PCR引物设计相关知识---PCR引物设计原则

PCR引物相关知识---PCR引物设计原则 PCR---PCR PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级 结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能形成二级结构，那就可 以在这一区域设计引物。 现在可以在这一保守区域里设计一对引物。一般引物长度为15~30碱基，扩增片段长度为100~600碱基对。 让我们先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%。而且四种碱基的分布最好随机。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否则P1引物设计的就不合理。应重新寻找区域 设计引物。 同时引物之间也不能有互补性，一般一对引物间不应多于4个连续碱基的互补。 引物确定以后，可以对引物进行必要的修饰，例如可以在引物的5′端加酶切位点序列；标记生物素、荧光素、地高辛等，这对扩增的特异性影响不大。但3′端绝对不能进行任何修饰，因为引物的延伸是从3′端开始的。这里还需提醒的是3′端不要终止于密码子的第3位，因为密码子第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 综上所述我们可以归纳十条PCR引物的设计原则： ? 引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。 ? 产物不能形成二级结构。 ? 引物长度一般在15~30碱基之间。 ? G+C含量在40%~60%之间。 ? 碱基要随机分布。 ? 引物自身不能有连续4个碱基的互补。 ? 引物之间不能有连续4个碱基的互补。 ? 引物5′端可以修饰。 ? 引物3′端不可修饰。 ? 引物3′端要避开密码子的第3位。 PCR引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。如前述，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗 万象的规则确保PCR的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二 级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计mRNA的稳定二级结构，有助于选择模板。 实验明，待扩区域自由能（?G?）小于58.6lkJ/mol时，扩增往往不能成功。若不能避开 这一区域时，用7-deaza-2′-脱氧GTP取代dGTP对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2（G+C）+（A+T+，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度（74?),不能保证产物的特异性。 4.G+C含量 G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10?。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80?，其Tm值最好接近72?以使复性条件最佳。 5.碱基础随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。 6.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级 结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不 能大于3bp。 7.引物之间 两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不 应多于4个连续碱基的同源性或互补性。 8.引物的3′端 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，除 在特殊的PCR（AS-PCR）反应中，引物3′端不能发生错配。 在标准PCR反应体系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四种dNTP各200μmol/L）以质粒（103拷贝）为模板，按95?，25s；55?，25s；72?，1min的循环参数扩增HIV-1 gag基因区的条件下，引物3′端错配对扩增产物的影响是有一定规律的。A?A错配使产量下降至1/20，A?G和C?C错七下降至1/100。引物A：模板G与引物G：模板A错配对PCR影响是等同的。 9.引物的5′端 引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影 响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等； 引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。 10.密码子的简并 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。 寡核苷酸的优化设计 郑仲承 ( 中国科学院上海生命科学院生物化学和细胞生物学研究所，上海 200031 ) 关键词：寡核苷酸；优化设计 中图分类号：Q524 在核酸分子杂交、DNA序列测定和通过PCR放大DNA片段等实验中，都需要使用寡 核苷酸作为探针或引物，而对这些反应的质量起最重要影响作用的，就是这些寡核苷酸探针 或引物。用优化的寡核苷酸进行实验能够很快得到好的结果，而用不够合适的寡核苷酸时， 常常得出似是而非的结果，不仅大大增加了后续实验的工作量，还可能一无所获。 怎样优化设计寡核苷酸呢?至少有下列几个方面的问题需要考虑。 1. 估测可能形成的DNA或RNA双链的稳定性 寡核苷酸，无论是DNA的或者RNA的，都有形成双链结构的潜在可能性，正如下面反 复提到的，这种结构对寡核苷酸的作用有很大影响。所以，预测这种结构的稳定性对设计和 优化寡核苷酸就很重要。在一个双链结构中，碱基对的相对稳定性是由其邻近碱基决定的。 在热动力学中，这样的性质以双链形成时的自由能(ΔG)来表示。现在，大多采用 Breslauer等人提出的，以最接近的相邻核苷酸的动力学数值(自由能)来预测双链稳定性的方法。为 简化起见，所有的计算都在25 ?条件下进行。此时，最接近的相邻核苷酸的自由能是： 第一个(5′)核苷酸 第二个核苷酸 dA dC dG dT dA －1.9 －1.9 －1.6 －1.0 dC －1.3 －3.1 －3.1 －1.6 dG －1.6 －3.6 －3.1 －1.9 dT －1.5 －1.6 －1.3 －1.9 ΔG(kcal/mol) 例如，双链d(ACGG／CCGT)的ΔG是： ΔG(ACGG)＝ΔG(AC)＋ΔG(CG)＋ΔG(GG)＝－(1.3＋3.6＋3.1)＝－8.0 kcal/mol 此计算方法特别适用于测定其3′末端会形成双链的引物的相容性。也可以用来计算发夹 环结构的ΔG。不过，这时需要根据环区内核苷酸的数量添加一定的数值。如3个核苷酸时为5.2 kcal/mol；4个时为4.5；5个为4.4；6个是4.3；7和8个为4.1 kcal／mo1。 2. 选择引物的一般规则 设计和选择引物时有5个要素必需注意。 2.1 引物的3′末端不互补 引物的3′末端一定不能有很大的互补性，因为它们的互补会形 成引物二聚体，这就会带来很大的问题，例如合成出非专一的产物，极大地减少所期望产物 的得量。有实验表明，3′末端双链的ΔG是0～－2 kcal/mol时，PCR产量几乎达到百分之百，随着其绝对值的增加产量逐渐下降，在－6时只有40%，到－8时少于20%，而－10 时，接近于0。虽然产量还取决于其他参数，如退火温度、引物的专一性等等，但是用Taq聚合酶操作时，由于它的工作能力很强，能够在很短的时间内就识别3′末端互补的双链区并发动聚合反应，即使3′末端双链的稳定性很差也不能阻碍它的作用，所以这时产量对二聚体 的形成就有很大的依赖性。 2.2 引物分子内不互补 应当尽量不用会通过释放能量而形成分子内双链结构的寡核苷 酸。虽然有些带有发夹环，其ΔG为－3 kcal/mol的自身互补引物也可以得到不错的结果， 但是如果它的3′末端被发夹环占据时就很麻烦，即会引发引物内部的延伸反应，减少了参与 正式反应引物的数量。当然，如果发夹环在5′末端对反应就没有多大的影响了。 2.3 引物的组分、解链温度和长度 普遍认为PCR引物应当有50%的GC/AT比率。其实，这是不对的。以人基因组DNA为模板，用81% AT的引物可以产生单一的，专一的， 长250 bp，含有70% AT的产物。完全没有必要复杂地去计算产物和引物的解链温度，PCR引物的GC/AT比率应当等于或高于所要放大的模板的GC/AT比。 要知道，更重要的因素是模板与稳定性较小的引物之间解链温度的差异。差异越小，PCR的效率越高。因为DNA的解链温度也取决于它的长度，所以有的研究者喜欢设计很长， 而不求它很稳定的引物。可是，引物太长就难以避免形成二聚体和自身互补，因此，一般还 是不用为好。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18 mer)的引物：若产物长5 kb，则用24 mer的引物。有人用20～23 mer引物得到40 kb的产物。但是，引物较长时，如果不借助引物选择的计算机软件帮助，就很难确定一对引物是否会形成二聚 体，是否有自身互补性以及专一性如何。于是，用眼睛选出来的寡核苷酸放大长片段DNA时就会使引物彼此引发而不是延伸模板，得出非专一产物。通过下述的观察内部稳定性原理 可以极大地减少这种问题。 2.4 引物的内部稳定性 在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物，这种引物的结构可以有效地消除假引发反应。这 就是基于引物内部稳定性的经验之谈。其3′末端稳定性低的引物在这些反应中能起好作用的 原因在于，接近或在3′末端上的碱基与非靶位点碱基所形成的配对的稳定程度还不足以引发 DNA合成，所以不会产生假产物。因此，为了有效地引发反应，引物的5′末端和中央部分必须与靶DNA也形成双链。与此相反，带有稳定的、GC丰富的3′末端的寡核苷酸不需要其所有的核苷酸序列都与靶序列配对，只凭借其3′末端与靶序列任何位点的牢固配合就可以 引发反应，产生非专一产物。 如果用3′末端低稳定性的引物，反应的最适退火温度范围会不寻常的宽。这就可以不经 过事先的最佳化实验就能在最佳条件下进行反应。还要注意的是PCR反应产物的质量还取决于模板(底物的复杂性、Tm、产物长度)和退火的温度与时间。 所以，有时3′末端稳定的引物也可以满意地进行反应。但是，无论如何，寡核苷酸3′末端最后5个核苷酸的稳定性小于－9 kcal/mol的，通常就是专一性的探针或引物。寡核苷酸 3′末端越不稳定，假引发的可能性越低。 2.5 引物的唯一性 为了放大单个的、专一性DNA片段，选用的引物序列就应当是唯一 的，即在模板中没有重复序列。虽然不会整个引物序列都偏好于和模板中的一个以上位点匹 配，但是，通常见到的引物的3′末端往往都有6～7个没有什么个性的核苷酸。如果假引发 的位点正好在放大区的内部，那麻烦就大了。由于短的DNA片段有更高的PCR或杂交效率，就容易产生非专一产物。 如果用哺乳动物基因组序列作为模板，可以用Alu序列或其他短重复元件来核对想用的 引物的互补性。由此也可知，应当避免使用同寡聚物(如—AAAAAA—)和二核苷酸重复(如—ATATAT—)。 3. 按照氨基酸序列设计寡核苷酸 按照多肽的氨基酸序列来设计 PCR引物或杂交探针是最常用的实验手段，尤其是在试 图“钓取”一个蛋白质的基因时。此时要注意的问题有： (1)宁可用简并引物，也不用猜测的引物。氨基酸密码子的简并性给予引物设计以可塑性， 这比用猜测的密码子要好得多。有人用1 024个简并引物得到很好的结果。 但是，应当避免在一个区域内有很高的简并性。但也有简并性低使引物不工作的报道。 (2)引物与模板的错配。一般认为，所用引物与模板有15%～20%的错配，PCR的效果还能接受。但是，引物3′末端的错配比同样错配率的5′末端错配会引起更严重的问题。 在最后4个碱基中有2个错配的引物，其 PCR产量急剧下降。但是，当核苷酸浓度高 时，3′末端有错配的引物还能被Tag聚合酶很好地利用。在0.8 mmol/L时，大多数3′末端错配引物可以接受，虽然非专一产物比较多，DNA合成的忠实性也下降。即使在低核苷浓 度下，还会有少量从错配碱基出发的合成，因此，在开始的PCR循环中把退火时间增加到 3～5分钟，比之于用标准退火时间和高浓度核苷酸能够产生质量更好的所求产物。 (3)在用唯一性引物时，建议用0.2 mmol/L或更低的总核苷酸浓度，因为高浓度会增加 错误参入的比率。 (4)简并寡核苷酸时，PCR应当在比较高的引物浓度下进行，即1～3 μmol/L而不是0.2 μmol/L，因为在反应混合物中的大多数寡聚物并不是被用来引发专一的反应，而只是产 生高的背景而已。 PCR--- 1. 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种, 主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在 于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采 用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳 定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'?5'磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙 酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基； 第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合， 得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。 第三步，带帽(capping)反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应(少于2%)，用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化 时分离掉。 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙 酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。 2. ? C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被 有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目 的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ? OPC纯化： OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%。适用于40mer以下引物的纯化。 ? PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效 的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链Oligo DNA (大于50mer)的纯化特别有效。 ? HPLC纯化：HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。纯度可以大于99%。主要用于短链和修饰引物的纯化。该法的弱点是成本较高， 批量生产效率不高。 3.OD 答：引物合成引物OD数是这样测定的：用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。 4. 答：我们偶尔收到用户投诉定量不准的，出现这种情况的可能性有（1）生产人员定量错误。这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格 的培训，程序化规范操作和换算。公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要 故意少给用户OD数，因为无论OD数是否达到定单要求，我们都统计为工作量， 没有达到OD数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。 合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。一般情况下，引物都有留 样。接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题。（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。这种情况很少 见。（3）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。使用过程中，引物工作浓 度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。（4）用户没有能够正确理解引物 OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有 将OD读数，正确地转换成母液中OD数。这种情况比较常见。（5）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。 例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是： 加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul, 加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm, 此时光吸收的读数为0.2。 5. 答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 一般PCR扩增 < 45base OPC >45 base PAGE 诊断PCR扩增 < 40base OPC, PAGE DNA测序 20base左右 OPC 亚克隆，点突变等 根据实验要求定 OPC, PAGE，HPLC 基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 PAGE 反义核酸 根据实验要求定 PAGE 修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC 6. 答：引物越长，出现问题的概率就越大。我们合成过120base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。 7.OD 答：根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长， 但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费， 同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要 重复多次才能成功。 8. 答：实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素 干粉直到饱和，上样前加热变性(95?,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是 增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。 如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。 9. 答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 溶 解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。 一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V ()= OD*33 **20000 / () 。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度， 按上述公式换算。 注意：1 OD260= 33 ug/ml. 10.Tm 答：引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子 强度有关。 长度为25mer以下的引物，T为：T = 4?(G + C)+ 2?(A + T) mm 对于更长的寡聚核苷酸，T计算公式为： m Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中，Size = 引物长度。 Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hy bridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, lik e formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes. 11. 答：非修饰的引物的Molecular Weight在随引物提供的报告单上都有明确的标 示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（Nx * Wx）+( Ni* Wi) +16* Ns– 62. NA, NG, NC, NT, Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA, WC, WG, W, Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。 对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2 = 321.21。Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分 子量16。 常规碱基分子量 Base Molecular Weight A 313.21 C 289.18 G 329.21 T 304.19 I 314.2 U 290.17 常规修饰基团分子量 5’-Biotin 405.45 3’-TAMARA 623.60 5’-(6 FAM) 537.46 3’-Dabsyl 498.49 5’-HEX 744.13 3’-(6 FAM) 569.46 5’-TET 675.24 3’-Amino Modifier C3 153.07 5’-Cy5 533.63 3’-Amino Modifier C7 209.18 5’-Cy3 507.59 3’-Thiol Modifier C3 154.12 12. 答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上 敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。 13. 答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在 溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对 实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧 光引物需要避光保存。 14.5’ 答：合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行 5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费。 15. 连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载 体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的 酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火 的难度较大，退火时需要提高退火温度。 16. 答：测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物, 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的 序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法，预防碱 基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问 题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都 是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似， 没有人可以超脱。 引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是99%，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的 部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至 于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连 时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能 100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与 互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统 补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 （脱嘌呤），2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后 处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基G或A的缺失。 引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低 发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到 规模化生产中。 17. 答：引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入，缺失，置 换突变的因素客观条件都有一直存在。引物链越长，突变的频率累加起来就越高。 研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部 分引物可能有突变的思想准备。 18. 答：对您遇到的困惑，我们表示同情。遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我 们在电脑中保留所有原始数据。如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新 挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要 多测一些了。一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的， 就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第 一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几 率。基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合 一下引物。 19. 答：没有。我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带 责任。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%。您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。 20.PAGE 答：理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。但是 制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基 的引物。国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比 较高，导致割的条带有时可能比较宽。建议：您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。 21.OPCPAGEHPLC 答： 有些用户引物需要纯度特别高的引物，在使用前会将HPLC鉴定引物的纯度，常常发现引物的纯度一般在70%左右。问题来了，还有那30%是什么？ 引物纯化PAGE, 需要电泳，用缓冲液将引物浸泡出来，然后用C18浓缩，乙醇沉淀。沉淀得到的核酸物质基本引物了，除此以外，还有其他一些非核酸类物质， 他们一般不会干扰引物的使用。OPC纯化也类似的情况。即使是HPLC纯化的引物，如果对成品进行分析，一般也难达到很高的纯度，引物您得到的纯品都是 由制备柱过来，洗脱峰经过浓缩抽干，部分非核酸物质被富集。 22.? 答：主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自 然低于一般的引物。修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。 23. TaqMan 答：下列原则供您参考。 TaqMan 位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。 ?长度一般为18-40mer 。 ?G-C含量控制在40-80%左右。 ?避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 ?在引物的5’端避免使用G。 ?选用比较多的碱基C。 ?退火温度Tm控制在 68-70C左右。 Name Name 吸收波长 发射波长 colors 6-FAM 6-carboxy-fluorescein 494nm 518nm Green OrangTET 5-tetrachloro-fluorescein 521nm 538nm e HEX 5-hexachloro-fluorescein 535nm 553nm Pink TAMRtetramethyl-6-carboxyrhodamine 560nm 582nm Rose A ROX 6-carboxy-x-rhodamine 587nm 607nm Red Cy3 Indodicarbocyanine 552nm 570nm Red Cy5 Indodicarbocyanine 643nm 667nm Violet 24.Primer 答：引物设计的下列原则供您参考。 ?引物长度一般在18-35mer。 ?G-C含量控制在40-60%左右。 ?避免近3’端有酶切位点或发夹结构。 ?如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。 ?如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。 ?避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。 ?退火温度Tm控制在 58-60C左右。 ?如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。 25. 答：引物是否好用，能否扩增出您需要的引物，与是否用软件设计没有太多的关 系。引物设计有一定的指导意见，软件就是根据这些要求设计而成。不要迷信软 件给您设计的引物，软件中一些参数您可能不明白，弄错了反而麻烦。其实，PCR扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。软件设计最大的 毛病是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。有时，我们需要 扩增一段基因片段，引物的设计是没有太多的选择的。 26.OD260/OD2801.5 答：我们多次接到类似的投诉：引物应该全是DNA,但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。 投诉者有时心情很不好，还不听解释。撇开其他不谈，引物化学合成，哪里有机 会污染到蛋白质？ 需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。 A ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions 260/280 Base Composition A 260/280 5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3 2.50 5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3 1.85 5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3 1.15 5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 1.14 5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3 1.66 27.ODPAGEEB 答：通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结 构的可能性不同，EB的染色程度也会有差异，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB染色效果就非常差。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度 计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。 28. 答：引物不纯可能会导致：1)非特异性扩增；2)无法用预先设计在引物5'端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物；3) 用于测序出现双峰或乱峰。解 决办法重新合成或重新纯化。 29. 答：有些PCR扩增没有成功，怀疑是引物不好。要求我们重合，没有问题。可 是有时遇到重合数次的引物PCR扩增还是不成功。这种情况的出现一般都是用 户自己的原因。对于引物合成，我们只能做到合成的引物没有问题，至于您是否 能够扩增出来您需要的产物，那得靠您自己对实验本身的理解和把握。我们不能 杜绝我们不犯错误，但是引物合成犯同样错误的几率很小，想犯同样的错误都难。 PCR扩增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判 定原因。 如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的OD值，看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的，请您告诉我司您的引物编号，我们会复查留 存样品。如不明原因，我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增，请您查 找其它原因。 30. 答：如果您溶解引物的水PH过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物， 避免反复冻溶。建议使用10mM Tris pH7.5缓冲液溶解引物，因为因为有些蒸馏 水的pH值比较低（pH4-5）, 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物 没有问题，而是PCR使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。 31. 答：合成的引物和您的定单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。 32. 答：不负责任。我们免费为一些实验经验不足的人员，免费设计引物。引物设计 好，我们都会发给您确认。设计引物时我们遵循一般的指导原则，但是设计的引 物是否能够满足您的实验要求，扩增出您需要的基因片段，我们就不能保证了。 我们遇到一些用户，他们讲：引物是你们设计的，也是你们合成的，我做不出， 你们就要付责任。听到这样的抱怨，觉得心寒。 33.PCR 答：基本不是。当今发展出各色各样的PCR扩增技术，各色各样的高温聚合酶， 就是来解决PCR扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。如槽式PCR就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增, GC含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。 引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（1） RT-PCR。请注意，很多基因通过常规RT –PCR方法是很难不增出来的。 RT- PCR成功的关键在于RT 的反应的RNA质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。（2）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用 量。基因组DNA过高，会影响反应体系中的Mg和pH。 34.PCR 答：不能。瞧，扩增目标很弱或没有，道是非特异性条带很亮，说明引物不纯或 有污染。一些用户如是说。我们曾分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特 异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。我们只能说非特异性扩增一般是模 板污染（如RNA中污染基因组）或扩增条件不合适所致。 35. 答：不合理。对引物合成的成本，我们做了准确的统计和评估，认为现阶段引物 的价格处于一种非理性化状态，价格已基本探底。引物合成的成本主要由四部分 组成：（1）合成原料 （2）设备折旧 （3）人员费用 （4）场地和水电等消耗。其中合成原料占生产成本占30%，设备折旧占30%，人员费用占20%，场地和水电消耗等20%。我们的合成成本控制