[doc] 载脂蛋白C1保护内皮细胞拮抗低密度脂蛋白损伤的实验观察

[doc] 载脂蛋白C1保护内皮细胞拮抗低密度脂蛋白损伤的实验观察 载脂蛋白C1保护内皮细胞拮抗低密度脂蛋 白损伤的实验观察 8一{O 圉2 ;斗弓.动翮,,弓码样张{拳最1呔虔.脂煞白是 中华病理学杂志1992年第2j卷第1期 保护内皮细胞拮抗 白损伤的实验观察’ 卫生部北京老年医学研究所,刘清华中国人民解放军石家庄空军医院垂互黎健蒋雷王惠君李健斋马正中 周景林 摘要以体外培养的内皮细胞(Ec)为模型,观察高密度腊蛋白(HDL)和载脂蛋白C,(apoC.)在保 护EC免受低密度脂蛋白(LDL)损伤方面的作用.结果表明:预加入HDL或apoC.(100#g/m1)细胞 再受到较大剂量(1500#g/m1)的LDL损伤时仍有相对正常的形态,较低的乳酸脱氢酶释放率和较高 的前列环素合成量;而单纯加入LDL后的细胞则显示胞体收缩等明显的损伤性改变提示HDL和 apoC均能部分拮抗LDL对EC的损伤,可能在抗动脉粥样硬化方面 发挥作用. 关键词内皮脂蛋白类,低密度动脉硬化脂爱白类,高密度 动脉内皮细胞长期反复受损是动脉粥样硬 化(AS)病变形成的始动环节实验表明血液中 过量的LDL是引起EC损伤的有害因子,而 HD]则可对EC起保护作用”.本文用已 知保护因子HDL作对照,比较观察作为 HDL组成蛋白的apoC,在保护EC免受 LDL损伤方面所起的作用,进而探讨apoC 在AS发病中可能存在的影响. 材料与方法 一 EC的分离和培养 参照Jaffe等的醇消化法0消化酶为0.25%胰 酶(美国Difco1:250】,培养液是含20%小牛血清的 M.帅(荚国GIBCO). 一, 人血清脂蛋白和载脂蛋白的分离 LDL和HDL经垂直转头离心法获得,经透析, 浓缩,抽滤除茁后使用apoC.经由VLDL脱脂后 过Se瑞士 POLYVAR】下观察EC形态变化并在加入LDL后的 24,48小时随机取视野摄片.电镜观察:加入 LDL48小耐后,常规制备.切片,染色,透射电镜 (日本JOEL)下观察EC超微绪掏变化. 2细胞计数:加入LDL后舶48,72.96小时, 用O.01%胰酶+0-.02%EDTA分散细胞层,制成细胞 悬渡后滴加1%台盼蓝染渡,计数死活细胞数,以对 照组细胞为)oo%,计算细胞存活率. 3乳酸脱氢酶(LDH)释放:分别收集培养渡(Us) 和细胞层(uc】,Uc经2%Triton)l00破膜,自动 化分析仪(美国Encore)酶法测定Us.Uc的LDH含 量,据下式计算LDH释放百分比. LDH释放%=Us/(Us+Uc)×100% 4.6--酮一前列腙素F1a(6-keto-PGF~)测定加入 LDL48小时后,每m】培液用5ml乙酸乙酯(北京化 工厂,重蒸优级纯)提取两次,放射免疫法测定 6-keto-PGF1,的含量 实验结果 一 形态观察 原代汇合EC为多角形细胞,单层,镶嵌 排列(图1).加入LDL1500#g/ml48小时 后,EC大部分脱落,残存细胞明显收缩致使 胞体形状不规则.多呈分支状(图2).预加入 ‘车系国家自然科学基金资助项目 一邮政编码1oo730 C蛋 白脂蛋度 脂密载低 HDL或apoC100~tg/ml孵育l9小时再加 人LDL48小时后EC数量未见明显减少,形 态电大致正常,2组胞体呈长多角形,而3组 胞体略显不规则(图3,4)透射电镜见两组细 胞超微结构均大致正常,除内质网,核糖体等 细胞器外,在少数细胞的部分区域可见成堆的 小线粒体,特点为体积小,基质深染,内室扩 张(图5).LDL组细胞胞膜下含丰富的饮液泡 胞浆微丝减少,线粒体肿胀,内质网扩张,脂 滴和溶酶体数量显着增多(图6J. 二,细胞数量 细胞计数结果见表l 表1细胞存活率(%) 三,LDH释放 结果见表2.由表2可见LDL组LDH 释放比其它三组高达三倍,差异有非常显着性 (P<0.001)apoC,组和HDL组的值接近,稍 高于对照组. 表2LDH释放百分比和6-Keto—PGFI含量 (g/m1)一的关系 ‘各组114一各组116 四,6—keto-PGF1测定 由表2可见LDL组的6-keto—PGF】含 量显着低于对照组,HDL组和apoC组 (尸<0.05,P<0.001,P<0.oo1).与对照组 相比,HDL组显着增高(尸<0.05)apoC,组虽 有增高但差异无显着性(尸>0,05),apoC.组 低于HDL组<0.05). 讨论 一 ,EC收缩是细胞受损的形态标志 研究结果表明,随培养液中加入的LDL 量的增大和作用时间的延长,EC出现明显收 缩,胞浆呈分支状,最后发生自溶和脱落等变 化,这与国内外研究结果一致….而在培液 中预加入HDL或a口OC后再施加入LDL损 伤,细胞数量未见明显减少,形态仅有轻微改 变,未出现典型的分支状胞浆,这一结果从形 态学角度表明apoC与HDL一样具有部分 拮抗LDL损伤的能力. 二,LDH释放是EC受损的定量指标 LDH为正常存在于细胞内的酶类,当细 胞膜受损时从细胞内透出.细胞外液酶量的多 少可间接反映细胞损伤的程度.,原因可能是(1)LDL造成大部分细 胞死亡脱落,致使单位培养体积中EC数量减 少,因而PGI,合成量减少;(2)LDL含较多 的脂质过氧化物,它是PGI合成酶的特异性 抑制剂HDL组和对照组相比 6--kcto—PGFl量显着增多(尸<0,05). 综上所述,apoC和HDL可以部分拮抗 LDL对EC的损伤作用.提示apoC和 HDL一样,也具有抗AS作用.本实验为AS 的防治研究提供了新的线索 (本文图1,6见插页第2页) 参考文献 HenriksonT,eta1.Injurytoculturedendothelialo011in- ducedbylowdensi~?poprotein—protecdonbyhigh O denslDlipoprotein--——protectionbyhighdensity lipoproteinSc~ndJClnLabinvest.1979.39:369 2JaEA,etalCultureofhumanendothelialcellsderived L,mumbilicalveinsIndentificationbymorphologicand immunologiccriteriaJOlinInvest,1973,52:2745 3孛振甲等6一蒯一前l刊腺素Fla的测定.见李振甲,主编 实用放射免痤学北京:科拄文献出版社,】989.21】 4狂钟前列环素与动脉粥样硬化衡阳医学院,1987 {增刊),46 (收稿:I990—12-4修回:I991_%一20j TheprotectiveeffectofapolipoproteinC1onendothelialcellsinjuriedbylowdensitylipoprotieninvitro LiuQing_huaetal BeijingInstituteofGeriatrics,MinistryofpubUcHeal~,PR.China100730? Highserumlowden~tylipoprotein(LDL)levelisknowninjurioustoendothelialcelt(Ec)andthathighden- sitylipoprotein【HDL)protectsECfromsuchinjury. TheprotectiveeffectofHDLandapolJpoproteinC.(apoC1)ontheendothelialcells(EC)isolatedoriginally fromhumanumbilicalveinandinjuredbyLDLwasstudiedmorphologicallywithphase-contrastandtransmis— sionelectronmicroscope.Additionally,theirfunctionalchangesweredetecte dbymeasuringtheamountoflactate dehydrogenase(LDH)and6-keto-prostaandinFlu(PGFl)mlearedTheECWeredividedintofourgroups: control,HDL+LDL,apoC+IDLandLDLgroup.ECafterbeinginjuredbyLDLshowedcellcontraction,in- creasedreleaseofLDHanddecreasedsecretionofPGF1Anyhow,theywouldbeleftnormalonmorphology. LDHreleaseandPGFt,synthesisifHDLorapoCLhadbeenaddedtOtheculturemediabeforeLDLinjuryThe resultsindicaWA.thatbothHDLandapoC1canresisttheinjuriouseffectofLDLontheculturedEC. KeywordsEndotheliumLipoproteins,LDLArteriosclerosisLipoproteins,HDL 中华医学会病理学会第一次全国中青年学术会议在厦门市召开 中华医学会病理学会于1991年11月lI,15日在厦门市召开了第一 次全国中青年学术会议.全国各地共 299名代表出席了会议.会议共收到7卯篇,经过评审有259篇在 会议上交流,其中大会交流15篇,分组 交流179篇,书面交流65篇.交流的论文涉及面广,选题起点高,其中 有些论文内容是目前国际上最前沿的病 理研究课题.论文的研究工作基本上都是在国内进行的通过代表们 的努力和评委会的认真工作,评选出优秀论 文1O篇.这次盛会体现了继承和发展的结合,理论和技术的结合.作 为优秀论文评委的我国病理界老前辈,看到 有这样一批病理优秀人才脱颖而出,十分欣慰,他们期望年轻的一代 不断奋进攀登,使我国病理事业兴旺发达. 本次获奖论文为: 粱英杰(中山医科大学):强渡在特殊染色和免疫组化染色中的应用: 量 图6 载脂蛋白C1保护内皮细胞拮抗低密度 脂蛋白损伤的实验观察 2 (正文见8页) ? 体 器 礼 一