【doc】利用SSR鉴定普通小麦-多枝赖草二体异附加系Line24中外源染色体同源群的归属

【doc】利用SSR鉴定普通小麦-多枝赖草二体异附加系Line24中外源染色体同源群的归属 利用SSR鉴定普通小麦-多枝赖草二体异附 加系Line24中外源染色体同源群的归属 利用SSR鉴定普通小麦一多枝赖草二体异附加系 Line24中外源染色体同源群的归属 郭光艳.,李瑞芬2,张敬原.,葛荣朝',赵茂林2,沈银柱z,黄占景z (1?河北师范大学生命科学学院,河北石家庄050016;2. 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心.北京100089) 摘要:用227对小麦微卫星引物进行PCR扩增,76对可在多枝赖草和耐黄矮病的普通小麦一多枝赖草二体异附 加系Line24的小麦亲本中国春,丰抗13间检测到多态性.在这76对引物中,发现有4对引物能从Li.e24中扩增出 和多枝赖草相同而与Line24其他小麦亲本不同的扩增带.进一步用u..24和普通小麦杂交得到的7个不同的单体 异附加系进行验证,也得到同样的结果,说明这4对微卫星引物扩增出的特异带可以作为Li.e24中多枝赖草染色体 的分子标记.根据这4对引物各自对应的微卫星标记位点在小麦染色体上的位置,说明Li.e24中附加的一对多枝赖 草染色体是第3,5,6和7部分同源群多枝赖草染色体相互易位形成的. 关键词:SSR;多枝赖草;二体异附加系;外源染色体;同源群归属 中图分类号:$512,1035文献标识码:A文章编号:1000,7091(2004)04— 0014—04 IdentifyingtheHomoeologousGroupsoftheAlienChromosomes0f Triticumaestivum-LeymusmulticaulisDisomicChromosome AdditionLineLine24UsingSSRMarkers GUOGuang—yan', LIRui—fen.,ZHANGJing—yuan., GERong—chaol, ZHAOMao—lin.,SHENYin—zhu'.HUANGZhan-jing' (1?CollegeofLifeScience,HebeiNormalUniversity,Shijiazhuang050016,China; 2?BeijingAgricultureBiotechnologyResearchCenter,BeijingAcademyofAgricultural andForestrySciences,Beijing100089,China) Abstract:Ofthe227wheatmicrosatelliteprimepairsusedtoamplifyprOductsfrO mLey?琊"?蹦ltica蹦lis. /OshowedpolymorphismsamongLeymusmulticaulis , thecommonwheatparentsChineseSpringand FengkangNo?13oftheTriticumaestivum— LeymusmulticaulisdisomicchromoSomeadditionlineLine24 wh.chwas'oleranttoBarleyYellowDwarfVirus(BYDV).These76primerpairscanbeusefulforidentifying thehomoeologousgroupsofthealienLeymusmulticaulischromosomesofLine24 . Amongthem,4couldam— plifysameproductfromLine24andLeymusmulticaulis ,butdifferentfromChinesespringandFengkangNo. 1j?lhesameresultwasobtainedwhenusing7differentmonosomicchromosomeadditionlin eswhoseDarents wereLine24anddifferentcommonwheatvarietiesastemplate. Therefore,these4microsateliltescouldbeused asmolecularmarkersforthealien~ymusmulticaulischromosomesofLine24 .Accordingtothelociofthe productsofthose4microsatelliteprimepairsinwheat ,itcanbeconcludedthattheLey"z蹦s"z蹦ltic口蹦lischro— moSome.ofLine24mightcontainthefragmentsof3Xm(Ns),5Xm(Ns),6Xm(Ns)and7Xm(Ns)chromo— SomesOtLey".蹦 s"ulticaulis?Theymusthaveexchangedchromosomefragmentseachothe r. Keywords:SSR;Leymusmulticaulis;Aliendisomicchromosomeadditi online;Allenchromosomes;Homoe— ologousgroups 4期郭光艳等:利用SSR鉴定普通小麦一多枝赖草二体异附加系Line24中外源染 色体同源群的归属15 大麦黄矮病毒(BYDV)引起的小麦黄矮病常造 成小麦产量锐减.而在小麦的多年生近缘属中蕴含 着丰富的遗传资源和广泛抗性_lJ,其中赖草属和偃 麦草属(Thinopyrum)有很高的抗性_2-4].目前利 用中间偃麦草(Thinopyrumintermedium)为抗源 的工作进行得较为深入.已育成一些抗黄矮病的部 分双二倍体,附加系和一些易位系.但实践证 明单一抗源随着时间和环境条件的变化,可能会造 成抗病性的降低,甚至丧失.因此,利用多种抗源进 行抗源轮换,或基因累加育成多抗品种,才能更好地 控制小麦黄矮病. 1991,1993年,赵茂林先生首次选育出普通小 麦一多枝赖草12种(缺少第4,第5同源群)15个互 不相同的二体异附加系[5-7].采用我国小麦BY— DV的主流株系GPV感染的麦二叉蚜接种返青幼 苗,对不同的普通小麦一多枝赖草二体异附加系抗 黄矮病特性进行鉴定,发现附加一对来源于多枝赖 草第3部分同源群(附加3Xm(Ns))染色体的附加 系Line24表现为高抗,其抗BYDV水平相当于甚至 高于目前国际公认的抗病对照无芒中4,是一个新 的黄矮病抗源].酶联免疫反应测定和病圃接种 鉴定结果,确定Line24对我国流行的大麦黄矮病毒 主流株系GAV—Ma和西方国家流行的主流株系 PAV也表现高度耐性(赵茂林).贾继增先生用 RFLP对这些普通小麦一多枝赖草二体异附加系进 行研究时发现,除含有多枝赖草第一部分同源群染 色体的附加系外,其他附加系中附加的多枝赖草染 色体本身已经发生了相互易位.因此,利用多态性 高的分子标记对Line24进行准确鉴定,是标记来源 于多枝赖草耐黄矮病基因的基础. 1材料和方法 1.1材料 本试验所用材料多枝赖草(2n=4x=28),普通 小麦一多枝赖草二体异附加系Line24(2n=44=22II) 表17个小麦一多枝赖草单体异附加系系谱 ?CT? llllilCULTURll| l?睚-LI-SIHIH 及Line24培育过程中的普通小麦亲本中国春和丰 抗13,7个源于Line24的单体异附加系(2n=43= 21II+1I)及其小麦亲本(系谱见表1),均由北京市 农林科学院北京农业生物技术研究中心草业生物技 术研究室赵茂林研究员提供. 1.2引物合成及PCR条件 按照R6der等9]发表的微卫星引物序列,由上 海博亚公司合成227对引物,微卫星引物序列见相 关文献【9j. PCR扩增反应的总体积为20L:10×PCR buffer2L,dNTPs(各2mmol/L)2L,25mmol/L MgCI21.4L,2~.mol/L上下游引物各2.5L,Taq 酶1U,10ng/LDNA6L,ddH2O5.9L. 扩增程序为:94?预变性4min,再按每个循环 94?1min,50?,55?或60?1min,72?1 min扩增35个循环,最后72?延伸10min.PCR 扩增在PerkinElmer9700PCR仪上进行. 1.3PCR结果的电泳检测 20LPCR反应产物加入6LLoadingbuffer (98%无离子甲酰胺,10mmol/I.EDTA(pH8.0), 0.25%二甲苯青,0.25%溴酚蓝),94?变性5min 立即放入冰中冷却5min,使之保持变性状态.变性后PCR产物经6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,银 染检测. 2结果与分析 用227对小麦微卫星标记引物对多枝赖草,普 通小麦一多枝赖草二体异附加系Line24及Line24 培育过程中用到的小麦亲本中国春和丰抗13核 DNA进行PCR扩增,其中有76对引物可在多枝赖 草和中国春及丰抗13间扩增出多态性标记.这76 对微卫星标记引物中,共有4对引物(WMS133, wMS190,wMs3l4和WMS400)从Line24中扩增 出和多枝赖草相同的特异带:WMS133—310bp, WMS190—175bp.WMS314—135bp和WMS400— 190bp,而从Line24的小麦亲本中国春和丰抗13扩 增出与此不同的扩增带,随后又用这4对引物对 Line24与普通小麦杂交得到的7个单体异附加系 (系谱见表1)进行PCR扩增来验证,发现从这7个 单体异附加系中也能扩增出与多枝赖草和Line24 相同的扩增带,而从它们各自的小麦亲本中扩增出 的产物与这些特异带不同.因此,wMS133— 310bp,WMS190—175bp,WMs314—135bp和 ?CT? ?ilRICULTURAE ?雌_U一0删 华北求q毒 WMS400一l90bp可作为Line24中多杖赖草染色体 片段的分子标记WMSI33,WMSI90,wMs314和 4一 WMS400的扩增结果分别见图I, 鼋4l5】6—'4"--L23al, 1marker{hp):2多枝赖草;3L[ne24;4中国春;5丰抗136单 体跗加幕933;7单件附加系934:8单件附加系9359单体附 加系936;l0莱州"053;tJ单体附加系937.】295品J66.2;J3 单件附加采939;14京冬6号:15单件跗加系94l;1641I 图1普通小麦一多枝赖草种质材料豆 亲本微卫星WMSI33的扩增产物 囊一 1marker(bp);2多檀赖草;3Line24;4中国舂:5丰抗13;6单 体附加系933;7单体附加系934;8单休附加系935;9滩附 加系936;10藁州953;11单体附加系937;1295品L662;13 单体附加系939;14京冬6号;15单体酎加系941;16京4lI 围2普通小麦一多枝赖草种质材料丑 亲本微卫星WM5190的扩增产物 Jmarker(bp);2多挫桢草.3Li-re24.4.干J日存;5丰抗l3;6单 悼舯旬lI系933.7单体附加系934:8悻附?系tJ35;蒙州 g53;10单淖附加幕937;1195品I662;12体跗栅系939. 13冬6;l4单件附力l1系94I;I5球tI 围3普通小麦一多柱赖草种质材料 汪亲本微卫星WMS314的扩增产物 I23456789l0IlI2I3【4】5l6 20l l9t1 I? marker{hp);2多枝赖草;3Line24;4.川习睁:5丰抗I3;6单 津附加系9337单体附加系9348单体附加最935:9单体附 加系936:10莱州953;11体附加系937;J295品l662:I3 单悼跗系939;I4求冬6号;l5单体附加系q41:16京4I1 图4普通小麦一多柱赖草种质材料 爰亲本微卫星WMS400的扩增产物 wMS133.wMS190,wMS3【4和wMs400在 小麦染色体上的定位见表2从襄2可以看出. WMSI33被定位于小麦6B染色体短臂靠近着丝粒 表2WMSI33,WMSIgO,WMS314,WMS400在小麦染色体上的定位,序列,退火温度,爱从小麦与if,枝赖草中扩增产物比较 注:imp错不完美的简单重复序列,扩增片段挺度数据a为(日tRIb为SynIh%'7984为横掘时的觳据 附近.WMS190技定位于小麦5D染色体短臂端部染色体片段相互易位形成的. W附近'w:3讨论MS400被定位于7B染色体短臂端部附近.根据 基因的共线性关系,Line24中附加的外源染色傩不赵茂林曾采用同工酶等电聚焦技术鉴定出 止来源于一个同漾群.而是包含了多枝赖草第3,第line24来源于多枝赖草的第三部舒同源群贾继增 5,第6和第7部分同源群的遗传物质,因此推测这先生用RFLP分子标记对Line24进行研究.初步发 对附加的多枝赖草染色体是由这4个部分同源群的现其中的多枝赖草染色体可能是由不同部分同源群 l—l 4期郭光艳等:利用SSR鉴定普通小麦一多枝赖草二体异附加系Line24中外源染色体同源群的,J3 染色体相互易位形成的.Peil等.用小麦SSR引 物对Triticumaestivum—Aegilopsmarkgrafii二体 异附加系进行扩增,研究了Aegilopsmarkgrafi染 色体与小麦染色体的同源群关系,Iqbal利用SSR 成功鉴定了小麦一单芒山羊草(Aegilops"lartsta Vis.)7N染色体异附加系l,为使用微卫星标记鉴 定外源染色体的同源群归属提供了新思路. 本文首次用微卫星标记这种简单有效的方法对 Line24进行了研究,发现微卫星引物wMS314(被 定位于小麦染色体3D长臂上)能从Line24和多枝 赖草中扩增出相同的产物,表明Line24中含有来源 于多枝赖草第3部分同源群的遗传物质,这与赵茂 林采用生化标记对Line24鉴定的结果相一致.但 除此之外,还有分别位于小麦5D,6B和7B染色体 上的小麦微卫星引物能从Line24和多枝赖草中扩 增出相同的产物,表明Line24中附加的多枝赖草染 色体已经发生了相互易位,包含多枝赖草第3,第5, 第6和第7部分同源群的遗传物质. Hsiao等u2J和李瑞芬u3J曾在异花授粉的蒙古 冰草(PP)和航道冰草(PP)F.花粉母细胞减数分 裂中期I观察时发现有三价体和四价体的出现,推 断其中一个基因组中的两条染色体之间发生了相互 易位.由此推测,同样是异花授粉的多枝赖草,在系 统发生过程中也很有可能在不同染色体间发生相互 易位.赵茂林曾观察到多枝赖草花粉母细胞减 数分裂中期I有四价体出现,说明多枝赖草染色体 片段间相互易位是很有可能的. 参考文献: [1]QianYT.ZhouGH,ZhouXM,eta1.Screeningthe sourceofresistancetObarleyyellowdwarfvirusforwheat inChina[A].In:LIzS.Procof8thInWheatGenet Symp[c].Beijing:ChinaAgriculturalScientechPress. 1993.933—936. 【2]LaiknPJ,RrettellRIS,BanksP.Identification,charac. terization,andutilizationofsourcesofresistancetObarley yellowdwarfvirus[A].In:BurnettPA.WorldPerspec. fivesonBarleyYellowDwarf[c].Mexico:CIMMYT, ?CT? tillICULI'URllE l?睢IILI-S啊I? l990. [3]ComeauA.Laresistanceauxpucerons:aspectstheoriques etpratiques[A].In:Vincentc.CoderreD.LaLutteBi? ologique.Boucherville[C].Canada:GaetanMorin,1992. [4]PlourdeA,ComeauA.St.PierreCA.Barleyyellow dwarfvirusresistanceinTriticumaestivum×Leymus angustuShybrids[J].PlantBreeding,1992.108:97— 103. [5]赵茂林.普通小麦一多枝赖草二体附加系的选育与鉴 定[D].北京:中国农科院研究生院,1993. 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