细胞角蛋白多肽在毛丝鼠中耳上皮细胞的表达

细胞角蛋白多肽在毛丝鼠中耳上皮细胞的表达 1 2金顺吉,David J. L im ( 1 延边大学医学院 附属医院耳鼻咽喉科 ,吉林 延吉 133000 ; House Ear Instit ute ,2100 Third St reet , )Los Angels ,CA 90057 , U . S. A. ( ) [ 摘要 ] [ 目的 ]确认已培育的毛丝鼠中耳上皮细胞株 CM EC21细胞所能表达的细胞角蛋白多 肽 . 方法 ]利用免疫细胞化学原理和间接免疫荧光技术 ,将 13 种细胞角蛋白抗体试剂反应于培育 25 代的毛丝鼠中耳上皮细胞株细胞和初代培养的毛丝鼠中耳上皮细胞 ,再与附有荧光素的山羊抗 鼠 Ig G 反应. 用荧光显微镜观察. 结果 ] 上述两种细胞与细胞角蛋白抗体 6B10 , C Y290 ,L DS268 , C211 , K8 . 13 和细胞角蛋白抗体 C211 , PC K226 , C Y290 , KS1A3 , M20 和 A532B/ A2 的混合液呈阳性 反应. 但与细胞角蛋白抗体 C KB1 ,C K2E3 , K4 . 62 , PC K226 , K8 . 12 , K8 . 60 ,M20 呈阴性反应 . 结论 ] 毛丝鼠中耳上皮细胞株细胞与初代培养的毛丝鼠中耳上皮细胞均表达细胞角蛋白多肽 4 ,7 和 18 . [ 关键词 ] 角蛋白 ;细胞系 ;中耳 ;上皮 ;毛丝鼠 () [ 文章编号 1000 21824 19990420258203 [ 中图分类号 Q512 [ 文献标识码 A Expression of cytokeratin polypeptides on chinchilla middle ear epithel ial cell s 1 2J IN Shun2j i,David J. L im (1 De p a rt m en t of O torhi nol a ry n gology , A f f i l i ated Hos pi t al of Y a nbi a n U ni ve rsi t y Col lege of M edici ne , Y a n j i , J i l i n 133000 , Chi n a ; 2 House Ea r I nst i t u te , 2100 T hi r d S t reet , L os )A n gels , CA 90057 , U . S . A . ABSTRACT : OBJ EC T I V E To co nfir m t he exp ressio n of cyto keratin polypep tides o n t he cult ured chinchilla middle ear epit helial cells. M E T HO DS U sing immunocytochemist ry met ho ds and indi2 rect immunofluo rescence technique , t he cells of chinchilla middle ear epit helial cell line of cult ured 25 generatio n and p rimarily cult ured chinchilla middle ear epit helial cells were stained wit h 13 kinds of cyto keratin antibo dies and reacted again wit h goat2antimo use Ig G at tached fluo rescein , and o bserved under fluo rescence micro scope . R ES U L T S Bot h of above cells were po sitive fo r cy2 to keratin antibo dies of 6B10 , C Y290 , L DS268 ,C211 , K8 . 13 and a cyro keratin antibo dies mixt ure of C211 , PC K226 ,C Y290 , KS1A3 ,M20 and A532B/ A2 . But t he bot h of cells were negativefo r cy2 to keratin antibo dies of C KB1 , C K2E3 , K4 . 62 , PC K226 , K8 . 12 , K8 . 60 and M20 . CO N CL U 2 S I O N The bot h of t hese cells exp ress cyto keratin polypep tides 4 ,7 and 18 were indicated. Key words :keratin ;cell line ; middle ear ;epit helium ;chinchilla 各种组织细胞的特异性可由细胞支架中 ,可根据细胞角蛋白中间细丝的多肽与相 胞 的某些中间细丝蛋白的抗原性表现 . 由于细 应抗体发生的结合反应 ,清楚地鉴别出上皮 1 胞角蛋白中间细丝只存在于上皮细胞和癌细 细胞和 癌 细 胞. 在 细 胞 培 养 中 , 因 上 述 原 因 ,上皮细胞的细胞角蛋白中间细丝多肽表[ 收稿日期 ] 1999204207 现出来的抗原性 ,可做为已培育的细胞是否 ( ) ( ) [ 作者 简 介 ] 金 顺 吉 1958 - , 男 朝 鲜 族, 副 教 为上皮细胞的判定标准之一. 授 ,医学学士 . 1 材料与方法. 两种细胞对细胞角蛋白抗 达出同样的结果 体 6B10 ,C Y90 ,L DS268 , C211 , K8113 和细胞 111 培养基及细胞培养角蛋 白 抗 体 C211 , PC K226 , C Y90 , KS21A3 , 11111 培养基成份 300 mL 达尔克氏必需 M20 ,A532B/ A2 的混合液均呈阳性反应. 但 ( ) 基本培 养 基 DM EM 培 养 液 , Gibco 公 司 , 对细 胞 角 蛋 白 抗 体 C KB1 , C K2E3 , K4162 , ) ( 100 mL Ham’s F12 Gibco 公司、10 %小牛K8160 , PC K226 , K8112 和 M20 均呈阴性 ,见 ( ) 表 1 、表 2 、表 3 . 血清 Gibco 公 司、014 mg/ L 氢 化 可 的 松 、 - 6 表 1 第一抗体所采用的 13 种细胞角蛋白抗体 10 mol/ L 异 丙 肾 上 腺 素 、100 U / mL 青 霉 素 、100 U / mL 链霉素 B , 0125 mg/ L 两性霉 () 素 以上药品均为 Sigma 公司产品. 抗体 克隆代号 辨认的多肽号 码 抗细胞角蛋白14 C KB1 14 11112 细胞培养 将培养盘内的毛丝鼠中17 C K2E3 抗细胞角蛋白17 耳上皮细胞株细胞用胰酶处理 ,放入离心管 K4162 19 抗细胞角蛋白41 62 8 M20 抗细胞角蛋白8 内离 心 , 去 掉 上 清 液 , 用 磷 酸 盐 缓 冲 液 洗 1 PC K226 1 ,5 ,6 ,8 抗全细胞角蛋白次 , 加 入 培 养 基 做 成 细 胞 悬 浮 液 K8112 抗细胞角蛋白81 12 13 ,15, 16 7 K8160 10 ,11 抗细胞角蛋白81 60 () 个/ L ,注于培养盘内的培养玻片上 ,1 ×104 6B10 抗细胞角蛋白4 ( ) 放入二氧化碳培养箱 37 ?中 , 培养 4 , 5 LDS268 7 抗细胞角蛋白7 18 d. 从毛丝鼠耳泡中取出粘膜 ,切碎后将碎片 C Y90 抗细胞角蛋白18 4 ,5 ,6 ,8 ,10 ,13, 18 C211 抗全细胞角蛋白 放在培养盘内的培养玻片上 ,加入培养基 ,在K8113 1 ,5 ,6 ,7 ,8 ,10 ,11, 18 抗细胞角蛋白81 13 上述条件下培养 7d ,取掉粘膜碎片和梭状的 1 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,10 ,13 ,,1189 抗体混合液抗全细胞角蛋白 成纤维细胞后 ,做为阳性对照组细胞. 表 2 细胞角蛋白抗体反应结果 112 抗体 第一抗体采用 13 种细胞角蛋白抗体反应 克 隆 代 号 结果 ( ) 抗体 Sigma, 见表 1 . 第二抗体采用附有荧 阳性反应 6B10 ,LD2S68 ,CY90 ,2C11 ,K8113 ,抗体混合液 ( ) 光素的山羊抗鼠 Ig GSigma. 阴性反应CKB1 ,C2KE3 ,K4162 ,PCK226 ,K8112 ,K8160 ,M20 113 抗原抗体反应 从培养盘中取出附着 表 3 细胞角蛋白多肽的表达 有 细 胞 的 培 养 玻 片 , 放 入 致 冷 的 甲 醇 细胞角蛋白抗体反 应细胞角蛋白多肽号 码 阳性抗体多肽 1 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,10 ,11 ,13 ,1,81 9 ( ) ( ) - 20 ?内 20 min ,再放入丙酮液 4 ?中 1 ,5 ,6 ,8 ,10 ,11 ,13 ,14 ,15 ,16,1 ,91 7 阴性抗体多肽2 min ,取出自然干燥后 ,用磷酸盐缓冲液洗 1 讨论3 次 ,加山羊血清封闭非特异性抗原 30 min ,用 在人体上皮细胞中 ,已识别出 19 种不同的磷酸盐缓冲液洗净血清后 ,加入第一抗体 ,放 2 细胞角蛋白中间细丝多肽. 尽管有很多有关 ( ) 入恒温箱 37 ?1 h ,取出洗净后 ,加入附有 细胞角蛋白在人体上皮细胞表达的报道 ,但有 ( )荧光素的山羊抗鼠 Ig G ,放入恒温箱 37 ? 关细胞角蛋白在毛丝鼠中耳上皮细胞表达的报 3 内 1 h ,取出培养玻片 ,用磷酸盐缓冲液洗净 道很少. Amesara 等报道了毛丝鼠中耳上皮细 胞与细胞角蛋白抗体 K8113 和 CK8 的结合反 多余的抗体 ,固定在玻璃片上 ,以备观察. 应呈阳性. 前者辨认细胞角蛋白多肽 1 ,5 ,6 ,7 , 114 观 察 在 暗 室 , 用 免 疫 荧 光 显 微 镜 ( ) 8 ,10 ,11 和 18 ;后者为单克隆特异抗体 ,只辨认 Zeiss ,Axiovert 135观察并拍摄. 4 细胞角蛋白多肽 8. Sano 等报道了毛丝鼠中 2 结果 在免疫细胞化学反应中 ,如表 2 所示 ,毛 耳粘膜上皮与细胞角蛋白抗体 K8113 , P KK22 , 丝鼠中耳上皮细胞株细胞和初代培养的毛丝 Lu25 ,CK7 ,CK8 和 CK18 反应时呈阳性反应. 如 鼠中耳上皮细胞对 13 种细胞角蛋白抗体表 ?259 ? 4 表 1 所示 ,13 种细胞角蛋白抗体试剂被应用于 Sano 等用了细胞角蛋白抗体 CK8 ,也许这两 种抗体辨认的抗原决定簇不同 ,而呈现不同的 本试验. 这些抗体可辨认细胞角蛋白多肽 1 ,4 , 结果 ,或在本实验所用细胞的细胞角蛋白不存 5 ,6 ,7 ,8 ,10 ,11 ,13 ,14 ,15 ,16 ,17 ,18 和 19. 本实 在抗体 M20 所能辨认的抗原决定簇 ,而不表达 验中如表 2 和表 3 所示 ,毛丝鼠中耳上皮细胞 细胞角蛋白多肽 8. ?在本实验中 ,所用的能够 株细胞和初代培养的毛丝鼠中耳粘膜上皮细胞 辨认细胞角蛋白多肽 1 ,5 ,6 ,8 的细胞角蛋白抗 体 PCK226 与毛丝鼠中耳上皮细胞株细胞和初 均与 6B10 ,LDS268 , CY90 , C211 , K8113 和细胞 代培养的毛丝鼠中耳上皮细胞抗原抗体反应 角蛋白抗体 C211 ,PCK226 ,CY90 , KS21A3 ,M20 , 中 ,呈阴性反应 ,进一步说明毛丝鼠中耳上皮细 A532B/ A2 的混合液的反应中呈阳性 ,而这些抗 胞株细胞和初代培养的毛丝鼠中耳上皮细胞不 体可辨认细胞角蛋白多肽 1 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,10 ,11 , 表达细胞角蛋白多肽 8. ?毛丝鼠中耳上皮细 13 ,18 和 19. 但上述两种细胞与细胞角蛋白抗胞株细胞和初代培养的毛丝鼠中耳上皮细胞不 4 体 CKB1 ,CK2E3 , K4162 , PCK226 , K8112 , K816O 表达细胞角蛋白多肽 8 ,也许是象 Sano 等和 7 和 M20 的反应中呈阴性 ,而这些抗体则可辨认 Bartek 等所述那样因细胞角蛋白多肽 8 的抗 细胞角蛋白多肽 1 ,5 ,6 ,8 ,10 ,11 ,13 ,14 ,15 ,16 , 原决定簇 ,由于某些原因被遮盖而导致的假阴 17 和 19. 比较两种细胞表达的细胞角蛋白多肽 性反应. 号码 ,并从两种细胞表达的细胞角蛋白多肽号 码中除掉不表达的多肽号码 ,不难看出表现阳 性反应的细胞角蛋白多肽只有 4 ,7 和 18. 在本 [ 参 考 文 献 ] 实验中使用的单克隆特异抗体 6B10 ,LDS268 , 1 Moll R. Diversity of cyto keratins in carcino mas CY90 与上述两种细胞均呈阳性反应. 6B10 只 J . A ct ahistochem ica , Suppl . Band XXXIV , S , 辨认细胞角蛋白多肽 4 ,LDS268 只辨认细胞角 1987 :37 . Moll R , Franke WW , Schiller D I , et al . . The 2 蛋白多肽 7 ,CY90 只辨认细胞角蛋白多肽 18 , catalog of human cyto keratins : Pat terns of ex2 这 3 种单克隆特异抗体阳性反应进一步证明上 p ressio n in normal epit helia ,t umors and cult ured () Cel l ,1982 ,l 31:11 . cellsJ . 述结果的正确性. 3 Amesara R , Kim Y , Sano S , et al . . Primary cul2 在本实验中 ,细胞角蛋白抗体 M20 与上述 t ures of middle ear epit helial cells f ro m chin2 chillasJ . Eu ro A rch O torhi nol a ry ngol , 1992 , 两种细胞的反应中 ,均呈阴性 ,即毛丝鼠中耳上 249 :1647 . 皮细胞株和初代培养的毛丝鼠中耳上皮细胞不 Sano S , Schachern PA , Haruna S , et al . . Cyto k2 4 eratin pat terns of normal middle ear epit helia in 表达细胞角蛋白多肽 8. 这一结果与 Amesara humans , cat s and chinchillasJ . A n n O tol R hi2 3 等的相反 , 其原因可做如下解释. ?Blitter2 nol L a ry ngol ,1994 ,103 :227 . Van Blit terswij k CA , Grote JJ , L utgert RW , et 5 5 6 swijk 等和 Broekaert 等在人的中耳粘膜上al . . Cyto keratin pat terns of tissues related to cholesteato ma pat hogenesis J . A n n O tol R hi2 做了有关细胞角蛋白表达的实验 ,而前者用了 nol L a ry ngol ,1989 ,98 :635 . 抗体 M20 ,后者用了抗体 CK8. 这两种抗体均是 Broekaert D ,Cornille A , Eto H , et al . . Co mpara2 6 tive immuno histochemical st udy of cyto keratin 细胞角蛋白多肽 8 的单克隆特异抗体 ,但 M20and vimentin exp ressio n in middle ear mucosa 7 呈阳性反应 ,而 CK8 呈阴性反应. Bartek 等报 and cholesteato ma and in epidernis J . V i r2 chow s A rchi v A Pat hol A n at ,1988 ,413 :39 . 道 ,用 3 种可辨认细胞角蛋白多肽 19 的单克隆 Bartek J ,Bart kova J , Taylor2papadimit riou J , et 7 特异抗体 BA16 ,BA17 和 A532B/ A2 反应于人的 al . . Differential exp ressio n of keratin 19 in nor2 mal human epit helial tissues revealed by 上皮组织 ,但由于这 3 种抗体辨认不同的抗原 antibodies J . mo nospecific mo noclo nal His2 决定簇 ,而得出不同的结果. 这样 ,由于本实验 tochem J ,1986 ,18 :565 . 3 用了细胞角蛋白抗体 M20 ,而 Amesara 等和