大鼠寡霉素敏感相关蛋白（OSCP）基因点突变的改造

大鼠寡霉素敏感相关蛋白（OSCP）基因点突变的改造 大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因点 突变的改造 ? 134? 文章编号:1007—6611(2006)02—0134—04 山西医科大学(JShanxiMedUniv)2006年2( 大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)基因点突变的改造 庞敏,王海龙,田树华.,乔中东.(山西医科大学第一临床医学院呼吸科,太原030001;.山西医科 大学医学实验中心;上海交通大学医学院) 摘要:目的获取具有正确核苷酸序列的大鼠寡霉素敏感相关蛋白(oscp)基因.方法通过限制性核酸内切酶将发生 有义突变的两个OSCP基因的DNA克隆进行改造,并进行基因重组.结果酶切及测序显示对OSCP基因有义突变部分 的纠正获得成功.结论通过基因工程技术获得具有正确核苷酸序列的大鼠寡霉素敏感相关蛋白(Cls(1P)基因,为OSCP 的达及结构功能研究奠定了基础. 关键词:寡霉素敏感相关蛋白;点突变;基因改造;亚克隆;ATP合成酶复合物 中图分类号:(~/89文献标识码:A Modificationofmutatedrat(CPgene PANGMin.WANGHai—long,TIANShu—hua,etal(DeptofRespiratoryDiseases,FirstClinicalMedicalCollege,ShamciMedi— calUniversity,Taiyuan030001,Cina) Abstract:ObjectiveToobtainthecorrectnucleotidesequenceofoligomycinsensitivity-conf erringprotein(OSCP)ofrats MethodThetwoclonesof0SCPgeneweremodifiedbyrestrictionendonucleaseandreccmab inedbyT4DNAligase.ResultRe— strictionendonucleasedigestionandsequencingshowedthatthemodificationofthese】雠mutationofOSCPgenecarlbesuccessfu1. ConclusionThecorrectionnucleotidesequenceofOSCPgeneWaSsuccessfullyobtainedthr oughgeneengineering,providingabasis fortheresearchof0SCPgeneexpression. Keywords:digmaycinsensitivity-conferringprotein;pointmutatkm;genem0difi髓ti?;subdc~e;虹Psynthaseom3plexes 固醇类激素发挥作用的经典途径是核受体途 径,但越来越多的证据表明,固醇类激素还可通过 所谓的膜受体途径激活胞内信号分子而发挥作用. 所以,研究固醇类激素的膜受体就显得特别有意 义.Zheng等报道,雌性大鼠神经突触膜上有寡霉 素敏感相关蛋白(oligomycinsensitivity—conferring protein,OSCP),它与雌二醇有高亲合力…,进而推 测OSCP可能是雌激素的一种细胞膜表面受体l2]. 本实验室对大鼠OSCP基因进行了克隆_3J,获得两 克隆.克隆1在300位缺失一碱基A,克隆2在99 位发生有义突变,A—G,为获得具有正确序列的基 因及进一步进行基因表达,需对克隆1和克隆2进 行改造.本实验通过限制性核酸内切酶将发生有 义突变的两个OSCP基因的DNA克隆进行改造, 并进行基因重组.获得了具有正确核苷酸序列的 OSCP基因,为osCP基因的表达及其作为雌激素 膜受体的研究奠定了基础. 1材料与方法 1.1实验材料 1.1.1菌株和质粒E.coliJM1O9,pGEMTeasy vector为山西医科大学医学实验中心保存. 1.1.2主要试剂限制性内切酶RI,PpuM I,SalI,NotI,SpeI,PstI,SacI(Sangon), Klenow片段,T4DNA连接酶,DNAMakerX. 174DNA(附<a);其余试剂为国产分析纯. 1.2实验方法 1.2.1亚克隆2的制备本实验室在前面的研究 中已基本获得大鼠osCP基因的开放阅读框序 列L3],为了得到完全正确的序列,需要对克隆1[3J在 300bp处缺失A碱基及克隆2L3_在99bp处发生的 有义突变进行改造.首先用SpeI+,I双酶切 克隆2,以删除插入位点下游部分的多克隆位点中 的EcoRI酶切位点.然后通过Klenow片段补平, T4DNA连接酶连接,从而获得亚克隆2,用EcoR I,PpuMI+SalI单酶切,双酶切进行鉴定. 1.2.2亚克隆pGEM-Teasy—OSCP的制备在 OSCP的213bp处有一PpuM工酶切位点,而在 pGEM,Teasy载体上无此酶切位点,这就为改造克 隆1和亚克隆2以获得具有正确开放阅读框序列的 OSCP基因提供了条件.克隆1和亚克隆2的质粒 DNA分别经PpuM工+SacI双酶切,1%TAE凝 胶回收,纯化克隆1的约3122bp片段和亚克隆2 的约572bp片段,然后将这两片段用T4DNA连接 酶连接,从而得到亚克隆pGEM—Teasy—OSCP. 山西医科大学(JShanxiMedUniv)2006年2月,37(2 EcoRI,VpuMI,SalI,NotI,EcoRI+PpuM I,PpuMI+ZI,Ef0RI+I单酶切,双酶 切鉴定. 1.2.3亚克隆pGEM-Teasy—OSCP测序由上海 交通大学Bx实验室进行测序工作. 2结果 亚克隆的构建与鉴定结果如下. 2.1亚克隆2的构建与鉴定经过SpeI+,I 双酶切克隆2,Klenow片段补平,T4DNA连接酶连 接,从而获得亚克隆2,用EcoRI,PpuMI+Sa! I单酶切,双酶切进行鉴定.由于去除pGEMT easy—OSCP多克隆位点下游的RI酶切位点,所 以EcoRI单酶切可见一条约3694bp的DNA条 带;PpuMI+ZI双酶切后可见约553bp和3 141bp两条DNA条带,说明在改造过程中,与R I相邻的SalI位点保存完好(见图1). 2.2亚克隆pGEM—Teasy.OSCP的构建与鉴定 克隆1和亚克隆2的质粒DNA分别经PpuMI+ M4 1.PpuMI+SacI亚克隆2的酶切 2.PpuMI+sI亚克隆2的酶切 3.0RI亚克隆2的酶切 4.PpuMl+SacI克隆1的酶切 M.DNAmarker 图1亚克隆2的酶切鉴定 bp 1057 770 6l2 495 2lO ? 135- SacI双酶切(见图1),回收并连接由PpuMI+ SacI双酶切得到的克隆1和亚克隆2的3219bp 和573bp片段,得到亚克隆pGEM—Teasy—OSCP. 由于在亚克隆pGEM—Teasy—OSCP上只有1个 E幻RI,PpuMI,SalI酶切位点而无NotI酶切 位点,所以当分别用E?Ri,PpuMI,ZI,Not I单酶切时仅见一约3694bp的条带,而当用 EcoRI+PpuMI,PpuMI+SaZI,EcoRI+ ZI双酶切时,分别可见265bp和3429bp,553 bp和3141bp,818bp和2876bp两条带(见图2). 2.3亚克隆2和亚克隆pGEM—Teasy—OSCP的构 建策略和过程见图3. 2.4亚克隆pGEMTeasy—OSCP的测序结果经 上海交通大学Bio-X实验室进行测序,用DNASIS 等软件分析,结果显示所得重组OSCP基因序列改 造获得成功(见图4). 3讨论 OscP是ATP合成酶P酶的一个亚单位. M】234567 l,2,3分别是Ec0Rl+PpuMI,VpuMI+SalI,EcoRI+ sl双酶切亚克隆pGEM—Teasy—OscP后条带;4,5,6,7 分别是Ec0RI,epuMI,5aJI,NotI酶切亚克隆 pGEM—Teasy—OSCP后条带;M是DNAmarker 图2亚克隆p6EM—Te~sy-OSCP的酶切鉴定 + ?峨Ligme 图3亚克隆2和亚克隆pGEM-Teasy—OSCP的构建示意图 - 136?山J耍匡堂堂拯(』iUniv)2006年2月,37(2 ATP合成酶/ATP酶是一个跨膜的多亚基复合体, 广泛存在于线粒体,细菌,叶绿体的胞壁膜上,包括 位于膜外的F1,位于膜内的FD以及连接二者的 OSCP三部分组成[4一.F1是ATP合成酶/ATP 酶的活性中心,它可以催化ATP的合成和分解;F0 作为质子通道,参与光合磷酸化和氧化磷酸化中能 GA11GG)C(CACCAGCAACATCC(XI'(1cCCGACAGGTGCGGAG11],cA GA1-C;G)C(CACCAGCAACATCCGTGCTGTCCCGACAGGTGCGGAG11],cA GA1-C)C(CACCAGCAACATCC(rGCTGTCCCGACAGGTGCGGAG11],cA GKACA1?1GTGGTCAGGCCC-I1]_rCGAAGC汀AAGGOCCCCTG,I?CAG GCACATC1'GTGGTCAGGCCCTn[vr(AAGCTrGTAAG00CCCCTGTOCAG GCACATrGTGGTCAGGCCCTn广rCGAAGCTrGTAAGGCCCC(G=l[:GG G1-CTACGGCA1-cGAAGGCCGCTA1?AACC(3CCTGTACTC1,(G0GTC G,唧AcGGCATCGAAGGC?GcTATGeCCGC0cTGTACTCTGr(GTC G1?TAOGGCA1?GAAGGCCGCTA1?AACCGCC(T(汀ACTCTGC1XTC TAA(XA(AAAG(ImACcAGG_1AAAAGGAG1vrGCrGCGAGTGGGGC TAAGCA(;AAAAGGC似AOCAGG1GGAAAAGGAG1vrGCTGCGAG1?GC TAAGCA(;AAAA(×)CT×ACCAGG1-(AAAAGGAG,I],(:1GCGAG1-( AACr(nAAoGAOCCAAGGTGTC(二CTrlGCTTGAAT0aAoTT AACTC1TGAAGGACCeCAAGG1?,(]TI'GCTG1vrCTGAA1??TACATT AACTCTTGAAGGACCCCAAGGTG1?)()(rI?CTG11?TGAA1?)0CTACATT AAGCGCI【)CA1?AAAGrGAAAAGCCTGAAGGACATCACTACAAAGGAAAA AA(X3C1(CA1-CAAGrGAAAAGCCTGAAGGACATCACTACAAAGGAAA AAGCGC1?CAT? AAAGTGAAAAG0CrGAAGGACATCACTACAAAGGAAAA A11,lrCCGCTGACGGCCAACCTCATGAA1I]ACT1,(;CTGAAAA1-(;TC ATTCT(n3C(CTGACGGCCAA0CTCATGAA1TTACT1,(册GAAAA1-(;TC ArvrCTC?cGCTGACGGCCAACCTCATGAA1TTAC-I1'(;CTGAAAA1?;TC GCCTA(:AACACCCAGGGCGTCA1?研GOCTrIn0CACCATCATGAGT (研A(XX:AAI00CA(0GCGTCA1?TCTGCC11n.cACCAT?IA1-GAGT (×AGGCAACACCCAGGGCGTCA1_CrITGCCTTC?CACCATCArGAGT G1?ACCGTGGAGAAG1?CG1-(ACAGrGACCACAGCAT1_()(](厂rrAGA G1?,ACCGI'GGAGAAG1-(;CCG1?ACAGTGACCACAGCAT1-(?【rI]-rAGA G_1)CACCGTGGAGAAG1-(;CC(ACAGTGACCACAGCAT1?I(【rI]-rAGA 飞G,】e吼G弋G(G》Q飞G T(AAGCT(册C-(了rGAGTTAAAGACAGTGCTGAATAGC1]?CTGAGTA T(AAGCT(汀TCTC?TGAGTTAAAGACA(TGCTGAATAGC11?CTGAGTA AAGGCCAGATACTGAACCTAGAGGTCAAGACTGAO0CATCAATClA1-( CKGGc》'GCcC.QGt AAGGCCAGATACTGAACCTAGAGGTCAAGACTGACCCATCAATCA1-(m KGmG弋呱KGGGC弋GCtCG KIGKG弋c)KGG'GCGeG G陬G弋KnG'GCC(|G (AGA1vrCAGAAGCTCAGCAAGGCCA1GGA1?,(×了I?TGAGAGACTG CAAGA1vrCAGAAGCTCAGCAA(ATGCG(A1?,(TC1?(;AGACTG CAAGA11?A(;AAGCrCAG(:AAGGCCA1(;CGGGA1【,(XTC1-GAGAGACTG TCACCTG1?(AGCGC11,GTCT11_I3GAGCACAATAAAArGCT1,(X了rGAAC TCA0C1r(汀GTGAGCGCTTGTCT11AGCACAATAAAArGC1v】_()(了rGAAC T(AC(T(rI:GAGCCIv1_GTC,IvI]A(CACAATAAAATGCT1,(X了rGAAC 图4改造成功的OSCP基因(s)与克隆1(C1)和克隆2(C2)序列比较 'L1211111111111111111111111111111l11ll1lIllCC55加m加加加加如?如???如印?印=合:合 山西医科大学(JShanxiMedUniv)2006年2月,37(2 量的转化.OsCP作为联系FD和F1的桥梁,在Fo 亚基处多以二聚体形式存在,并突出延伸进F1亚 基10nm[,从而发挥其在生物体能量转化中的重 要作用.寡霉素可与OsCP特异结合,抑制质子流 通过,使ATP的生成受到阻抑_8J. 1996年,Ramirez等分离,纯化雌性大鼠脑神经 细胞膜组分,使其通过填充有雌二醇的亲和层析 柱.然后将吸附于亲和柱上的物质洗脱,进行SDS- PAGE.其中只有突触膜组分的洗脱液经过SDS— PAGE后,在相对分子质量为23000处发现一特异 条带,经蛋白测序分析确定此物质为OSCPE1J,表明 雌性大鼠神经突触膜上存在有OSCP,并与雌二醇 有高亲合力.随后的实验进一步证明该蛋白很可 能是一种雌激素膜表面受体2.另有报道称,线粒 体蛋白ATP合成酶的活性可被雌激素快速抑制,很 可能是雌激素通过与OsCP结合,调节质子流的跨 膜运动,从而调节细胞能量代谢_8_l...最近研究表 明,OSCP的羧基端可以介导生物素化的细胞外信 号[11].由此可见,在某些情形下,雌激素发挥其功 能与OSCP有着密切关系,故深入研究OSCP的结 构和功能就有特别的意义. 本实验通过基因工程技术成功地将发生有义 突变的两个OSCP基因克隆进行改造并重组,获得 了具有正确核苷酸序列的OSCP基因,为研究这一 可能的雌激素膜受体创造了条件. 参考文献: [1]ZhengJ,RamirezVD.Membranereceptorforestrogen,pro— gestemne,andtestosteroneintheratbrain~fant~yorreality [J].CellandMolNeurobiol,1996,16(2):175—198. 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