维生素A和维生素E的测定方法

维生素A和维生素E的测定 维生素A和维生素E的测定方法(HPLC) 高效液相色谱法 最小检出量分别为VA:0.8ng;α-E:91.8ng;γ-E:36.6ng;δ-E:20.6ng。 1.原理 食物中的维生素A及维生素E经皂化提取以后，将其不可皂化的部分提取到有机溶剂中。用HPLC法测定维生素A及维生素E的含量。 2. 适用范围 GB12388-90 本法适用于各种食物和饲料的测定 3. 仪器 (1) 高压液相色谱仪(带紫外检测器) (2) 六孔恒温水浴锅 (3) 旋转蒸发器 (4) 高纯氮气 (5) 高速离心机 4. 试剂 本实验所用试剂皆为纯，所用水皆为蒸馏水 4.1 无水乙醇:重蒸，不含有醛类物质 检查方法:取2ml银氨溶液于试管中，加入少量乙醇，摇匀，再加入10%氢氧化钠溶液，加热，放置冷却后，若有银镜反应则表示乙醇中有醛。 脱醛方法:取2g硝酸银溶于少量水中。取4g氢氧化钠溶于温乙醇中。将两者倾入1L乙醇中，振摇后，放置暗处两天(不时摇动，促进反应)，经过滤，置蒸馏瓶蒸馏，弃去初蒸出的50ml。当乙醇中: 4.2 10%抗坏血酸溶液(Vc) W/V 临用前配制 4.3 50%氢氧化钾溶液(KOH) W/V 4.4 无水乙醚 重蒸，不含过氧化物 4.4.1 过氧化物检查方法:用5ml乙醚加1ml10%碘化钾溶液，振摇1min，如有过氧化物则放出游离碘，水层呈黄色或加4滴0.5%淀粉液，水层呈蓝色。该乙醚需处理后使用。 4.4.2 去除过氧化物的方法:重蒸乙醚时，瓶中放入铁丝或铁末少许。弃去10%初馏液和10%残馏液。 4.5 pH 1-14试纸 4.6 无水硫酸钠 Na2SO4 4.7 甲醇 色谱纯或分析纯重蒸后使用 4.8 重蒸水 蒸馏水中加入少量高锰酸钾重蒸后使用 4.9 苯并〔e〕芘液 称取苯并〔e〕芘(纯度98%)，用脱醛乙醇配制成1ml相当于5μg苯并〔e〕芘的内标溶液。 4.10 维生素A标准液 视黄醇(纯度85% Sigma公司)用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。维生素E标准液 α-生育酚(纯度95% Sigma公司)，δ-生育酚(纯度95% Sigma公司)，δ-生育酚(纯度95% Sigma公司)。用脱醛乙醇分别溶解以上三种维生素E标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg。临用前用紫外分光光度法分别标定此三种维生素E的准确浓度。 5. 操作步骤 本实验需避光操作 (1) 样品皂化 称取样品于三角瓶中，加30ml无水乙醇，振摇三角瓶，使样品分散均匀。加入5ml 10%抗坏血酸和苯并〔e〕芘标准液2ml，混匀。最后加入10ml氢氧化钾边加边振摇。于沸水浴上回流30min使样品皂化完全。皂化后立即放入冰水中冷却。 (2) 样品萃取 将皂化后的样品移入分液漏斗中，用50ml水分2次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。用100ml无水乙醚分两次洗皂化瓶及残渣，乙醚液并入分液漏斗中。轻轻振摇分液漏斗2min，静置分层，弃去水层。然后每次用约100ml水将乙醚液洗至中性，约4-5次。 (3) 浓缩 将乙醚提取液经无水硫酸钠(约5g)滤入150ml旋转蒸发瓶内，用约 15ml乙醚冲洗分液漏斗及无水硫酸钠2次，并入蒸发瓶内，并将其接在旋转蒸发器上，于55?水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩下约2ml时，取下蒸发瓶，立即用氮气将乙醚吹干。加入2ml乙醇溶液，充分混合，溶解提取物。将乙醇液移入塑料离心管中，于离心机上以3000转/min离心5分钟。上清液供色谱分析。 (4) 标准曲线的制备 将维生素A和维生素E标准品配置成标准溶液(约1mg/ml)，制备标准曲线前用紫外分光光度法标定其准确浓度。标准浓度的标定方法 取维生素A和维生素E标准液若干微升，分别稀释至10.00ml乙醇中，并分别按给定波长测定各维生素的吸光值。用比吸光系数计算该维生素的浓度。测定条件如下 标 准 比吸光系数E1%cm 波 长 λ，nm 视 黄 醇 1835 325 α—生育酚 71 294 γ—生育酚 92.8 298 δ—生育酚 91.2 298 浓度计算: X1= A/E×1/100×10.00/S×10-3 式中 X1:某维生素浓度，mg/ml; A:维生素的平均紫外吸光值; S:加入标准的量，μL; E:某种维生素1%比吸光系数; -3 10.00/S×10 :标准液稀释倍数。 本法采用内标两点法进行定量。把一定量的维生素A、维生素E及内标苯并〔e〕芘液混合均匀，选择合适 的灵敏度，使上述物质的各峰高约为满量程的70%，作为高浓度点，高浓度的1/2为低浓度点(内标苯并 〔e〕芘的浓度值不变)，用此二种浓度的混合标准进行色谱分析。根据微处理机装置，按说明用二点内标 法进行定量。 液相色谱分析 仪器所需条件 预柱:ODS 10μm，4mm×4.5cm。 分析柱:ODS 5μm，4.6mm×25cm。 流动相:甲醇:水=98:2。混匀，临用前脱气。 紫外检测器波长:300nm。量程0.02。 进样量:20μL进样定量环。 流速:1.65-1.70mL/min。 6. 计算 X=C/m×V×100/1000 X:某种维生素的含量，mg/100g; C:由标准曲线上查到某种维生素含量，μg/mL; V:样品浓缩定容体积，mL; m:样品质量，g; 用微处理机二点内标法进行计算时，按计算计算或由微机直 接给出结果。 7. (1) 维生素A极易被破坏，实验操作应在微弱光线下进行，或用棕色玻璃仪器。 (2) 在皂化过程中，应每5分钟摇一下皂化瓶，使样品皂化完全。 (3) 提取过程中，振摇不应太剧烈，避免溶液乳化而不易分层。 (4) 洗涤时，最初水洗轻摇，逐次振摇强度可增加。 (5) 无水硫酸钠如有结块，应烘干后使用。 (6) 在旋转蒸发时，乙醚溶液不应蒸干，以免被测样品含量有损失。 (7) 用高纯氮吹干时，氮气不能开的太大，避免样品吹出瓶外结果偏低