体内外研究羟基胆固醇硫酸基转移酶(SULT2B1b)及其硫化产物对肝脏增生的影响及机制（可编辑）

体内外研究羟基胆固醇硫酸基转移酶(SULT2B1b)及其硫化产物对肝脏增生的影响及机制（可编辑） 复旦大学 博士学位论文 体内外研究羟基胆固醇硫酸基转移酶(SULT2B1b及其硫化产物 对肝脏增生的影响及机制 姓名:张欣 申请学位级别:博士 专业:病理学与病理生理学 指导教师:张志刚 2012-04 年复旦大学博士研究生 体内外研究羟基胆固醇硫酸基转移酶及其硫 化产物在肝脏增生中的功能及机制 中文摘要 前言 胞浆硫酸基转移酶能够催化胆固醇及羟基胆固醇的一羟基硫酸 化, 其催化.羟化胆固醇硫酸化反应的主要产物为硫酸一羟化胆固醇 。研究发现能够抑制羟基胆固醇对肝受体的激活, 并且其硫酸化产物可以通过抑制/信号转导通路降低细胞内脂质 水平。而 及其硫化产物 信号途径的激活对细胞增殖起负调节作用。因此 可能对肝脏增生起重要作用。本实验中,我们在小鼠正常肝脏、原代大鼠肝脏细胞 以及小鼠肝脏部分切除术模型中研究对肝脏增生的作用及机 制,并在小鼠正常肝脏中检测的硫化产物对肝脏增生的影响及相关 棚.佑 。 第一部分体内外研究对肝脏增生的影响 第一节对小鼠肝脏增生以及原代大鼠肝细胞生长的影响及相关 机制 目的:探索对小鼠肝脏以及增生的影响及机制。 方法:将含有 基因的腺病毒感染/小鼠及后,运用免 疫组织化学染色法检测肝脏增生状态;应用免疫荧光双染法定位肝脏内与 的达;采用干扰技术反面验证对肝细胞生长的影响;通过实 时定量和免疫印迹的方法检测基因表达水、乎。 结果:体内实验表明小鼠肝脏组织中的阳性细胞率随表达水平的升 高而明显增加,并存在剂量和时间依赖性;肝脏内几乎所有存在表达的细胞核均 伴随在细胞质的高表达,而没有表达的细胞内也检测不到 的表达。在相对高表达的内,采用干扰技术抑制基因年复旦大学 博士研究生毕业论文 的表达,引起细胞周期调节基因,,与 的表达明显降低。此外, 人工合成激动剂可有效阻断体内外所诱导的表达升高。 结论:能够通过抑制信号转导通路的活性促进体内外肝细胞增生。 第二节在部分肝切除术后的小鼠模型中研究对肝脏再生的影响及 机制 目的:研究对肝脏再生的影响及机制。 方法:在小鼠体内建立肝脏再生模型,并通过尾静脉注射含有 基因的腺病毒或对照病毒;病毒感染天后,应用免疫组织化学的方法肝 再生过程中的阳性细胞率;采用技术检测肝脏内羟基胆固醇的变化;运用 实时定量和免疫印迹法检测基因表达水平。 结果:过表达的小鼠肝脏恢复较快,约于术后三天恢复到肝脏原始大小的 %,而对照组需要将近天达到同样水平。过表达增加了肝脏再生过程中的 阳性细胞率以及增生相关基因的表达水平;降低了肝脏内的羟基胆固醇含量以及 信号转导通路下游基因.和的表达水平。 结论:能够通过抑制羟基胆固醇/信号转导通路促进肝脏损伤后的再 生。 第二部分在小鼠体内研究羟基胆固醇硫化物对肝脏增生的影响及其相关 机制 目的:探索的硫化产物对小鼠体内肝脏增生的影响及机制 方法:向/小鼠尾静脉直接注射.硫酸..羟化胆固醇化合物, 或向感染了腺病毒.两天后的/小鼠腹腔内注射,建立高 浓度外源性或内源性的小鼠模型;应用【】标记并经尾静脉注射小鼠体 内,追踪在各组织器官中的分布及其药代动力学;采用实时定量,细胞周 期芯片以及免疫印迹法检测相关基因的表达水平。以为增生标记,应用免疫 组织化学技术分析肝脏中的阳性细胞数。 结果:外源性给药后在小鼠体内广泛分布于各组织器官,并在注射后小 时左右减至初始剂量的一半;的增加上调了肝脏内增生相关基因,, 年复旦大学博士研究生毕业论文 , ,,的表达,却下调了细胞周期停滞基因以及凋亡诱 导基因的表达;无论外源性给药还是内源性合成,的应用均有效增加了 阳性细胞率,降低了信号转导通路下游基因如和.的表达; 最后,的人工合成激动剂的应用有效阻止了诱导的表达升 高。 结论: 能够促进肝脏增生。羟基胆固醇硫酸化通过对信号转导通路的 抑制为肝脏增生的研究提供了新的靶点。 综上所述,羟基类固醇硫酸基转移酶通过硫酸化羟基胆固醇,增加硫 化羟基胆固醇的产生,抑制信号转导通路活性,从而促进肝脏增生以及 肝脏损伤后的再生恢复。 关键词:羟基胆固醇硫酸基转移酶;.羟化胆固醇;一硫酸 ..羟化胆固醇;肝脏增生;肝受体;羟基胆固醇硫酸化;肝 脏部分切除术;增殖细胞核抗原。‘’ ..懈.‘ 删 . ?,。 ., , ,。 。.。 . 眦。 。 哪 。 ?。。觑加锄咖 : 仃 。 。。 仰。 。。啪:。。 。 / ,。 : / . .. . :。 ., . ? .,刀,,. : / . : . :/ ? 。 . .。 ? . :/.. % , , . ,. . : 。。 . :。 。 。。 。 。/ . :/ , , . 。。 。。。。。【】。 。, , . 年复旦大学博士研究生毕业论文 :, . ,,, , , . ; 。 ,. . . : .,? . : ‘ ;;. 一 ; ; ; ;; . 年复旦大学博士研究生毕业论文 英文缩写及中文对照 中文译名 英文缩写 英文全称 一 一酮基胆固醇 . 一羟基胆固醇 . .一 ,一羟基胆固醇 .羟基胆固醇 【 【.羟基胆固醇一羟基胆固醇 一羟基胆固醇 一 ...一硫酸羟基胆固醇 一羟基胆固醇 一每克组织的注射比率 %/ 乙酰辅酶羧化酶 . . 含一基因的腺病毒载体 . 含基因的腺病毒载体 碱性磷酸酶 谷丙转氨酶 谷草转氨酶 细胞分裂周期蛋白. 细胞周期蛋白依赖性激酶互补胆固醇.羟化 酶 , , 胆固醇.羟化酶 脂肪酸合酶 转录因子的一个亚型 高效液相色谱法 腹腔内的 .. .. 静脉内的 肝受体 问质金属蛋白酶 感染复数 信使 增殖细胞核抗原 肝脏部分切除术原代大鼠肝细胞. 逆转 录 ? ? 实时定量甾醇调控元件结合蛋白 仃 硫酸基转移酶羟基类固醇硫酸基转移酶 干扰 年复旦大学博士研究生毕业论文 第一部分体内外研究对肝脏增生的影响 第一节对小鼠肝脏增生以及原代大鼠肝细胞生长的影响及相关 机制 前言 细胞质磺基转移酶能够硫化激素、神经递质、生物胺及治疗性药物等小 分子物质【。。人类基因超家族由至少五个家族组成,其中家族的主要作用 是引起神经类固醇以及固醇的硫酸化【。家族包括两个亚科,和 ,而亚科又分为两个亚型,和 。 表达于人体多种组织,如胎盘、前列腺、乳房、皮肤、肺脏、小肠、肝脏以及血小板? ‘ ,是胆固醇及羟基胆固醇的磺基转移酶 ,能够有效的催化.羟基固醇硫酸化。而 羟基胆固醇,包括.羟基胆固醇及.羟基胆固醇等已被确认为激活肝受体 的内源性配体 ’。因此,介导的羟基胆固醇硫酸化可能在调节 信号转导途径中发挥重要作用。 核受体是调节脂质代谢的重要受体【?。它可以通过激活转录因子甾醇调控元 件结合蛋白?,活化脂肪生成基因,继而提高脂肪酸的合成【,;也可以直 接激活某些脂肪生成基因,包括乙酰辅酶羧化酶.和脂肪酸合成酶等 拉,。据报道,的过表达能够抑制受体对羟基胆固醇的应答,从而抑制 .、.及等下游目的基因的表达【,”。在培养的原代人类肝细胞 及.来源的巨噬细胞中加入羟基胆固醇硫酸盐介导的羟基胆固醇硫酸 化产物,如.硫酸一.羟基胆固醇,能够抑制脂质代谢过程中关键酶的表 达,从而降低胆固醇及中性脂肪酸水平口’。因此,可通过来影响脂质 代谢。此外,研究还发现与多种细胞的增生调节密切相关。受体途径在多种 细胞和动物模型中起到抑制细胞生长的作用。的激活抑制癌细胞生长, 并且的激动剂在前列腺癌细胞中发挥雄激素受体拮抗剂的作用。但 这种增生调节是否有【。参与还不清楚。因此我们推测可能通过 抑制信号转导途径提高细胞增生能力。在本实验中,我们通过小鼠肝脏及体外培养 的大鼠肝细胞实验研究,探索对肝脏增生的影响,期望阐明是否 能够通过抑制信号转导途径提高肝脏增生能力。 年复旦大学博士研究生毕业论文 通过研究,我们首次发现,基因的过表达能够促进肝脏细胞生长; 敲除 原代大鼠肝细胞中的表达则显著抑制了细胞周期调节基因的表 达, 它们包括,细胞周期蛋白依赖性激酶以及细胞周期蛋白 。同时,在原代大鼠肝细胞及小鼠肝脏中信号转导途径激动剂 的应用,有效的抑制了所诱导的增生,提示我们对肝脏 增生的促进作用与信号转导途径密切相关。这些研究结果为揭示 在促进 肝脏增生中的新功能提供了重要的实验依据。 材料和方法 一、 主要材料和试剂 一、实验动物: 试验室提供。 雌性/小鼠,?周大小,体重.,由美国 二、动物及细胞处理所需试剂: 、重组腺病毒 及? , 、 , , 、 ,。, ? 、血清分离管 三、免疫组织化学及细胞核复染相关试剂 , 、%中性福尔马林缓冲液?, 、二甲苯 ,, 、酒精 ,, 、甲醇 ,, , 、%过氧化氢甲醇溶液?, 、柠檬酸修复液原液:.保存于?。 液:柠檬酸.克溶解于毫升三蒸水中 液:柠檬酸三钠.克溶解于毫升三蒸水中 柠檬酸修复液工作液: 液:毫升 液:毫升 三蒸水:毫升 共毫升,充分混匀待用。 、鼠抗人一抗,,, 、洗液原液:。保存于?。 液。 : .克与浓盐酸 毫升溶解于毫升三蒸水 中 液.%:氯化钠.克溶解于毫升三蒸水中 、洗液工作液: 液:毫升 液:毫升 三蒸水:毫升 共毫升,充分混匀待用 、过氧化物酶标记试剂盒 ,, 、过氧化物酶显色试剂盒 ,. 、苏木精., , 年复旦大学博士研究生毕业论文 四、免疫荧光双染相关试剂 、兔抗人 一抗 ,,, 、鼠抗人一抗,,, 、羊抗兔红色荧光二抗,, 、羊抗鼠绿色荧光二抗,, 、试剂,, 、水性封片剂: .克 /的调其至.约加.毫升 溶于毫升三蒸水中,以 。吸取毫升此液体,与毫升%甘油混匀即可。 五、原代大鼠肝细胞培养所需试剂: 、原代大鼠肝细胞由弗吉尼亚联邦大学微生物学与免疫学实验室 提供。 、细胞培养液: , 干粉 ,一瓶 溶于毫升双蒸水中,用盐酸调值至.。过滤除菌,分装,近期用的 保存。 、细胞培养辅助添加试剂: 甲状腺素 肛 。 地塞米松 / 青霉素 于细胞培养使用前添加并混匀现配现用。 、溶液 年复旦大学博士研究生毕业论文 .克 .克 ’ .克 .克 溶于毫升双蒸水中,调值至.~.,高压高温灭菌,分装,保存于。。 六、细胞内干扰相关试剂 、针对基因的干扰序列.与阴性对照干扰序列. 购自 公司.。 、 转染试剂购自 公司,。 、细胞活力检测相关试剂细胞增生试剂盒 购自公司。 。 八、免疫印迹相关试剂 、溶液 .见上 、细胞裂解液 ?。 混合均匀后,先调整至.,再入 .,添加双蒸水至 , 最后加入 的。储存于?。 、蛋白酶抑制片 片蛋白酶抑制片溶解于双蒸水中配成储存液,用时按照:功稀释。 年复旦大学博士研究生毕业论文 、法蛋白质定量测定试剂盒 液./ 、溶液 . ..%/ 、. / ? . 碱 .克 约 浓盐酸 冷却至室温,调节值至。,加水定容至,高压蒸汽消毒,。保存。 、。 / ? . 碱 。克 约 浓盐酸 冷却至室温,调节值至.,加水定容至,高压蒸汽消毒,。保存。 、 样缓冲液 / ? 。 % 电泳级 %甘油 、%/溶液 、%/丙烯酰胺储存液 克 丙烯酰胺 年复旦大学博士研究生毕业论文 亚甲双丙烯酰胺 .克 加水至,滤纸过滤,棕色瓶中。保存。 、%/过硫酸铵溶液 、四甲基乙二胺 、×一甘氨酸电泳液 碱 。克 甘氨酸 克 %溶液 加水定容至。 、转膜缓冲液 碱 .克 甘氨酸 .克 甲醇 加水定容至。 、凝胶快速脱色液 甲醇 乙酸 加水定容至。 、膜洗脱液 . / “? . . 溶液 年复旦大学博士研究生毕业论文 一巯基乙醇. 加水至。 、封闭液:%/脱脂奶粉,.%./溶于。 、膜,, 、相关抗体: 购于公司;、 一抗:、/、 、 购 公司。 二抗: ? 购于 、化学发光试剂盒 、蛋白质分子量 九、?及实时定量相关试剂、抽提试剂盒, 。 、弓物序列参见表: 表:引物序列 . 不丁不 不丁丁不不 ?不。 了 不 年复旦大学博士研究生毕业论文了 不 丁 、试剂 . ,,,,,,/ ? /. 、焦碳酸二乙酯 水中加入。,剧烈振荡使其溶解,过夜。高压蒸汽处理以消除残留 的。 使用时应戴手套,并在通风橱中操作,因为是一种致癌 剂。 、试剂 酶 ,,, 年复旦大学博士研究生毕业论文 、电泳相关试剂 琼脂糖 乙二胺四乙酯 碱 溴乙啶 样缓冲液 、×溶液 克 硼酸 克 溶液 加水定容至,高温高压灭菌后保存。 二、主要仪器二氧化碳恒温培养箱超净工作台 . 的全套设备凝胶成像系统水平电泳槽 ? 分光光度计扩增仪 .士增仪 年复旦大学博士研究生毕业论文 倒置相差显微镜 精密电子天平脱色摇床 .. 漩涡振荡器 恒温磁力搅拌器 ? 一/? 倒置分光荧光显微镜及显微摄像系统测量仪 恒温水浴槽 ?离心机 / / .?冰箱 . ?深低温冰箱 . / 通风橱 ,? 三、实验方法 一小鼠的饲养及组织的提取 .周的雌性/小鼠,给予动物清洁级饲养。采用随机分配原则,将动 物分为 两组每组.只小鼠:对照组由尾静脉注射× /只的对照腺病毒. ,组由尾静脉注射同等剂量的编码基因的腺病毒 ?。为研究信号转导途径的作用,部分小鼠在病毒感染一小时后由 腹腔注射或,剂量为 /,每两天注射一次。病毒感染,,,, 天后,处死小鼠。处死前麻醉,眼球取血,置于血清分离管中,冰上静置分钟,待血液 凝固,??分钟,取上清即为血清,其送医学中心临床实验室检测肝毒 性相关指标及血脂含量,包括谷丙转氨酶、谷草转氨酶及碱性磷酸酶 ,其余一。保存备用。无菌操作提取小鼠肝脏,部分组织经福尔马林固定后用 年复旦大学博士研究生毕业论文 于免疫组织化学等形态学实验,其余组织冻存于.。,用于抽提和蛋白等,测定基 因表达水平。 二腺病毒感染后,免疫组织化学方法测定肝脏表达量 免疫组织化学过程详细步骤如下: 、切片脱蜡:由%中性福尔马林固定的小鼠肝脏标本,经包埋等处理后,切成石蜡切 片,于?烤箱过夜。次日,常规二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水,再用蒸馏水冲洗分 钟。 、去内源性过氧化物酶:切片置于%的过氧化氢甲醇溶液,?温箱孵育分钟,以消 除组织内源性过氧化物酶活性。之后蒸馏水冲洗切片次,. 的.洗 涤次。 、抗原修复:将切片置于.柠檬酸缓冲液,微波修复分钟,待修复液冷却分钟 后,再用洗涤次,每次。 、血清封闭:擦去组织周围,将切片置于湿盒内并滴加正常马血清:,? 孵育分钟。 、一抗结合:吸去切片上部分血清,滴加:鼠抗单克隆抗体,?孵育小时 后?冰箱过夜。 、二抗结合:次日,切片用洗涤次,每次分钟。滴加生物素化的马抗鼠抗体, ?孵育小时。 、试剂结合:洗涤切片次,每次分钟。滴加与液混合试剂,?孵育 显 小时。、显色:洗涤切片次,每次分钟。用 色,滴力呈色液,显色时间为~分钟显微镜下控制显色程度,蒸馏水冲 洗终止显色。 、苏木素复染:切片经蒸馏水洗,入苏木素染液复染细胞核。切片于?烤箱烤干,中 性树胶封片,光镜下观察。性细胞胞核为棕褐色,阴性细胞胞核为淡蓝色。 、数据处理:每个实验组包含至少只的小鼠肝脏切片,并在每个切片上随机选取个高 倍视野,分别计数阳性细胞及阴性细胞的个数。表达量以阳性细胞百 分比表示。 三腺病毒感染后,免疫荧光双染法定位肝脏组织中与的表达 年复旦大学博士研究生毕业论文 选取.病毒感染天后的小鼠肝脏作为实验样本,定位与 在肝脏内的表达。肝脏组织固定后,常规石蜡包埋,切片,。烤箱过 夜。次日,切片用二甲苯脱蜡,经各级乙醇至水洗,再用洗涤次,每次分钟。 经封闭后,滴加稀释好的抗体混合物,即鼠抗单克隆抗体:与兔抗 多克隆抗体:的混合物,湿盒内?孵育小时。洗涤次,每 次分钟,洗去残存抗体。滴加荧光素标记的二抗混合液,即羊抗兔红色荧光与羊抗 鼠绿色荧光二抗的混合液。洗涤次后,室温下轻度风干切片,滴加 缓冲甘油封 片。实验过程中,用替代一抗作为阴性对照。荧光显微镜下观察结果,整个操作过 处理。 程中避免强光。拍摄的照片用 四原代大鼠肝细胞的分离与培养 用和的胶原酶灌注法,分离大鼠. 肝细胞【】。分离肝 细胞的存活率检测用台盼蓝拒染法。每只大鼠约能分离出.~.×个肝细胞,成 活率在%以上。细胞培养于 基本液中,其内添加 的甲状腺素,. 的地塞米松和 /的青霉素。细胞置于%,。培箱中培养,待接种小 时后贴壁,弃培养液,加入新鲜培液。依需要在不同时间收集细胞,供后续实验。 五原代大鼠肝细胞的处理 、用编码的重组腺病毒.感染 将。×的肝脏实质细胞接种于涂有胶原蛋白的.培养皿,小时后更换为新 鲜培液,并加入感染复数为 /的.,每分钟轻摇一次, 小时后吸出含病毒的培液并加入新鲜培液继续培养~小时。含病 毒的培液及所有 粘有病毒的材料均需高压消毒处理。空腺病毒载体转染作为对照组。部分细胞在感染病毒 小时后,被继续给予小时的. 或 处理,以备后 续实验。 、.干扰原代大鼠肝细胞基因的表达 将.× 的肝脏实质细胞接种于涂有胶原蛋白的.培养皿,小时后更换为新 鲜培液。根据 转染试剂.转染步骤的要求,对细胞进行干扰。具体操 作如下:准备干净的离心管,向其中加入 无血清细胞培养液以及 浓度为 的,使终浓度为,轻轻混匀。再向其中加入 转染试剂,混匀后室 年复旦大学博士研究生毕业论文 温孵育~分钟。向每孔细胞中加入 混合物,轻轻混匀后,放入细胞培养箱中 继续培养~小时后检测转染效率及其他实验指标。 六病毒感染及干扰处理后原代大鼠肝细胞活力的检测 将原代大鼠肝细胞以×/孑的密度接种到孔板,加入 的细胞培养液,置 于%,?孵育,小时贴壁后,换液,并进行实验处理。在腺病毒感染或.干扰细胞,小时后,根据细胞增生试剂盒 提供的 方法检测细胞活力,具体步骤如下: 、向每孔细胞加入 的,一? ,. 溶液,继续培养小时,在此孵育期间,有活力的细胞会将转化为水溶性的 结晶。 、 每入 的 ,?培养箱孵育过夜,使结晶物充分溶 解。在酶联免疫检测仪 处测量各孔的吸光值。 、 同时设置调零孔,对照孔,每组设定复孔。 七免疫印迹法分析增生以及信号途径中相关基因蛋白水平的变化 免疫印迹过程详细步骤如下: 、蛋白样品的准备 细胞蛋白的准备: 把细胞培养皿放于一预冷至?的平面上如在碎冰上,用冰预冷的 漂洗细胞次,洗液弃之,尽可能甩干培养瓶内的残留的。 将加有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液预冷至?加入冰预冷的 单层细 胞中,然后置于碎冰上孵育分钟。 .的培养皿加,细胞裂解液溶解细 胞 用细胞刮刀把粘稠状的细胞裂解物集中于培养瓶的某一侧,用枪 头反复抽吸 几次后一起转移至预冷的管中。 于?以~转将样品离心分钟,将上清液移入另一管,弃去 沉淀物。 组织蛋白的准备: 年复旦大学博士研究生毕业论文 称量. 肝脏组织,放入玻璃匀浆器,添加冰预冷的后均浆组 织。 将肝脏组织匀浆转移到干净的离心管,从其中吸取用作免疫印迹 分 析,其余放入.。保存。 向 组织匀浆中加入 细胞裂解缓冲液,冰上孵育分钟,其余步 骤同细胞样品的制备。 、蛋白含量测定 用法蛋白质定量测定试剂盒进行蛋白质定量,样品稀释倍进行测 量。用 容量为的石英比色杯测定的吸光度值,先测定空白管,然后再测 样品。 绘制标准曲线,并从计算机给出的线性方程式中计算出未知样品 的浓度,乘以 稀释倍数得出最终浓度。 、 实验过程 配制分离胶与浓缩胶 %浓度分离胶的配方: . %丙烯酰胺溶液 . / ?. . . %溶液 水 . %过硫酸铵溶液 . . %浓缩胶的配方: . %丙烯酰胺溶液 。 /。?.. . %溶液 水 . 年复旦大学博士研究生毕业论文 . %过硫酸铵溶液 . 上样样品的准备 同一组几个样品按蛋白总量相等的原则,计算出不同的上样体积。 终浓度%? 一巯基乙醇 溴酚蓝 终浓度.%/ 样品及其它成分加入.塑料离心管中,混匀后煮沸分钟,瞬时离心后 上样。 电泳 将已配好的胶正确安装至电泳槽内,注意玻璃板与电泳装置连接处是否紧 密,避免漏液。临用时,将×电泳缓冲液稀释至×浓度,注入上、下槽中,确 定无渗漏后上样。 上样后,若个加样孔未全用,应在空白孔中加入×加样缓冲液,使 得样品在电泳过程中侧向扩散较少且较为均匀。 恒压,至溴酚蓝条带到达分离胶和浓缩胶的分界。再改用恒压分离 蛋白样品直到溴酚蓝条带离开分离胶。 转膜 按照需要大小,准备膜及张同样大小的滤纸。膜先用甲 醇激活.分钟,再放入转移缓冲液中,滤纸也放入转移缓冲液中待用。 电泳毕,取出胶,按实验要求切去多余部分,剩下部分大小同 膜相同。放入转移缓冲液中洗去残留的电泳缓冲液。转移装置安装的顺序为: 黑色板上放一海绵垫,三层滤纸,胶,膜,滤纸,海绵垫,最后夹 紧。 切记各层之间不能有气泡 转移装置放入加入转移缓冲液的槽中,槽内放入一只冰盒,整个槽放入一只 加有大量碎冰的盆中,避免转移过程中温度过高。 恒流转膜小时。 抗体结合 转膜结束后,在膜的蛋白结合面做好标记后,放入%牛血清白蛋白 年复旦大学博:士研究生毕业论文 /,溶于中溶液中,置于摇床上约小时,封闭膜上的非特异性的 蛋白位点。 一抗按书标明的稀释比例用%配制,按每个加样孔约.的用 量计算所需总量。准备一个湿盒,内有一覆有封口膜的平板,抗体溶液加在其表 面,膜由封闭液中取出后,在垂直于膜的位置处用吸水纸尽量吸干液体, 蛋白面朝下,放在抗体溶液上。湿盒在?冰箱中过夜。 一抗结合完毕,取出膜,放入溶液中,摇床上洗膜次,各分 钟。二抗按说明书标明的稀释比例用%脱脂牛奶溶液配制,按每个加样孔约 .的用量计算所需总量。同结合一抗的操作方法,然后湿盒室温孵育小时即 可。 显影 二抗结合完毕,取出膜放入溶液中,摇床上洗膜次,各分钟。 将试剂的液、液等量混匀,加在平板之上,膜蛋白面向下,放于其 上,室温反应分钟。 置膜于两层保鲜膜之间,小心赶尽气泡 将膜蛋白面朝上,置于光片盒中,于暗室中压上光片,选择合适的曝光 时间,显影之。 定影后,用水冲洗照片,晾干,保存。 、收集、处理数据 用凝胶成像系统携带的白色光源拍照,并用 软件进行灰度分析, 实验结 果用平均数标准误士表示。 八实时定量分析增生相关基因水平的变化 、抽提使用 ,,具体步骤如下: 用消毒过的冲洗细胞次,尽量将残液倒尽。对于组织样本,也用 冲洗干净。 向细胞或者组织样本中加入 溶液裂解细胞或者组织。 用细胞刮刀刮取细胞,或用机械匀浆器匀浆组织,充分裂解。 收集裂解液,转入.塑料离心管。 年复旦大学博士研究生毕业论文 ,来回颠倒.次充分混匀,置 于?水浴 加入 锅内加热分钟切忌勿多于分钟。 离心管。 室温离心.分钟,小心转移上清至一新的. %酒精,涡旋混匀器上振荡分钟以充分混匀。 向上清中加入 将离心管内容物移入 ,室温离心.分 钟。 溶液加酒精,室温离心. 弃滤液,加入 分钟。 弃滤液,准备孵育液并轻轻混匀,成份及比例如下: 氯化锰,.“ 孵育液至离心柱膜中间,室温孵育 分钟。 加入 加入 终止溶液加酒精,室温离心分 钟。 加入 溶液加酒精,室温离心?分 钟。 溶液加酒精,室温离心. 弃滤液,加入 分钟。若仍有液体留在管内,继续离心,直至无液体残留。 .水,室温离心 将离心柱转移至一新的离心管,加入~ .分钟,收集的便是溶液,储藏于.?待用。 、逆转录制各 测定核酸浓度,测定蛋白质浓度,前后两者比值在.~.为提 取成功。 按总量计算不同样品需要的体积。 总 计算出的体积 “。?/“ 水 加至总体积 年复旦大学博:仁研究生毕业论文 混匀,。,分钟,迅速冰上冷却,离心收集液体。 向离心管内依次加入: × “ “. “ 轻轻混匀,短暂离心后,?孵育分钟,再向离心管内加入山的. ,。继续孵育分钟。 。孵育分钟后终止反应。保存于.。待用。 实时定量 建立反应体系 产物稀释倍 共 引物 ? “ ? 进行 反应,。 分钟,。 秒,。 秒,。 秒, 个循环,。结束反应。 九统计学分析 实验结果均以平均数标准误表示。多组间两两比较用检验法检验。 .则认为组问有显著性差异。 年复旦大学博士研究生毕业论文 实验结果 一、重组腺病毒感染后,基因在肝脏过表达 首先检测感染情况,选用周大小的雌性/小鼠,经尾静脉注射剂量为 ×/鼠的腺病毒。分别采用.以及免疫印迹的方法,检测病毒感染,, ,,及天后,小鼠肝脏内的表达。结果显示,.感染后,肝 脏内的表达在信使及蛋白水平上均明显升高图和: 于感染后第天开始升高,第天和第天到达顶峰,而在第天回归到正常水平。 附:应用腺病毒感染,在动物体内过表达基因,检测对肝细胞 生长的作用,需要排除肝脏毒性对细胞生长的影响。反应肝脏毒性的重要指标,主要包括 丙氨酸氨基转移酶、谷草转移酶和碱性磷酸酶。我们前期预实 验结果显示,在腺病毒感染条件为×/鼠时,上述三种指标均无明 显变化,故我 们在后续的实验中均采用此条件。 土望竺竺竺兰竺竺竺 : 硼懒靴??????? 一 ,一. 年复旦大学博士研究生毕业论文 图:腺病毒感染后肝脏内基因的及蛋白水平 . .. ? . , . .,.. . 士../木. . 二、过表达对肝脏内增殖细胞核抗原表达的影响 与细胞合成关系密切,在细胞增殖的启动上起重要作用,是反映 细胞增殖 状态的良好指标【 。为确定对肝脏生长的影响,本实验中,选择 作为肝 脏增生的指标。免疫组织化学结果表明,在感染组,阳性细胞数随 着 肝脏基因水平的增高而明显增加图和。而在对照病毒感染组, 性细胞数未有明显改变图。图的免疫印迹结果也同样显示,蛋白 水平随着蛋白水平的增加而增加:开始于第天,第天达到最高值, 而在第 天回复基本水平。此免疫印迹结果表明过表达能够诱导基因的表 达,也 同时证实了免疫组织化学结果的可靠性。盘 盆一?昌?? 磷。麓澎 一鬻燃鹾麟雹 年复旦大学博士研究生毕业论文 沈零一 ???艟“啼 ; ? 图:过表达对肝脏表达的影响 . ? . , . ; ; .. 士../木. . 三、定位小鼠肝脏内与的表达 年复旦大学博士研究生毕业论文 为阐明表达的改变是否由引起,在.感染天后的 肝脏组织进行免疫荧光双染,定位与的表达。图显示了肝脏样本 中,染色后呈现蓝色荧光的所有细胞核。图与图分别显示了肝脏 组织中 与的位置,呈现红色荧光的主要表达于细胞质,而呈现绿 色荧光的主要表达于细胞核。通过合并图片图,不难发现,几乎所 有存在 表达的细胞核均伴随在细胞质的表达,而没有表达的细胞 且只有蓝色荧光,而无红色荧光区域中的细胞内,检测不到的表 达。此结果 提示我们 与的表达密切相关。 ‘ ?。 年复旦大学博士研究生毕业论文 图:免疫荧光双染法定位小鼠肝脏内红色与绿色的表达 ... , ?; ;, .. 四、过表达对小鼠肝脏内细胞周期调控基因表达水平的影响 如前所述,常规?感染小鼠,并用实时定量的方法检测小鼠肝 脏内增生相关基因的水平。当小鼠肝脏内的表达量到达顶峰时感染 的 后或天,增生相关基因,包括,,,和 水平均显著升高,升高幅度约为感染后天的~倍图 .。其中,和它 的下游基因,在细胞周期/期以及/期过渡中发挥重要作用。 是期向期转移的限速因素,也可促进细胞从期向期的转化【】。另外,基质金 属蛋白酶?.基因的表达也有所变化,天的.感染将其水 平提高至.倍图。.归属于明胶酶类,是一种锌依赖性内肽酶,主要降解 细胞外基质膜有效成分,在肝脏再生过程中参与调节细胞黏着及组织重塑等病理生理过程 。因此,表达水平的提高能够促进体内小鼠肝脏的生长。 年复旦大学博士研究生毕业论文 鼍 司 乏 翻 茸 荟 多 嗣 冒誊?《《霉。皇蔷?甾 絮毫篮墨。刍露冒瞄 藿 ? 重 蛊 。 暑 嚣 冒 囡 冒》?鬣蓦。是罩一图:过表达对小鼠肝脏内细胞周期调控基因表 达水平的影响 ..?, .., .;;; ;一 . . 土../枣. . 年复旦大学博士研究生毕业论文 五、过表达对小鼠肝脏内活性及其下游基因表达水平的影响 为了解促进肝脏生长的可能机制,我们检测了小鼠肝脏信号转导通 路中相关基因的表达变化。小鼠处理同上,采用免疫印迹技术检测肝脏,, 以及.蛋白水平变化,以?作为组织蛋白的内参照。结果显示,? 感染/、鼠至天所引起的过表达,明显抑制了的活性,及其下游 基因,?在蛋白水平上分别降低了%,%以及%图与。这些体 内实验结果与之前研究报道的对信号的抑制性效应相一致‘, 。最近的 报道指明,在许多细胞及动物模型中,信号转导通路的激活能够抑制细胞增生并引起 生长停涮,。 。因此,自介导的生长促进效应很有可能与其对信号转导通 路的抑制有关。 里型垫壁业堕业望 ‘石面五面瓦丽而百而石面 二二二三三二三二三圣二二 三三:二’三三三兰三三三二三三 臣基三三:三蔓三三三三蔓量 三三二三三三三三三三 .,誓錾懑羹;囊壤.漕懿灏睡巍隧囊。:誊; 羹麓鞠敝。卜 一卜年复旦大学博士研究生毕业论文 .. .. 毒工鲨??厂 ;门卤图? ?: 兰??厂昌.厶。三苠百笛 昌.一,丁。匕写 . . 图:过表达对小鼠肝脏内活性及其下游基因表达水平的影响.. . ?. ,,,... .../. 六、激动剂对诱导的小鼠肝脏增生的影响 与都是核受体的激动剂。不同的是,为一种人工合成 的化合物,而在生物体内天然存在。过表达能够削弱刺激的信 年复旦大学博士研究生毕业论文 号活性,而对于所引起的活性无明显消弱作用 ,】。为明确诱 导的增生是否依赖于信号转导途径,我们在小鼠肝脏内对这两种 激动剂的作用进 行了比较。小鼠处理细节在实验方法部分有详尽的说明,简单的 讲,是对腺病毒感染天 的小鼠给予进一步的或腹腔注射。免疫印迹结果显示,与感染对 照病毒的 小鼠肝脏相比,无论是否存在,过表达均可引起表达升高,活 性降低。然而,的存在却明显抑制了诱导的表达升高图。 这些体内实验数据清楚的表明,信号参与了体内介导的增生效 应。 . 、奄.匕~竺篡?~竺兰. :篡竺漕 ~篡~“了一二 沈 艺 乞 一 宅??口:艺甾 . ’ ? 。。 年复旦大学博士研究生毕业论文 图:信号在介导的肝脏增生效应中的作用 . .. ,/ , . ,, . ..?/木.凇. .. ,. 七、在大鼠肝脏细胞生长中的作用 之后,我们采用.干扰的方法抑制原代大鼠肝细胞中 基因的表达,反向验证其对肝脏细胞生长的影响。这里将作为研究对象, 是因为相对小鼠而言,大鼠肝脏拥有较高水平的表达【 ,容易操作。结果显 示,在.转染组,即相对正常培养的中,的水平随着培 养时间的延长而逐渐增加【,并在时后达到培养初期水平的倍图。 的水平也随 与此同时,细胞周期调节基因,,,以及 着细胞培养时间的延长而增加图.。然而,当基因表达被. 转染有效抑制时水平约降低%~%,上述增生相关基因的 水平也随之显著降低图.。由于细胞活力的下降本身也能影响细胞内基因 水平的改变,我们需要排除干扰操作对细胞活力的影响。通过对细胞生存力进行分 析,我们发现,与未经任何处理的相比,.转染组肝细胞的活力明显 下降,而.转染组肝细胞却无明显改变,表明干扰实验本身对肝细胞活 力的影响不大。这些结果提示我们,具有一定的增生潜能【引,并且此增生潜能可能 受基因的调节。 我们又采用了腺病毒感染的方法,检测基因过表达对体外肝细胞生 长的影响。如图所示,用感染复数为的.感染~小 时,显著提高了的蛋白水平,且无细胞毒副作用表现。与此同时,通过对细胞 活力的检测,我们发现,有活力的大鼠肝细胞数目也在.感染时后明显 增加图。然后我们用实时定量的方法检测增生相关基因的改变。结果显示, 年复旦大学博士研究生毕业论文 与.处理后的肝细胞所呈现的数据相反,基因过表达进一步升 高了大约倍中,,以及 基因的水平图。 因此,基因过表达也能够促进体外肝细胞的增生,这与之前的体内实验结果一 致。 拘缩写,中文译为感染复数。传统的概念起源于 附:是 噬菌体感染细菌的研究。其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值,也就是平均每个细菌 感染噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为如。一般..寸个比值,没有单位,其 /。后来被普遍用于病毒感染细胞的研究中,含义是 实其隐含的单位是 感染时病毒与细胞数量的比值。 .. , . . ? 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