蒲黄总黄酮对3T3L1脂肪细胞过氧化物酶体增生.doc

蒲黄总黄酮对3T3L1脂肪细胞过氧化物酶体增生.doc 蒲黄总黄酮对3T3 L1脂肪细胞过氧化 物酶体增生 【摘要】 观察蒲黄总黄酮(Pollen Typhae total flavones, PTF)对脂 肪细胞糖脂代谢和过氧化物酶体增生物激活受体(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)家族基因达的影响，并分 析其改善胰岛素抵抗的可能机制。方法:蒲黄总黄酮干预3T3 L1 脂肪细胞，实时定量荧光多聚酶联反应检测脂肪细胞分化相关基因 PPAR家族，包括PPARα、PPARγ和PPARβ/δ mRNA的表达。 结果:蒲黄总黄酮可上调PPARα、PPARγ mRNA的表达，下调 PPARβ/δ mRNA的表达，与正常对照组比较，差异有统计学意义 (P<0.01)。结论:蒲黄总黄酮可能通过提高3T3 L1脂肪细胞 PPARα和PPARγ mRNA的表达改善胰岛素抵抗。 【关键词】 脂肪细胞 蒲黄总黄酮 游离脂肪酸 PPAR家族 Objective: To explore the effects of Pollen Typhae total flavones (PTF) on the mRNA expressions of peroxisome proliferator activated receptors (PPARs) α, γ, β/δ so as to analyze its possible mechanism in improving the insulin sensitivity of 3T3 L1 adipocytes. Methods: Adipocytes RNAs relating to the adipocyte glucose and lipid metabolism ined by reverse transcription polymerase chain reaction. Results: PTF obviously up regulated the expressions of PPARα and PPARγ mRNAs, all shoal control group (P<0.01). Conclusion: EM)和TRIzol由GIBCO公司提供;地塞米松、异丁 基 甲基 黄嘌呤和胰岛素购自Sigma公司;油红O购自Sigma公 司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)为Sino American Biotech公司产品;逆转录酶AMV第一链cDNA合成试剂 盒为Bio Basic公司产品;聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增试剂盒购自Invitrogen公司。 1.2 细胞培养及分组 3T3 L1细胞株购自America Type Culture Collection公司，其培养与诱导分化方法同文献,4,。将3T3 L1 前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培 养，待细胞融合2 d后，加含0.5 mmol/L异丁基 甲基 黄嘌呤、 0.25 nmol/L地塞米松和10 μg/ml胰岛素的10%胎牛血清高糖 DMEM培养48 h，换以含10 μg/ml胰岛素的含10%胎牛血清培养 液再培养48 h，随后以10%胎牛血清高糖DMEM继续培养，2 d换 培养液1次，诱导分化8,12 d，3T3 L1细胞90%呈脂肪细胞表 型,1,。将24孔培养板中分化成熟的脂肪细胞以含0.2% BSA的 DMEM培养基培养12 h后，分为空白对照组(不加药)、蒲黄总黄 酮组(0.2 g/L)和罗格列酮组(5 μmol/L)，药物均使用去离子水配置，药物干预培养24 h。 1.3 PPAR mRNA表达 采用实时定量PCR法检测。药物处理同上，抽提细胞总RNA，以AMV第一链cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA。上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PPARγ上游引物:5' TTT CAA GGG TGC CAG TTT CG 3';下游引物:5' GGG AGG CCA GCA TCG TGT A 3'。PPARα上游引物:5' TAC GGC AAT GGC TTT ATC AC 3';下游引物:5' CCC TCC TGC AAC TTC TCA AT 3'。PPARβ/δ上游引物:5' TGC GGC AAC GTG AAA GGA AT 3';下游引物:5' ACG CGG TAT CCA CGT CAA GTA 3'。看家基因甘油醛 3 磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase, GAPDH)上游引物:5' AAG GTC GGA GTC AAC GGA TT 3';下游引物:5' CTG GAA GAT GGT GAT GGG ATT 3'。参照试剂盒说明，反应体系为25 μl，内含5×PCR Buffer 5.0 μl，Mg2+ 0.3 μl，dNTP 0.75 μl，引物1.0 μl，25×SYBR Green?1.0 μl，校准液 1.0 μl，Ex Taq酶0.25 μl，ddH2O 14.7 μl，1.0 μl。实时定量PCR反应在Cotbett Roto Gene 3000实时定量PCR仪中进行。反应程序为:95 ?预变性10 s，60 ? (GAPDH)退火30 s，55 ?延伸10 s，共80个循环，每个循环结束后采集荧光信号。最后绘溶解曲线以确定反应产物无引物二聚体及非特异性扩增。当荧光信号强度超过基线时，其域值循环数(cycle threshold，Ct)被记录下来。在实时定量PCR中，Ct值被认为与被扩增基因的初始浓度密切相关。扩增后根据Ct值及曲线计算出目的基因拷贝数与106 GAPDH的相对值。 1.4 统计学方法 采用SPSS 11.0 for ed. 2007; 24(9): 934 945. 2 , üller M, Kersten S. PPARalpha and dyslipidemia. Biochim Biophys Acta. 2007; 1771(8): 961 971. 6 Chou FS, ol Cancer Res. 2007; 5(6): 523 530. 7 Pfützner A, M, Forst T. Pioglitazone: update on an oral antidiabetic drug acother. 2007; 8(12): 1985 1998. 8 Jucker BM, Yang D, Casey , et al. Selective PPAR (delta) agonist treatment increases skeletal muscle lipid metabolism itochondrial energy coupling: an in vivo magic resonance spectroscopy study. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2007; 293(5): E1256 E1264. 9 Fagerberg B, Schuster H, Birketvedt GS, et al. Improvement of postprandial lipid handling and glucose tolerance in a non diabetic population by the dual PPAR alpha/gamma agonist, tesaglitazar. Diab Vasc Dis Res. 2007; 4(3): 174 180.