阴沟肠杆菌质粒介导耐喹诺酮类药物的机制研究

阴沟肠杆菌质粒介导耐喹诺酮类药物的机制研究 阴沟肠杆菌质粒介导耐喹诺酮类药物的机制研究 作者: 吴创鸿 陆坚 邓启文 张扣兴 【摘要】 目的 了解深圳地区阴沟肠杆菌中qnrA基因的流行情况、基因定位及其介导喹诺酮耐药性产生的机制。方法 收集临床分离的 阴沟肠杆菌45株，采用PCR法结合测序的技术筛查qnrA基因，大质粒提取技 术、Southern杂交和接合传递试验进行质粒定位，琼脂对倍稀释法进行药物敏感性检测。结果 45株阴沟肠杆菌中，7株PCR法及测序证实为qnrA基因。7株菌中6株菌所携质粒被‎‎成功提取并进行Southern杂交，qnrA基因定位于80,200kb大小的低拷贝数天然质粒上。4株菌成功进行接合传递试验，使接合子对环丙沙星的MIC 值提高了32,64倍。结论 质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrA在深圳地区阴沟肠杆 菌中具有较高的流行率，可能是导致阴沟肠杆菌对喹诺酮类抗菌药获得性耐药的重要原因。 【关键词】 qnrA基因 阴沟肠杆菌 喹诺酮 耐药 质粒 Plasmid mediated quinolone resistance in clinical isolates ABSTRACT Objective To investigate the prevalence and location of qnrA gene in clinical isolates of Enterobacter cloacae and its function in the development of quinolone resistance. Method Forty five Enterobacter cloacae were screened for the qnrA gene by PCR and then conformed with direct sequencing. Large plasmid extraction and Southern hybridization were done to determine the location of qnrA. Conjugation experiments were done to determine the transferability and its effects in the development of quinolone resistance. Results qnrA were detected in 7 (15.6%) of 45 strains. The qnrA sequence matched that of NCBI GenBank with 100%. Plasmid extraction and Southern hybridization were succeed in 6 stains. The qnrA were located in plasmids in size of 80,200kb. Conjugation experiments were done in 4 strains. Transconjugants had 32,64 fold increases in the MIC of ciprofloxacin relative that of the recipient but were still susceptible to ciprofloxacin according to CLSI stardard. Conclusion Transferable plasmid mediated quinolone resistance associated with qnrA were high prevalent in clinical isolates of Enterobacter cloacae from Shenzhen city and may contribute to the quinolone resistance of thiese bacteria. KEY WORDS qnrA; Enterobacter cloacae; Quinolone; Drug resistance; Plasmid 1998年，Martinez等首次证实肺炎克雷伯菌对喹诺酮类抗菌药存在质粒介导的耐药机制，并将该耐药基因命名为qnr(现命名为qnrA),1,。之后我国学者王明贵等研究发现qnrA基因在耐喹诺酮类抗菌药大肠埃希菌中的检出率高达7.7%，提示qnrA基因在介导肠杆菌科细菌耐药机制方面可能发挥着重要作用，引起广泛关注,2,。 目前阴沟肠杆菌已成为医院内感染的重要病原菌，且对喹诺酮类抗菌药的耐药性迅速上升，给临床抗感染治疗带来严峻挑战,3，4,。为了解qnrA基因在介导阴沟肠杆菌耐药性播散方面的作用，本研究采用PCR技术对2017,2017年我院临床分离的阴沟肠杆菌进行了qnrA基因携带率的筛查，DNA测序证实并与已报道的 qnrA序列进行比较，并通过Southern杂交及接合传递试验对qnrA基因进行了质粒定位，现报道如下。 1 材料和方法 1.1 菌株来源及鉴定 2017,2017年我院及深圳市人民医院临床分离的非重复阴沟肠杆菌45株。采用法国Bio Merieux公司API 20E系统进行种属鉴定。研究用菌株为E.coli J53/pMG252作为qnrA基因PCR检测和Southern杂交检测的阳性质控株，E.coli J53 Azr(耐叠氮钠)作为接合传递实验受体菌及MICs参照株，均由美国Jacoby教授提供。 1.2 抗菌药物敏感性检测 采用琼脂稀释法检测临床分离菌及接合子对环丙沙星的MICs值，其它抗菌药物的敏感性采用KB法检测。MH培养基和药敏纸片均为Oxoid公司产品。结果按照美国临床和实验室标准委员会(CLSI)2017年版推荐的标准进行解释。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和阴沟肠杆菌ATCC13047。 1.3 qnrA扩增和测序 采用PCR法并结合测序进行PCR引物参照文献,4,委托上海英骏生物有限公司合成。上游引物5′ TCAGCAAGAGGATTTCTCA 3′，下游引物5′ GGCAGCACTATTACTCCCA 3′，增片段为627bp。PCR循环参数为: 94?预变性5min，95? 30s，45? 60s，72? 60s，循环35次，最后72?延伸5min。PCR产物送上海英骏生物有限公司纯化后直接进行双向测序。阳性对照菌株为E.coli J53 pMG252。 1.4 qnrA序列比较 所测序列用DNAstar软件进行序列拼接、校正后，采用美国国家信息中心(NCBI)在线分析工具Blastn()程序进行分析，以确定耐药基因型或基因变异情况。qnrA基因参比序列号为AY070235及AY259086。 1.5 质粒分析及qnrA基因Southern杂交检测 QIAfilter Plasmid Maxi Kit(QiaGen，德国)提取质粒，0.7%琼脂糖电泳，采用LabImage软件分析与E.coli V517及E.coli J53/pMG252所携质粒比较的结果，以确定其分子量大小。电泳结果拍照后，用毛细管转移法将质粒DNA转移至硝酸纤维素滤膜上。以切胶纯化的qnrA基因PCR产物为模板制备其检测探针，按地高辛随机引物标记和检测试剂盒(博士德公司，武汉)说明进行操作。 1.6 接合传递试验 供体菌为临床分离的qnrA阳性株，受体菌为E.coli J53 Azr。将供体菌、受体菌分别接种于LB平板上，35?过夜培养。挑取单个菌落分别接种于4ml的LB肉汤中，37?220r/min摇菌培养8,12,。各取0.5ml供、受体菌于4ml的LB肉汤中，37?静止过夜培养。接合子以胰大豆琼脂平皿筛选，平皿中含叠氮钠(250μg/ml)及氯霉素(30μg/ml)、庆大霉素(20μg/ml)或四环素(20μg/ml)中的一种。在筛选平皿上生长的菌落同时接种至含及不含环丙沙星(0.06μg/ml)的胰大豆琼脂平皿上，以了解喹诺酮耐药性是否同时转移。此外，以PCR法对筛选出的接合子进行qnrA基因检测，阳性者重新进行菌种鉴定，鉴定为大肠埃希菌者明携qnrA基因耐药质粒接合转移成功。 2 结果 2.1 qnrA基因的检测 采用PCR方法对临床分离的45株阴沟肠杆菌进行qnrA基因的筛查，7株(15.6%)得到了阳性扩增条带(Fig.1)。对全部PCR产物进行测序，所得序列采用Blastn程序进行分析，结果显示7个样本的序列均为qnrA基因，与上海王明贵报道的qnrA基因吻合率为100%。qnrA阳性的菌株对环丙沙星 的MIC值分别为0.5mg/L 3株、2mg/L 2株、4mg/L 1株，按CLSI折点判断标准分别为敏感、中介和耐药。 2.2 质粒提取和qnrA基因Southern杂交定位 7个qnrA基因阳性株中成功提取了6株菌的质粒进行质粒谱分析和Southern杂交检测。质粒谱分析显示各分别携带了2,4个天然质粒(Fig.2A)。以qnrA基因为模板制备探针进行Southern杂交检测显示，qnrA基因大约存在于在80,200kb大小的低拷贝数天然质粒上(Fig.2B)，其中Ec 28携qnrA的质粒大于180kb，其它菌株携qnrA的质粒大、小基本相同，小于180kb。 2.3 质粒接合传递试验及药敏分析 以7株qnrA阳性的临床分离菌为供体菌、耐叠氮化钠的大肠埃希菌J53为受体菌进行接合传递试验，其中4株菌携qnrA的质粒成功转移。接合子获得质粒后对环丙沙星的MIC从0.008mg/L上升 至0.25,0.5mg/L，提高32,64倍。接合子对环丙沙星MIC与临床分离株比较尚有2,8倍差距。按CLSI标准接合子对环丙沙星仍在敏感范围。 3 讨论 阴沟肠杆菌在自然环境中广泛分布，也是人和动物肠道的正常菌群，目前已成为医院内感染的重要病原菌之一，常引起呼吸道、泌尿道、血液、伤口和烧伤部位感染。近年来的研究多注重于阴沟肠杆菌产AmpC酶及ESBLs使之对头孢菌素类抗生素耐药;而耐药监测结果显示我国临床分离的阴沟肠杆菌对喹诺酮类抗菌药的耐药率近年来迅速上升，目前已高达23.5%,40.6%,3，4,。因此，准确阐述其耐药性迅速产生的分子机制，对合理制定临床防治措施及新药研发具有重要意义。 现有的研究结果表明，药物作用靶位的改变和外膜通透性下降是阴沟肠杆菌耐喹诺酮的重要机制‎‎,5,;qnrA在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的发现使人们对喹诺酮耐药机制有了新的认识,1，6,。qnrA基因定位在质粒上，所编码的蛋白由218个氨基酸残基组成，属五肽重复序列家族，可以保护大肠埃希菌DNA回旋酶免受喹诺酮类抗菌药的干扰而产生耐药性,7，8,。本研究接合传递试验的结果也证实，qnrA基因定位在质粒上，可能是导致其耐药性在临床分离中株中水平传播的主要原因。本研究还发现深圳地区阴沟肠杆菌qnrA基因有较高的流行率(15.6%)，同期检测的184株大肠埃希菌中没有发现qnrA的流行，91株肺炎克雷伯菌中也只有4株qnrA阳性。最近Corkill等报道，英国利物浦16株对头孢塞肟和环丙沙星耐药的阴沟肠杆菌中有9株(56.3%)qnrA阳性,9,;Robicsek等报道，美国各州头孢他啶耐药的71株肠杆菌属细菌中12株(17%)qnrA阳性,10,，提示阴沟肠杆菌中qnrA有较高的流行率是普遍现象。 值得注意的是qnrA基因的检出并不代表qnrA位于质粒上。Poirel等报道弧菌科细菌的染色体上存在与qnrA基因高度同源性的序列,11,;另外，对qnrA的基因环境研究发现，qnrA存在于I类整合子中，也提示qnrA可能会在染色体和质粒之间水平移动。本研究采用Southern杂交技术及接合传递试验进行qnrA基因的定位。结果7株菌中6株菌携qnrA基因的质粒被成功提取，Southern杂交检测证实qnrA基因定位于80,200kb大小的低拷贝数天然质粒上，其中4株菌的qnrA基因被证实具有跨菌种水平传播能力。以往报道qnrA多存在于耐环丙沙星的临床分离株中，本研究却显示无论耐药、中介还是敏感的细菌均可存在qnrA，接合子对环丙沙星也敏感，‎‎说明 ?qnrA只介导低水平耐药; ?临床耐药菌株中可能存在其它耐药机制。我们正在对携qnrA的临床分离株进行深入研究，初步结果显示该类细菌常携带多种耐药基因，多种耐药机制并存从而表现为多重耐药。虽然qnrA只介导低水平的喹诺酮的耐药性，但由于qnrA既可以放大由DNA旋转酶、拓扑异构酶IV、外排泵过度表达或膜通透性下降所致的喹诺酮耐药性，又可以增加DNA旋转酶、拓扑异构酶IV基因变异的选择性,7，10,。因此在细菌耐药性的发展中具有重要意义，需进行深入研究如何防治该耐药性的传播和流行。