层析原理与技术

**层析原理与方法**内容提要1、层析原理与技术2、层析方法 凝胶过滤层析 离子交换层析 羟基磷灰石层析 疏水层析 亲和层析**层析的起源和原理 起源----1906年，俄国植物学家Tsweet 原理----利用物质分配系数不同达到分离目的层析原理Chromatography层析色谱谱法创始于20世纪初，1906年俄国植物学家TSWEET将碳酸钙放在竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在管的不同部位形成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为固定相（STATIONARYPHASE），冲洗剂称为流动相（MOBILEPHASE）。随着其不断发展，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。虽然“色”已失去意义，但色谱法名称仍沿用至今。**什么是蛋白层析 根据蛋白分子物理化学特性的不同而达到分离 极性/疏水性：polarity(solubility,volatility)HIC,RP 离子特性：ioniccharacteristics(charge)IEX 大小与形状：size/mass(diffusion,sedimentation)GF 结构特征与活性位点：shape(ligandbinding,affinity)AC这些特性的区别使不同蛋白质分子在层析的固定相和流动相的分配不同而达到分离层析原理**分离机制 分子的大小-----凝胶过滤(size-exclusion)（分子筛，分子排阻） 分子的电性-----离子交换（IEC）阳离子交换、阴离子交换 分子的面疏水结构-----疏水层析（HIC），反相 其它：羟基磷灰石，金属螯合(IMAC)，亲和，染料配基介质层析 精制（polishing）：高分辨率层析分离机制**层析的基本概念流动相固定相C流出组份123123洗脱峰层析原理**层析的基本概念固定相：固定相是层析的一个基质，能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。（在柱层析中称其为层析填料。）它对层析的效果起着关键的作用。 层析原理 流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体等。（柱层析中一般称为洗脱剂。）Agoodgelforgelfiltrationcontainsabout95%water*固定相：固定相是层析的一个基质，能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。**层析方法 凝胶过滤层析 离子交换层析 羟基磷灰石层析 疏水层析 亲和层析**GelFiltration凝胶过滤IonExchange离子交换HydrophobicInteraction疏水层析Affinity亲和层析CHT羟基磷灰石层析原理**凝胶过滤层析/分子筛**分子筛层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技术。具有分子筛作用的物质很多，如浮石、琼脂、琼脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝胶等。凝胶过滤**1.Sphericalparticlespackedintoacolumn2.Sampleapplied3. Buffermobilephaseandsamplemovethroughcolumn,moleculesdiffuseinandoutofmatrix4.largemoleculesleavethecolumnfirstfollowedbysmallermoleculesinorderofsize,moleculeslargerthanthematrixporespassstraightthrough.凝胶过滤Moleculeslargerthantheporesinthegelareunabletodiffuseintothegelandareconfinedtothesolutionsurroundingthebeads.Moleculeswhichrangeinsizebetweentheverybig(excludedfromthegel)andverysmallcanpenetratetheporestovaryingdegreesbasedontheirsize.Accesstotheporesislimitedbysterichindrance.Ifamoleculeissmallerthanthesmallestoftheporesinthegel,itwillbeabletoenterthetotalporevolume.Forgelfiltrationtobeeffective,twofactorsareessential:1)Themoleculestobeseparatedmusthavesignificantlydifferentsizes.2)Therangeofporesizesofthegelmustbeappropriateforthesizeofthemoleculestobeseparated.**凝胶过滤层析分离纯化原理**Stericexclusionleadstoearlyelution 按照分子量大小洗脱 大分子首先洗脱，最小的分子在最后面洗脱Thisfigureillustratesthisforthreemoleculeswithdifferentsizes.Thelargemoleculescomeoutfirst.Othermoleculesleavethecolumnindecreasingorderofsize.Thesmallestmoleculeselutelast.Thelargemoleculesaretobigtoentertheporesandelutewhenavolumeofliquidwhichisequaltothevolumeinthecolumnoutsidethegelbeadshaspassed.Thisvolumeiscalledthevoidvolume,Vo.Themoleculeswithasizeinbetweenthelargestandsmallestporesofthegelentersomeofthetotalporevolume,butnotallofit.Thosemediumsizedmoleculeseluteattheirretentionvolume,Vr,whichisequaltothevoidvolumeplustheaccessiblevolumeofthepores.Verysmallmoleculescanpenetratealltheporesandareelutedwiththetotalliquidvolume,termedVt.Amodelgelfiltrationchromatogramisshownontheright.Thelargestmolecule(peak1)isexcludedandelutesfirst.Thesmallestmolecules(peak3)canpenetratethetotalporevolumeandareelutedlast.Themoleculeswithasizeinbetween(peaks2)eluteinbetween.**1001,00010,000100,000Bio-GelP2Bio-GelP4Bio-GelP6Bio-GelP10Bio-GelP30Bio-GelP60Bio-GelP1001,8008004,0001,0006,000，用于脱盐1,50020,0002,50040,0003,00060,0005,000100,000100凝胶过滤层析凝胶的选择** 柱长的选择分离：30－120cm脱盐：30cm以下洗脱液离子强度 pH——中性 流速，根据层析介质的说明，一般很低 样品容量：1－3％CV凝胶过滤层析操作选择** 1.可分离相对分子量从几百到几十万的物质具有3000个理论塔板的凝胶过滤可将分子量相差2倍的蛋白质完全分开,6000个理论塔板的可将分子量相差1.5倍的蛋白质完全分开;建议柱高在80-120cm,直径=H/30 2.脱盐凝胶过滤层析凝胶过滤层析的应用**凝胶过滤层析凝胶过滤层析的特点： 层析柱规模很大，实验室1.0-2.5×30-100cm，工艺10－20×200cm，从而设备成本很高； 上样体积少，必须少于柱床体积的3％才能达到较好的分离效果，如果大体积样品必须浓缩，从而造成样品的损失和增大工艺的复杂性； 工艺时间（生产周期）长，甚至24小时或以上； 分辨率低； 不需摸索纯化条件，按照分子量区带分离因此，往往用分子筛分离时只适用于纯化的最后一步，或离子交换上样前的脱盐**离子交换层析**离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。离子交换层析**离子交换层析离子交换层析类型及其选择-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-**pIstabilityrangestabilityrange与阳离子交换介质结合+-denaturationdenaturationpH102离子交换层析离子交换层析原理——蛋白质滴定曲线蛋白质净电荷与阴离子交换介质结合*当PH>PI,蛋白质带负电,结合阴离子介质.当PH<PI,蛋白质带正电,结合阳离子介质**Products:UNOsphere™Q&S,Macro-Prep®HighQ&S,CM,DEAE,AG®resinsEquilibrationSampleApplicationSampleAdsorptionElutionRegeneration离子交换层析离子交换层析原理**sampleapplicationandwashelutionequilibrationregeneration---+++++++++++++++++++++++++++++-----------anionexchangerbead离子交换过程Nowthatweunderstandsomerelevantpropertiesofproteinsandionexchangers,wewilldiscusstheprinciplesofachromatographicionexchangeseparation.Asinallchromatographictechniques,thefirststepistheequilibrationofthestationaryphasetothedesiredstartconditions.TheequilibrationtimeorvolumemustbelargeenoughtoguaranteeaconsistentionicstrengthandpHthroughouttheionexchangecolumn.In-lineconductivityandpHmonitorshelptoquicklyqualifythesecolumnconditions.Whenequilibriumisreached,allstationaryphasechargedgroupsareassociatedwithexchangeablecounter-ions,suchaschlorideorsodium,asshowabovebythered(counterions)andyellow(stationaryphasechargedgroups)balls.Thesecondstepissampleapplicationandwash.Thegoalinthisstepistobindthetargetmolecule/sandwashoutallunboundmaterial.ThesamplebuffershouldhavethesamepHandionicstrengthasthestartingbufferinordertobindallappropriatelychargedproteins.Thecounter-ionsaredisplacedbythebiomoleculesatthisstage.Moleculescarryingthesamechargeastheionexchangerwillpassthroughthecolumn.Proteinsandothermoleculescarryinglittlenetcharge(e.g.withpIsclosetothebufferpH)willalsopassthroughwiththewashofbindingbufferaftersampleapplication.Inthethirdstep,elution,biomoleculesarereleasedfromtheionexchangerbyachangeinthebuffercomposition.Acommonwayistoincreasetheionicstrengthwithsodiumchloride,oranothersimplesalt,inordertodesorbtheboundproteins.Proteinsaredesorbedrelativetothenumberofchargedgroupsontheirsurface.Theyarereplacedontheionexchangerwiththeexchangeablecounter-ions.Thefinalstep,regeneration,removesallmoleculesstillbound.Thisensuresthefullcapacityoftheionexchangerisavailableforthenextrun.Bufferscontainingconcentratedsaltsolutions(e.g.1Msodiumchloride)canbeusedforthisstep.**离子强度洗脱时多采用离子浓度梯度,常加NaCl,KCl,LiCl等.在不同盐浓度（离子强度）及其不同变化率（梯度）条件下保留行为不同，需对该条件进行摸索。一般的，随离子强度增加，蛋白质保留值减小。缓冲液与pH选择适当的缓冲体系，起始浓度要尽可能低些(0.01-0.05M)缓冲液PH值：阳离子低于pI一个pH单位以上阴离子通常高于pI一个pH单位以上蛋白质在不同pH下保留行为差别较大，所以许对缓冲体系和操作pH进行摸索，以得到最佳层析条件。离子交换层析离子交换层析操作参数选择**pI＝5.5+-pH102离子交换层析缓冲液与pHpI＝7.5阳离子交换阴离子交换碱性蛋白，采用阳离子交换酸性蛋白，采用阴离子交换蛋白质净电荷pH4.0pH9.0蛋白质稳定性范围**pH7.0pH8.0pH8.9pH6.0缓冲液与pH的影响——阴离子交换离子交换层析离子交换层析操作参数选择**离子交换层析离子交换层析操作参数选择盐溶液梯度的影响**疏水层析** 基于生物分子表面疏水性不同而达到分离的技术 疏水作用来自于分子的水化结构，高浓度盐溶液破坏生物分子的水化结构，使蛋白质内部的疏水基团暴露于分子外表面，从而可与疏水介质结合 不同离子的疏水性Anions:SO42->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN-Cations:Mg2+>Li+>Na+>K+>NH4+ 蛋白质以高浓度盐溶液结合与疏水层析柱上，以低浓度盐溶液洗脱原理疏水层析**疏水层析 生物分子表面大都有或强或弱的疏水区域，在不同环境下，与各种疏水介质产生不同强弱的结合 高离子强度可加强疏水性 跟离子交换相反，高盐吸附，低盐洗脱；洗脱样品又可直接或稍加稀释后加上其他层析柱，作为连接层析步骤的桥梁，取代盐析沉淀技术 配体种类繁多，很难预测哪一种、哪一个条件最适合，可用疏水层析试盒选择介质**作用原理溶质曝露在外的疏水基配基水分子大量水分子DG=DH-TDSThereisnogeneralanswertohowaproteinsurfaceinteractswithhydrophobicligandsonaHICadsorbent."Commonexplanation"-increaseinentropy(Ref.Porathetal.1973,Nature245:465) Displacementoftheorderedwatermoleculestobulkywaterleadstoanincreaseinentropy(DS). Theincreaseinentropyresultsinanegativevalueforthechangeinfreeenergy(DG)ofthesystem Thisnegativechangeinfreeenergy(DG)isthermodynamicallyfavorable. Thustheincreaseinentropy(DS),aresultofthehydrophobicligand-biomoleculeinteraction,isthemaindrivingforceinHIC.(DG=DH-TDS),whereDH(positiveenthalpyterm)isnegligible.**操作参数选择疏水层析 疏水介质选择：甲基，丁基，苯基疏水疏水性强的蛋白质：甲基，丁基疏水性弱的蛋白质：丁基，苯基 盐：硫酸铵，醋酸铵等等 缓冲体系和pH 洗脱梯度**Sample: GFPsamplebroughtupto2MAS,filteredLoad: 5mlBuffer: A:2M(NH4)2SO4+0.1MNaP,pH7 B:0.1MNaP,pH7FlowRate: 3ml/min(230cm/hr)Macro-Prep甲基疏水苯基疏水20%EtOH疏水层析**亲和层析** 亲和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力，从而达到分离目的的一类特殊层析技术。亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。亲和层析** Equilibration Sampleapplication Bindingandwashing DesorptionandelutionEquilibratethecolumnandthesampletobindingconditions.亲和层析**亲和层析 Equilibration Sampleapplication Bindingandwashing DesorptionandelutionApplysampleunderbindingconditions.**亲和层析 Equilibration Sampleapplication Bindingandwashing DesorptionandelutionChangetheeluenttoelutethetarget.** ProfinityIMAC——纯化His-taggedProtein Chelex100——纯化DNA，PCR样品制备 Affi-GelProteinA——纯化单克隆抗体 Dye-Affi-GelBlue(DEAEorCM)——纯化单抗，分离HSA Affi-Gel肝素凝胶——多种蛋白，如凝结因子、蛋白酶、核酸酶、脂酶 Affi-GelPolymixin——去除内毒素（热原） Affi-Gel硼胶——分离核苷酸、核苷、儿茶酚胺、糖类等小分子亲和层析产品与应用**ProfinityIMACResins固定化金属螯合层析：ImmobilizedMetalAffinityChromatography（IMAC） 基于纯化重组组氨酸标记蛋白，专门纯化His-taggedProtein螯合带电离子，如Zn2+,Ni2+,Cu2+,现有的产品为螯合Ni2+的介质 UNOsphere技术更好的流动特性，在高流速下载量，目的蛋白得率和纯度不会受到影响。IDA**不同IMAC介质纯化氨基肽酶(aminopeptidase)纯度比较ProfinityIMAC,IDAligandProfinityIMACResins**ProfinityIMACResins纯化6His-taggedproteinSample：E.coli.lysate96%纯度ProfinityIMACResins**羟基磷灰石层析** Ca10(PO4)6(OH)2 5个带正电荷的Ca离子对（C位点） 2个磷酸三价离子，每个含有带6个负电荷的氧原子（P位点） 2个羟基 于其他层析介质不同，CHT的骨架是化学反应的表面CHT陶瓷羟基磷灰石晶体结构陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术** 蛋白质带正电氨基 经典的阳离子交换 用中性盐溶液(NaCl)或缓冲盐溶液(PO4)洗脱初级保留机制陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术** 带负电羧基 经典的金属螯合作用，并受离子排阻调节 比离子间静电相互作用强15–60倍 在无PO4条件下不能被任何浓度NaCl洗脱 用PO4洗脱初级保留机制陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术** 优点独特的分离机制高再生能力高分辨率容易规模放大容易进行方法开发高机械稳定性高化学稳定性层析柱寿命长颗粒大小：20um、40um和80um陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术Thenewceramichydroxyapatitehasalltheuniqueseparationpropertiesofthecrystallinematerial,butnoneofit’slimitations.**TypeI 由于具有更高的表面积，I型具有更高的蛋白载量，而且具有更大的保留.TypeII由于具有大孔结构，II型具有更高的核酸载量，能分离单链和双链DNA，和超螺旋与非超螺旋的DNA白蛋白不能与II型结合，对于一些含白蛋白的抗体样品，II型分离纯化更有利.大分子重组疫苗的中间纯化和大规模制备如何选择类型陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术**分离纯化原理与操作参数选择羟基磷灰石（CHT）影响蛋白质色谱行为的操作参数：CHT类型NaCl浓度PB缓冲液浓度梯度双梯度洗脱PB缓冲液梯度含不同NaCl浓度缓冲液pH值双梯度洗脱模型先以0-500mMNaCl，再以0-500mM磷酸钾**双梯度洗脱羟基磷灰石（CHT）0-0.5MNaCl0-0.4MNaPO4玉米种子中纯化转基因抗体IgG** 单克隆抗体，多克隆抗体纯化 重组疫苗 抗体片段 重组蛋白质 酶 核酸:DNA/RNA(单双链) 膜蛋白质羟基磷灰石应用陶瓷羟基磷灰石（CHT）分离技术Hydroxyapatiteisanextremelyversatilechromatographytool.Ithasbeenusedforoverthirtyyearsforseparationofbiologicalmoleculesofallkinds...itisusedtoseparateandpurify...Hydroxyapatiteisacrystallinecalciumphosphatecompoundwhichishydroxylated.Bio-Radisthelargestmanufacturerofhydroxyapatiteforchromatographyintheworld,wemakeseveraltoneveryyearswhichareusedinbothlaboratoriesandpharmaceuticalanddiagnosticproductionallovertheworld.**SizeExclusion(SEC)－分子筛（或凝胶过滤） 分子大小–用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化 IonExchange(IEX)－离子交换 电荷–可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化 HydrophobicInteraction(HIC和RP)－疏水疏水相互作用-用于中间纯化，去除脂类和脂多糖 Affinity(AC)－亲和 生物相互作用–用于复杂样品的最早捕获或中间纯化 CeramicHydroxyapatite(CHT)－羟基磷灰石 独特分离机理，包含离子交换和金属螯合等,可用于层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化层析技术**谱法创始于20世纪初，1906年俄国植物学家TSWEET将碳酸钙放在竖立的玻璃管中，从顶端倒入植物色素的石油醚浸取液，并用石油醚冲洗。在管的不同部位形成色带，因而命名为色谱。管内填充物称为固定相（STATIONARYPHASE），冲洗剂称为流动相（MOBILEPHASE）。随着其不断发展，色谱法不仅用于有色物质的分离，而且大量用于无色物质的分离。虽然“色”已失去意义，但色谱法名称仍沿用至今。*固定相：固定相是层析的一个基质，能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用流动相：在层析过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体或超临界体等，都称为流动相。柱层析中一般称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它也是层析分离中的重要影响因素之一。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。①被分离物质本身的性质；②固定相和流动相的性质；③层析柱的温度。Moleculeslargerthantheporesinthegelareunabletodiffuseintothegelandareconfinedtothesolutionsurroundingthebeads.Moleculeswhichrangeinsizebetweentheverybig(excludedfromthegel)andverysmallcanpenetratetheporestovaryingdegreesbasedontheirsize.Accesstotheporesislimitedbysterichindrance.Ifamoleculeissmallerthanthesmallestoftheporesinthegel,itwillbeabletoenterthetotalporevolume.Forgelfiltrationtobeeffective,twofactorsareessential:1)Themoleculestobeseparatedmusthavesignificantlydifferentsizes.2)Therangeofporesizesofthegelmustbeappropriateforthesizeofthemoleculestobeseparated.Thisfigureillustratesthisforthreemoleculeswithdifferentsizes.Thelargemoleculescomeoutfirst.Othermoleculesleavethecolumnindecreasingorderofsize.Thesmallestmoleculeselutelast.Thelargemoleculesaretobigtoentertheporesandelutewhenavolumeofliquidwhichisequaltothevolumeinthecolumnoutsidethegelbeadshaspassed.Thisvolumeiscalledthevoidvolume,Vo.Themoleculeswithasizeinbetweenthelargestandsmallestporesofthegelentersomeofthetotalporevolume,butnotallofit.Thosemediumsizedmoleculeseluteattheirretentionvolume,Vr,whichisequaltothevoidvolumeplustheaccessiblevolumeofthepores.Verysmallmoleculescanpenetratealltheporesandareelutedwiththetotalliquidvolume,termedVt.Amodelgelfiltrationchromatogramisshownontheright.Thelargestmolecule(peak1)isexcludedandelutesfirst.Thesmallestmolecules(peak3)canpenetratethetotalporevolumeandareelutedlast.Themoleculeswithasizeinbetween(peaks2)eluteinbetween.*当PH>PI,蛋白质带负电,结合阴离子介质.当PH<PI,蛋白质带正电,结合阳离子介质Nowthatweunderstandsomerelevantpropertiesofproteinsandionexchangers,wewilldiscusstheprinciplesofachromatographicionexchangeseparation.Asinallchromatographictechniques,thefirststepistheequilibrationofthestationaryphasetothedesiredstartconditions.TheequilibrationtimeorvolumemustbelargeenoughtoguaranteeaconsistentionicstrengthandpHthroughouttheionexchangecolumn.In-lineconductivityandpHmonitorshelptoquicklyqualifythesecolumnconditions.Whenequilibriumisreached,allstationaryphasechargedgroupsareassociatedwithexchangeablecounter-ions,suchaschlorideorsodium,asshowabovebythered(counterions)andyellow(stationaryphasechargedgroups)balls.Thesecondstepissampleapplicationandwash.Thegoalinthisstepistobindthetargetmolecule/sandwashoutallunboundmaterial.ThesamplebuffershouldhavethesamepHandionicstrengthasthestartingbufferinordertobindallappropriatelychargedproteins.Thecounter-ionsaredisplacedbythebiomoleculesatthisstage.Moleculescarryingthesamechargeastheionexchangerwillpassthroughthecolumn.Proteinsandothermoleculescarryinglittlenetcharge(e.g.withpIsclosetothebufferpH)willalsopassthroughwiththewashofbindingbufferaftersampleapplication.Inthethirdstep,elution,biomoleculesarereleasedfromtheionexchangerbyachangeinthebuffercomposition.Acommonwayistoincreasetheionicstrengthwithsodiumchloride,oranothersimplesalt,inordertodesorbtheboundproteins.Proteinsaredesorbedrelativetothenumberofchargedgroupsontheirsurface.Theyarereplacedontheionexchangerwiththeexchangeablecounter-ions.Thefinalstep,regeneration,removesallmoleculesstillbound.Thisensuresthefullcapacityoftheionexchangerisavailableforthenextrun.Bufferscontainingconcentratedsaltsolutions(e.g.1Msodiumchloride)canbeusedforthisstep.ThereisnogeneralanswertohowaproteinsurfaceinteractswithhydrophobicligandsonaHICadsorbent."Commonexplanation"-increaseinentropy(Ref.Porathetal.1973,Nature245:465) Displacementoftheorderedwatermoleculestobulkywaterleadstoanincreaseinentropy(DS). Theincreaseinentropyresultsinanegativevalueforthechangeinfreeenergy(DG)ofthesystem Thisnegativechangeinfreeenergy(DG)isthermodynamicallyfavorable. Thustheincreaseinentropy(DS),aresultofthehydrophobicligand-biomoleculeinteraction,isthemaindrivingforceinHIC.(DG=DH-TDS),whereDH(positiveenthalpyterm)isnegligible.Thenewceramichydroxyapatitehasalltheuniqueseparationpropertiesofthecrystallinematerial,butnoneofit’slimitations.Hydroxyapatiteisanextremelyversatilechromatographytool.Ithasbeenusedforoverthirtyyearsforseparationofbiologicalmoleculesofallkinds...itisusedtoseparateandpurify...Hydroxyapatiteisacrystallinecalciumphosphatecompoundwhichishydroxylated.Bio-Radisthelargestmanufacturerofhydroxyapatiteforchromatographyintheworld,wemakeseveraltoneveryyearswhichareusedinbothlaboratoriesandpharmaceuticalanddiagnosticproductionallovertheworld.