怎么做基因芯片实验

怎么做基因芯片实验 、基因芯片技术 1基因芯片的概念 基因芯片，亦指DNA微阵列，是将大量DNA片段有规则地固定在某种介质上，从而检测特定基因达地一项技术。这项技术的基本原理是分子生物学中常用的杂交方法的扩展，其基本做法是将要检测的样品加以标记，然后与做成的阵块进行充分杂交，再加以洗脱后，用图像显示出结果。这里，在阵块中排列的DNA片段应是已知的序列。根据这种概念，我们可以看出，在这项技术中，有如下三点是非常关键的。 其一，要有大量已知序列和基因片段。随着人类基固组计划的实施，我们可以得到 大量基因序列信息，可以将一个文库的所有cDNA序列测到并加以记录，从而可以将一个文库排列成一个DNA阵列。因此，从理论上讲，可以做成从微生物到人类各组织器官的文库阵列。其二，从工艺的角度讲，要求能够将不同的DNA片段以很高的密度"点印"在普通载载玻片大小的介质上，从而使得在很小的面积上可以排列成千上万个基因而不致于相互混杂，这个过程要求相当高水干的工艺技术。其三，要有-种很好的检测手段。目前看来，用不同的荧光标记核酸来进行检测是一种比较简单，而且安全可靠的方法。同时，不同的荧光可以使得我们同时检测几种样品。这样，对于差异显示这类实验来说，就显得尤为简便。 基因芯片一股可分为两处，一种为"点印"阵列，一种为直接合成阵列。"点印" 阵列是将较大的片段(大于100bp)物理地固定在介质上，而直接合成阵列则是直接在介质上合成较短的片段。一般而言，DNA样本都是收集在96孔或384孔板上，这些样本可以是PCR产物，也可以是从质粒上直接得到的片段等。然后用机械手将DNA通过特制的加样头进行点样。点样完成后，对介质进行处理以使DNA能够十分稳定地附着在介质上，同时还要使介质尽量减少结合非特异性的探针。 2基因芯片的操作过程 基因芯片制作从准备探针(即扩增DNA片段)开始，经过芯片加工、DNA阵列点印、芯片后处理及芯片质量检测等过程，其应用包括RNA制备、标记、杂交及成像分析。因此.基因芯片的应用包括了制作工艺过程和基因表达分析过程。 2.1准备DNA 作为基因分析，DNA片段是最基本的材料，也是基因芯片制作的关键。对于不同的阵列，可以选择不同的目的BNA。 2.1.1目的DNA的选择 对于大规模地研究基因表达问题，需要分析每一个基因的表 达。因此，选择的目的 DNA必须能够代表要研究的各个基因。对于整个基因组序列全部已知的生物，最直接的方法是用PCR扩增基因组中每个已知的或预测的开放阅读框架(open reading frame)，亦可以选择自己感兴趣的部分序列。 对于没有测序，或只有部分测序的基因组，或者对于那些有大量内含子的基因组， 上述方法就不现实。在这种情况下，我们首先考虑采用表达序列标记(EST)。可以将单个EST的cDNA克隆用作阵列DNA来源。对于还没有基因组测序计划或序列还未知的生物，可以利用DNA文库作为DNA来源。当然这种文库最好是经过归整化处理，以减少不必要的冗余。 用作阵列的DNA可以呈双链的，亦可以是单链的。但是其长度最好是小于开放阅读框架，或小于1 000bp的cDNA。这对于很多具有同源性的基因尤为重要。当基团之间具有很高同源性时，最好选择基因之间有差异的部分，这样便可以提高基因之间的分辨度。所以，在考虑每个基因代表性的同时，应充分考虑所研究问题的具体情况。 2.1.2PCR扩增 一般而言，100μl PCR反应体系得到的产物足以点印1000个基因芯 片。PCR通常是在96孔PCR仪上进行，实际扩增的反应条件要根据所用的模板从引物来确定。但要尽量减少PGR反应体系中的组分，尽量只用模板、引物、核苷酸、镁离子、标准缓冲液和酶。不要用甘油或明胶，它们往往会粘附在阵列块上而影响以后的点样工作。 2.1.3点样前DNA准备 点样以前，要将PCR产物清洗纯化干净，并且对DNA进行一些处理，一般用异丙醇沉淀PCR产物，以除去酶、离子及核苷酸等。沉淀后用70%乙醇洗1次，再用95%乙醇洗1次，待完全干燥后，将所沉淀DNA重溶在3XSSC中，其浓度掌握在100ng/μl 左右。由于处理的样本量很大，一般直接在96孔板上操作，可选用能够配置96孔板的离心机(如Savant Speed Vac Plus SC210A)。当把DNA溶于10~15μl 3×SSC(pH7.0)中后，最好置于4至少12h。然后，将DNA溶液封存在 -20~4。 当然，纯化DNA的方法多种多样，使用者可以根据自己的情况选用。在此应当强调的是，在最后得到的DNA样本中，应尽量减少其它污染，尽量除去盐类、去污剂、甘油、明胶以及树脂颗粒等。具体实践中，应当用小规模DNA样品进行点样测试.待确定效果后，再大规模制作。 2.2准备载物片 载物片是要将DNA点上去的支撑物，有不同的材料，通常用载玻片 。DNA并不能直接固定在玻璃表面，固此需要对玻璃表面进行处理。有很多方法可以处理玻璃表面，但是我们认为用多聚-L-赖氨酸比较简单可靠. 首先充分清洗载玻片，用25XNaOH溶液200ml加300mi 95%乙醇配成500ml碱性清洗液，将载玻片彻底浸泡在清洗液中2h，再用清水冲洗5遍井将载玻片泡在水中。接下来就是用多聚-L-赖氨酸溶液浸泡，从而使多聚赖氨酸均匀涂包在玻璃表面，形成一种多聚-L-赖氨酸涂面。具体做法是配成350mI多聚-L-赖氨酸浸泡液，将洗净的载玻片直接浸泡，浸泡期间保持慢速摇晃，Ih后取出并在水中浸泡清洗，最后干燥。一般将涂好的载玻片用锡箔纸包好，室温放置1个月，进行熟化，以使表面保持充分的疏水性。这对于以后点DNA样品是十分重要的。 2.3基因芯片的点印 点印DNA用机械手。将一组处理好的载玻片固定在一个平台上 ，将DNA样品(溶在3XSSC中)装在96孔或384孔的平板中，并将平板放在支架上。机械手将一组特制的点样吸头插入对应的DNA平板孔中，让每个吸头充上约1μl的DNA溶液。然后机械手轻轻地将吸头移向载玻片，将DNA样品完全一致地点到多聚-L-赖氨酸包被的载玻片面上.每个载玻片上大约点 0.5μl的DNA溶液，故理论上一次可以点印2 000个载玻片。待这一组DNA样品点印完成，机械手清洗点样吸头，开始第二批样品的点印。点样的质量要表现在点与点的距离，这取决于点样吸头的尖锐度与多聚-L-赖氨酸表面的疏水性。-般情况下两个点中央间距为100μm，点间空100μm。如果点间空为200μm，就可以把整个酵母基因组点印在1.8cm2大的面积上;如果点间空为100μm，可以把人类75 000个基因全部点在一张2.54cmX7.62cm的普通载玻片上。目前，每个点样循环持续大约为2rmin，包括清洗、干燥、加样和点样，一般点110张片子。如果增加点样吸头数，可以缩短点样时间。如将点样吸头增加到32个，则完成110个载玻片的所有人类基因点样工作约需2天时间。 2.4基因芯片的后加工处理 当一个基因芯片点成之后，需要对其进行进一步的加工 处理，以便能够用于以后的杂交实验。通常进行四步处理，即重新水合化及快速干燥、UV-交联、封闭及变性。 2.4.1重新水合化 通常点样过程并不能保证DNA在点中均匀一致。为使DNA在所有点中都分布均匀.需要对之进行重新水和化并进行快速干燥。这一过程要求技术条件很高。当重新水合化不充分时，大小不规则的点会影响以后的杂交与分析结果。但当过度水合化时，点与点之间可能会产生融合。因此，要确定一个十分准确的水合条件，一般用蒸汽熏润，其时间、温度需要摸索。 2.4.2UV交联 当重新水合化并立即干燥后，将载玻片放在UV射线下照射，这样可以使DNA交联在载玻片上。这一过程对于DNA浓度低时尤为重要，可以增加可杂交DNA吸附到每一个点上的量.在UV交联时，将载玻片有DNA点的面朝上，照射总能量强度为60mJ即可。 2.4.3封闭 封闭的主要目的是将游离赖氨酸基团加以修饰，以避免这些基团与以后 被标记的DNA结合。如果不对载玻片封闭，那么，将来杂交后就会产生无法分清的非特异杂交斑.而且还会产生过多的背景。一般的封闭办法是用琥珀酸酐进行酰基化，将赖氨酸的氨基转化成酰氨基，使之形成负电荷表面，从而减小与DNA的非特异结合.这一过程一般在15min内结束。 2.4.4变性处理 当封闭过程完成后，要立即进行变性处理，即将整个载玻片立即浸 入沸腾但不冒泡的水中，上下翻3~5次，停留2min，然后立即转到95%的乙醇中，浸泡一会儿后离心干燥，这样便完成了对芯片上DNA的变性处理。此时，整个基因芯片块也就做好了。 3基因芯片的使用 基因芯片块制作好后，关键就是用它来完成特殊的实验。其基木原理就是将研究的 细胞或组织RNA加以标记，与基因芯片块上所点印的基因片段进行杂交，从而探测特定基因的表达。 3.1准备探针 与传统的Northen Blot正好相反，这里我们将所以表达的RNA作为探 针来源。所以探针的准备工作要包括RNA的提取和标记。 3.1.1RNA的提取 提取RNA的方法很多。现在市场上有很多提取RNA的试剂盒，用起来十分方便。不管用什么方法，提取RNA的质量和产量是问题的关键。对于研究基因表达的实验来说，最好应用纯化mRNA作为反转录模板。如果用荧光cDNA探针，需要至少1μg的mRNA或100μg总RNA。 3.1.2标记 从RNA制作标记探针，其方法有好几种，最多情况是在Oligo-dT引物进 行的逆转录反应中直接掺入荧光素标记的核苷酸。有时候也可以用随机引物cDNA合成法标记。一般基因芯片中片段来自基因3''端时较适宜用Oligo-dT引物cDNA探针，而基因芯片中片段来自全长cDNA序列或预期开放阅读框架时用两种方法均可。亦可在第一链cDNA合成后再行标记。关于两种标记方法可参考有关手册。 3.1.3荧光染料 目前市场上可以买到许多荧光染料标记的脱氧核苷酸，特别是用C y3和Cy5标记的dUTP。这两种染料在光谱上分得很开，而且对于许多酶都有较高而特异的掺合活性。当干燥后，荧光强度很亮，可以放大成像效果。除此之外，R110(Pekin Elmer)，TAMRA(Pekin Elmer)和Spectrum Orange(Vysis)的效果也比较好。 3.2杂交反应 与昔通的Northern Blot相比，基因芯片杂交反应过程显得十分简便 。即将标记好的探针样品经高速离心去除一切沉淀物后只用移液器滴在基因芯片的中央即可。在其过程中应尽量避免产生气泡及带进沉淀杂质。滴好后在载玻片DNA阵列部位上方放一盖玻片，然后在周围滴上3滴5μl的3XSSC溶液以保持杂交池中的湿度。最后将载玻片用塑料膜包起来放到65水溶中杂交4~1 6h。 3.3杂交后处理 和Northern Blot一佯，杂交完成后要进行清洗，以除去剩余的探 针。清洗的方法是用2XSSC、0.1%SDS溶液浸泡，然后用1×SSC浸泡，最后再用0.2XSSC清洗。但是，应当注意，整个清洗过程都在室温下进行。清洗的时间也要严格把握。 3.4试验 由于基因芯片可以容纳很多信息，所以在使用时要充分考虑试验设计，要合理设计各种对照，以便在分析结果时能得出正确的结论。 3.4.1异种RNA平行实验 为了检测探针标记等过程，可以利用异种生物的RNA进行平行实验。对于人类基因阵列，可以用酵母的基因进行平行实验。选择异种基因时应避免与所研究基因有同源性，从而不致于产生杂交，但要求在DNA性质上(如GC含量、长度、poly-A尾端等)基本相似。可以选择上百个这样的异种基因，点印在所研究的阵列上。将这些基因除了点印在阵列块上以外，还要将它们克隆到带有噬菌体RNA聚合酶结合位点及人工poly-A尾端的质粒上，从而扩增大量的RNA。利用这种RNA作对照，分别标记Cy3和Cy5，可以检测正式实验中Cy3与Cy5的比值，亦可检测杂交的反应程度，同时还可作为输入输出 比率的校正以及分析的灵敏度。 3.4.2RNA质量检测对照 一定核酸序列的DNA片段与相应基因结合的量，受其共同区域大小的影响。因此，对于一定的cDNA进行杂交。时的信号强度，就会因RNA的质量而发生变化。这就会使基因芯片杂交的结果产生混淆。例如，当RNA质量不同时，由之合成的相同量的cDNA在比较时就会产生明显差异，在分析时就不能得到1:1的比率。这个问题可通用选择合适的序列片段来解决。例如，用Oligo- dT引物cDNA探针时。如将序列片段限定在基因的3'' 端，就可防止产生偏差。一般可以按照下列方法来检测RNA的质量。将-个整个基因按100-200bp分段，每一段都点印在基因芯片块上，然后杂交不同样品RNA后检测该基因的信号。如果RNA在某一区段降解时，就不能检测到该区段的信号，由此可以断定所用RNA的质量。亦可用以上平行实验中的RNA在每一步来检测该基因各个片段的表达，从而确定各个步骤中RNA是否降解。这里最关键的几步是收获细胞、mRNA分离提纯、探针标记和杂交。 3.4.3封闭对照 和Northern Blot一样，许多杂交反应需要加入未标记的DNA来封闭由于探针与目标片段相似性而引起的非特异性结合.这对于重复性的区段更为重要。可以设一个封闭对照来检测这种非特异结合被封闭的程度。例如，在人的基因芯片中，可以用cot-1来作为封闭对照。如果cot-1点几乎无信号.就说明封闭完全。另外，还可以用oligo-dA，oligo-dT，质粒DNA或人类基因组DNA作为封闭对照。事实上，封闭对照就是一种阴性对照。 3.4.4归整化对照 在样本多的情况下标记探针时，很难十分精确地让所加RNA的量 相等。因此，就有必要设一对照，希望其杂交信号在不同样本杂交后是相同的。这相当于我们在作Northern Blot时采用Actin或GAPDH作对照一样。通常在酵母基因表达实验中，采用总酵母基因组DNA作归整化对照。对人类基因来说.由于只有少部分基因表达，故用总基因组DNA时产生的信号会十分弱。因此，有人还是用Actin或GAPDH作对照。 4成像分析 杂交以后，就要对基因芯片进行荧光成像分析。一般用激光共聚焦显微镜作为扫描 器.扫描器有激光光源，可以产生激发不同荧光染料的光(对Cy3为绿光，波长为540nm;对Cy5为红光，波长为650nm)。当然亦可以用其它设备，如CCD照像机，但效果不如激光共聚焦好。 在分析时，我们的目的是测量出阵列中每个点的相对荧光强度，其方法是将图像分 成对应于每个点的小块，然后测定每个小块中的平均荧光强度。两个样本中每个单元的相对量就是平均荧光强度比率。具体分析时采用计算机处理。应当考虑消除背景，校正相对荧光强度比率等。同时应当考虑上述的各种对照处理。 5基因芯片中的常见问题及解决方法 虽然基因芯片具有很多优越性，但在实验中仍然会遇到很多问题。在应用时一定要 注意这些问题的发生。实践中，最好的办法是设立许多对照，以便及时发现井改正问题.同时，不管在什么情况下，在设计实验时都要计划在实验的每一步都进行重复，而不是简单地重复整个过程。因此，最好多准备些mRNA样品和基因芯片，以备重复使用。 基因芯片制作过程中最难解决的问题是只有在最后完成后才能发现问题。因此，应 采用小规模实验，确保每步正确后再大规模生产。这里，我们列出几种常见的问题: 1)点印点的形态不规则 一个常见的问题是点上带有拖尾。这一现象可能是在用琥 珀酰封闭时浸泡过程不迅速，从而使DNA在清洗过程中结合到载玻片的其它部分。 另一个问题是在DNA点样处经常出现小空洞。这是在点印时点样吸头留下的小圈不均匀，从而使点的中央留下的DNA量相对较少。如果在重水合化时，延长时间，可以减少这个问题。 2)强背景信号 在应用基因芯片时，经常会出现整个荧光背景很强导致图像模糊不 清的观象。这种情况有时是在整个区域，有时只在局部产生。如果整个片子都有强的荧光背景，则在杂交前系统地选择一下片子即可。如果只在基因芯片内产生强的荧光背景，则说明是探针的问题，可以增加杂交后清洗的次数。一般对赖氨酸氨基封闭不充分和探针中的沉淀物是引起背景的主要原因。这种情况会经常出现"反探针"现象，即高强度的荧光信号在没有DNA的地方出现。有时候，背景会出现一边亮，一边暗的情况，这说明片子放在溶液(特别是封闭液)中的位置不好。对于边缘有亮荧光背景的情况，可通过加大3×SSC的体积来加以消除。 3)局部信号偏弱 在高亮背景问题出现的同时往往是特定信号减弱。这可能是探针 不均匀分布所致。杂交时液体中的气泡、载玻片和盖玻片不平整都会产生局部信号偏弱的问题。 基因芯片是在基因组水平上发现和研究基因功能的强有力的工具。长期以来，生物 学家仅能够观察极少数基因在差异表达的情况。有了基因芯片技术后，生物学家就可以同时观察成千种基因的变化。对于整个基因组已知的生物，基因芯片技术就可以同时立即研究所有基因表达与调控的问题。对于人类基因研究来说，应用基因芯片技术的唯一限制是已知基因的数目问题。随着人类基因组计划的完成，这一限制将不再成为问题，可以毫不夸张地说，现在我们可以很容易地设计实验来系统地探讨生物学中大量前人未涉及的领域。用本文所介绍的技术，在一个实验室，利用仅1年时间，人们就可测量到成千上万个不同基因表达的特性。这相当于过去整个生物学对基因认识的总和还要多。 当然，一项技术并不是完美元缺的。基因芯片技术除了具体上述提到的技术问题外 。其成本高，使用还不太灵活简便也是其主要执点。但我们相信，全世界相关领域科学家们的共同努力，这一技术会在实用性上加以提高，制作成本会逐渐降低.从而使一般普通生物学实验室都能实现这项先进技术的应用。 另外，需要提及的是，随着这一技术的应用，关于基因表达调控的信息就会剧增。 因此，对于生物学家来说，如何组织、处理.解释这些信息，就变得越来越重要，或许，就象人类基因组计划一样，需要生物学与数学家及计算机专家共同努力，从而开创生物学的新未来