加呈显著正相关，与SR164(1):75-80. 表达下降呈显著负相关。而且，内毒素血症时血浆ALT、[3] Jiang J, Chen Y H, Xie G Q, et al. Intrapulmonary expression TB水平、肝组织内MDA水平、肺体指数的增加也分别与of scavenger receptor and CD14 and their relation to local 肝、肺内SR表达下调、CD14表达上调呈显著的相关性。inflammatory responses to endotoxemia in mice[J]. World J Surg, CLP脓毒症时肺内各PRRs的表达变化分别与肺脏组织2003,27(1):1-9. 内髓过氧化物酶(MPO)、TNF-α水平增加也呈一定的[4] Schnabl B, Brandl K, Fink M, et al. A TLR4/MD2 fusion protein [2,3,6,7]相关关系。因此，感染或创伤合并感染时以上受inhibits LPS-induced pro-inflammatory signaling in hepatic 体的表达变化可能是导致局部和全身炎症反应失控的stellate cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 375(2): 重要机制。此外，除PAMPs直接作用，感染过程中释放210-214. 的促炎因子(TNF-,、IL-6)和抗炎因子(IL-10)能反[5] Baker C C, Chaudry I H, Gaines H O, et al. Evaluation of factors 馈调节效应细胞PRRs表达，且两者调节作用相反。抗affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal 炎因子可能通过对PRRs表达调控抑制促炎因子释放、ligation and puncture model[J]. Surgery, 1983,94(2):331-335. 对抗炎症反应。 [6] 陈永华,蒋建新,谢国旗,等.内毒素血症时小鼠肺泡巨噬细胞CD14和 SR是介导LPS清除的防御性受体，本身不直接介清道夫受体的表达[J]. 第三军医大学学报，2000,22(7):615-618. 导LPS的细胞激活效应。CD14是一种GPI锚定膜蛋白。[7] 谢国旗,蒋建新,朱佩芳,等.库普弗细胞SR表达变化与内毒素肝损伤 利用抗CD14抗体，37:C、30 min，阻断CD14，随后用的关系[J]. 中华肝脏病杂志，2001,9(2):117-119. 磷脂酶C预处理肺泡巨噬细胞，使膜结合CD14从细胞膜,编辑 吴培红, 上脱落，或用抗CD14单克隆抗体封闭细胞膜上CD14， 均能明显抑制低剂量LPS对细胞的激活效应。用SR配体 -氧化性低密度脂蛋白(ox-LDL)预处理肺泡巨噬细胞， 可增强LPS刺激肺泡巨噬细胞释放TNF-,的作用。抗[3]CD14抗体则可完全抑制ox-LDL增强LPS的作用。因 . . A B C D A:空白对照组;B:CD14+TLR4转染组CD,C:TLR4+MD2转染组,D:CD14+TLR4+MD2转染组 图 1 转染携带不同模式识别受体基因的质粒后HEK293细胞在100 ng/ml LPS刺激时NF-κB结合位点的不稳定型绿色荧光蛋白表 达(荧光显微镜 ×200) .