嗜酸乳杆菌素的初步研究（可编辑）

嗜酸乳杆菌素的初步研究（可编辑） 嗜酸乳杆菌素的初步研究 陕西科技大学 硕士学位论文 嗜酸乳杆菌素的初步研究 姓名:周玲 申请学位级别:硕士 专业:食品科学 指导教师:董文宾;吕嘉枥 20030530 嗜酸乳杆菌素的初步研究 摘要 本文初步研究了嗜酸乳杆菌的生物学特性及其产生的细菌素分离、纯化、 鉴定和部分特性。结果表明:?两个菌株都具有嗜酸乳杆菌典型特性。革兰 氏阳性,无鞭毛、无芽孢,氧化酶、接触酶阴性,能够利用葡萄糖、海藻糖、 半乳糖、乳糖、甘露糖、棉籽糖、纤维二糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、密二糖, 不能利用鼠李糖、山梨醇、甘露醇、木糖、阿拉伯糖;能分解七叶灵,硝酸 盐还原、葡萄糖酸盐氧化阴性;?具有良好的耐酸性能力,在值为.以 .、.、.、.、.的培养基中 上的培养基中可以正常生长,在 放置~小时后,接入新鲜培养基中仍能继续生长,能耐受人体胃液 酸性环境;?具有良好耐受胆盐的能力,能在含有.%,.%、.%、. %、.%胆盐的培养基中生,长,可以在人的肠道内存活;?对青霉素中敏, 对氨苄青霉素敏感。 初步研究了采用硫酸铵盐析粗提嗜酸乳杆菌素的方法,确定的提取条件 为:培养液于?下保温,离心?、×、取上清液, 用%将值调至,缓慢加入硫酸铵至饱和度为%,磁力搅拌 小时,离心?、×、,沉淀悬浮于无菌水中,采用截留分子 量为的透析袋透析。 为了进一步鉴定细菌素采用了?,确定的电泳条件为:分离胶浓 度.%,交联度%,尿素:浓缩胶浓度%,交联度%;恒流电流, 起始电压~,逐渐升至~;培养液浓缩倍上样量为 产生的细菌 。得到的细菌素经?显示出单带,. 素分子量略小于.,而上. 产生的细菌素约为.,对 金黄色葡萄球菌具有抗性。 通过单因子试验研究了影响两株嗜酸乳杆菌产生细菌素的因素,结果表明: ?蛋白胨的种类对嗜酸乳杆菌产生细菌素有较大影响,采用鱼蛋白胨配 制成的液体培养基培养.时,.生长极为缓慢, 说明该蛋白胨不适合于.的生长和产生细菌素;以干酪素为氮源 制作培养基培养.时,其代谢产物中含有大量的蛋白质,而 且有很大一部分来源于培养基,产物难以提纯;采用动物蛋白胨配制成 液体培养基培养.时,其代谢产物中含有的蛋白类物质比较单纯, .表明.分泌到胞外的蛋白种类少,易于提纯。?培养 培养小时 时问对嗜酸乳杆菌产生细菌素的影响不太大,. 培养小时后收获时蛋白 后收获时蛋白类物质含量最大,. 类物质含量最大,但培养小时后仍然有较大量的蛋白质类物质,但中问有 一段时间~小时内蛋白质较少。 关键词: 嗜酸乳杆菌,细菌素,特性,研究 , 、 、 .、’, 、 、,、?,、 ’ 、 ., .. . 。、 、 . . .%,.%、.%、.%、.%~ .、.、.、.、... . , , ? . . × .%, ?. × . ... ,%.% % “” % “”. ~, ~ “’’ “一 . , ,?.,. . . . , . , 。 . . 、】 : ,,,第一章 文献综述 乳酸菌是个俗称,它是一类能发酵碳水化合物产生乳酸的细菌的总称。目 前在自然界已发现的这类细菌在细菌分类学上划分出至少个属。其特点为: 革兰氏阳性,杆状或球状,裂殖,营养复杂,以单糖葡萄糖、果糖、半乳糖、 双糖蔗糖、麦芽糖、乳糖为基质通过同型或异型发酵获得能量,终产物主 要为乳酸,厌氧或兼性厌氧。乳酸菌一般没有蛋白酶,只有肽酶,不能分解利 用蛋白质而仅能利用蛋白胨、肽和氨基酸。合成氨基酸、核酸、维生素的能 力 极低,因而必须在培养基中添加这类物质,促进乳酸菌的正常生长。常见乳酸 菌都不具有细胞色素氧化酶,不能还原硝酸盐,不具有氨基酸脱羧酶,不产生 胺类物质,也不产生吲哚和:,不形成内生孢子,无运动性或仅少。常定居 在人、动物体内,一些位于在嘴、鼻粘膜中,还有一些位于消化道、肠道双 歧杆菌、肠球菌和一些乳杆菌和阴道粘膜~些特殊乳杆菌中。在这些生 境小区里,它们不仅不致病反而有益,能抑制~些腐败菌和病原菌,维持体内 这些小生境内,尤其是肠道内正常的微生态平衡。其中嗜酸乳杆菌和双歧杆 菌 几乎成为益生菌的代名词,合称菌:嗜酸乳杆菌,:双歧杆菌。其益生 作用主要有:?抑制病原菌和抗感染,菌能通过磷壁酸与肠粘膜上皮细胞作 用,占据肠粘膜表面,形成屏障,另外它们在生长过程中产生大量以乳酸为主 的有机酸,造成肠内低和低环境,促进肠蠕动,阻止致病菌的入侵和定 殖;?增强免疫力,菌菌体具有激活腹膜巨噬细胞、产生干扰素、促进细胞 分裂、产生抗体、活化机体免疫力的功能;?降低胆固醇,菌能抑制羟甲基 戊二酸辅酶还原酶,从而降低胆固醇含量;?控制内毒素,菌可抑制肠道 中腐败菌的繁殖,减少肠道中内毒素及尿酶含量,使血液中内毒素和氨的含量 下降;?预防和抑制肿瘤的发生,菌能分泌一种降解致癌物质一亚硝胺的 酶,预防由亚硝胺引起的肿瘤的发生;?延缓机体衰老,菌抑制了许多腐败 菌、致病菌的生长,从而减少了这些细菌产生的毒胺、靛基质、吲哚、氨、粪 臭素、硫化氢、致癌物质和其它有毒物质,减慢机体衰老过程:?抗辐射,这 可能是因为它们的代谢产物有保护造血系统和抗突变的作用““。 /属于乳杆菌属,化能异养型, 嗜酸乳杆菌 发酵分解糖代谢终产物中%以上是乳酸,是宿主人和动物肠道中的重要 微生物。当体内嗜酸乳杆菌达到一定数量时,具有保持肠道内的微生态平衡、 防止由抗生素引起的腹泻、急性感染性腹泻、降低胆固醇水平”、消除乳糖不 耐症、甚至还具有增强机体免疫力、协助治疗包括爱滋病在内的免疫系统疾病 ”、延缓衰老、预防与抑制肿瘤、抗突变”“等作用。它对致病性大肠埃希 氏菌、金黄色葡萄球菌、炭疽杆菌”。以及一些腐败菌都有一定的抑制作用。更 难能可贵的是它还具有较强的耐酸及耐受胆盐的能力,能顺利通过胃肠道环境 而定殖于大肠内,充分发挥其健康促进效果“。。 .乳酸菌的主要代谢产物 乳酸菌的代谢物种类繁多,资料显示主要包括有机酸、乙醇、。、。:、 双乙酰、乙醛、一羟基一一丁酮、丙酮、一庚酮、一壬酮以及低级饱和脂肪酸 与脂肪醇所形成的带有水果香味的酯类等风味物质等,另外,还有一些能产生 细菌索、非蛋白抑菌物质等。 ..有机酸 乳酸菌发酵碳水化合物产生乳酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、正反丁烯二 酸、戊酸、琥珀酸等有机酸“”?,乳酸菌产生乳酸有两种发酵形式:同型发酵 和异型发酵。乳杆菌一般进行同型发酵,得到的有机酸中%以上为乳酸,反 应式如下: 。,。??? 而大多数乳球菌则进行异型发酵,它们将碳糖转化成乳糖、乙醇、。,有时 还产生乙酸,甘油等副产物。反应方程如下: 。。??? ,??寸?。。 因此在乳酸菌生长过程中环境值不断下降,从而抑制对酸耐受能力差 的细菌,其中包括许多病原菌和腐败菌,作用机理如下:在低口值条件下, 未解离的乳酸和乙酸渗透到敏感菌细胞膜,改变膜电位,影响膜的通透性,阻 碍物质传递和降低定位于膜上的、酶的活性,阻止病源菌定居肠黏膜。 风味物质 乳酸菌产生的风味物质主要为双乙酰,一丁二酮““和乙醛 ““。双乙酰是乳酸菌代谢的末端产物,葡萄糖经或途径产生丙酮酸, 后者转化为。一乙酰乳酸,它经非酶氧化脱羧反应产生双乙酰,很多普通的乳 杆菌具有这种能力。双乙酰具有乳香味和抗菌能力,常被加入乳制品中,它对 许多微生物包括病原菌如结核分枝杆菌脱都有抑制作用。 等实验证明,几个的双乙酰就能抑制大肠杆菌。也发现浓度 为?/的双乙酰对酵母和革兰氏阴性菌具有抑制作用,浓度为/ 时对非乳酸革兰氏阳性菌也有抑制作用,而浓度小于/时不能抑制乳 酸菌的生长。研究表明,双乙酰是通过与精氨酸定位蛋白作用,干扰对精氨酸 的利用来达到抑菌目的的。 ..过氧化氢 在有氧环境下,乳酸杆菌在其自身的氧化酶或脱氢酶的作用下生成过氧化 氢,反应机理如下/: 丙酮酸;:?????乙酰磷酸十。如 丙酮酸氧化酶 乳酸十。??????????丙酮酸。。 一乳酸氧化酶 乳酸。?????????????丙酮酸:: 非依赖性一乳酸脱氢酶 ???????????????????????。 氧化酶 过氧化氢酶的缺乏导致过氧化氢在环境中累积,从而对其它敏感菌产生抑 制作用。:的致死作用可能来自于它通过氧离子链反应使某些重要的生物大 分子失活,另外,过氧化氢还可以参与其它反应,生成抑菌物质,如:生乳中 的过氧化氢可与硫氰酸在乳酸过氧化氢酶作用下,生成具抑制性的氧化中间产 物,此过程称为乳酸过氧化氢酶抗菌系统。另外研究表明。杀灭孢予比杀灭 细菌更为有效。但乳酸杆菌对过氧化氢的耐受能力较高,如醋酸杆菌的最低生 长抑制浓度为 /,而 /的过氧化氢就足以将金黄色葡萄球菌杀 死。 ..非蛋白抑菌物 乳酸菌还产生一类低分子量的高溶解性抑菌物质。年 和 是中性的具有广谱的抗菌活性 发现由 ,。产生的 的非蛋白抑菌物,对一些革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、真菌和原生 菌都具有抑制作用。能抑制或部分抑制影响公众健康的沙门氏菌、志贺氏菌、 梭状芽孢杆菌、葡萄球菌、利斯特菌等。 ”“等在研究?的体外抑菌能力时发现了~种热稳定性的抑菌 ~ 活性物质,该物质分子量为 ,对蛋白酶敏感性低,对革兰氏阳性、 革兰氏阴性菌都有抑制作用。 年? ?等发现来源于人体肠道的 . 分泌一种抗菌物质,它对蛋白酶不敏感,具有广谱抗菌作用,能抑制很多革兰 氏阳性和革兰氏阴性病原菌如:金黄色葡萄球菌、利斯特菌、大肠杆菌、沙 门 氏菌等,但对常见肠道微生物如:乳杆菌、双歧杆菌都没有抑制作用”“。 ..细菌素 年在对大肠杆菌菌株抑制中菌株现象时发现它分泌一种类 蛋白物质,该物质能抑制其它大肠杆菌的生长, ““将其命名为大肠 杆菌素。以后陆续有报道在他种微生物中也有此类物质的存在,同样具有窄 谱 的抑菌特性,”?将它们称作细菌素 ,并定义为由某些细 菌通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌生物活性的蛋白质或多肽类物 质, 其抑菌范围不仅仅局限于同源细菌,产生菌对该细菌素有自身免疫性。 乳酸菌可产生多种细菌素?“,目前己报道的达余种,分别由乳球菌、 明串珠菌、乳杆菌、双歧杆菌、肠球菌、链球菌、肉食杆菌等属产生。但它 们 产生的细菌素的比例、特性和抗菌谱都因种而异, 等报道乳球菌 只有%的菌株产生细菌素,而%的乳杆菌产 生细菌素。这些细菌索无毒、大部分基因位于质粒上少数位于染色体上或染 色体的转座子上、分子量小、含修饰氨基酸、结构复杂。多数细菌素抑菌范 围窄,只能抑制与其产生菌同源或亲缘关系密切的菌株。具体可见表卜。 蘧议 苟鼍一。一。『百酱,、 苟召芑乓而一;一? 一帆卜?勺州一,口口?』 一喀?吾?量卫口蓦互竺?最 ?乱一一一日苗 奢皇二口?卫 一虿一,誓一矗。目?苦靠卫勺磊苦蠢芒《 ‘甘书口基一言量鲁 卫捌矗警妥差 《?竽匕。苫 ?矗管墨毛? 一誉至一奄酱季。音; 一小乱『一言?舔一一小小一日 一小一一百 十 翘最 棼 口 寸【 求口一 嘲蓍 驻 链 礞也 姐 蟋 脚 辅 皿譬 燃 积趟 型蜷函瑚 目 蜡 耍目 置一星。焉芑皇?骞?。。一口 糕如蛙 ?圈擎剿 蜓 黼 疆 口 蔓苎一王 目召日譬【 量篇酱? 口譬莒? 口召暑冀、一 ? ‰ ? 《 ~ 埴 刊 甘 懈韫骣删段粗淄辞求罹.一群 口土曼 ?墨?上童.,】 卜神寸?一、 王芏厶。童。罨 皤善墨鼍鼍苦艺鼍, 甘一崖基 寸。卜啕鼍? 芏,摹高 々蠹 芎 一?? ??石;【甫 奢口一三 《 一。昏西一一置 一謦【三《舌一 口罩;芷 笛喵它。 一一口口一一一?葛?缸苫一西矗苗拦?霉。 :凸昏一《苗。 【西奇崔《《厶 矗日苗?苫.??艺 一【日?一盆 莹。一高苟牙皇?片。一署叫 口;一一 ” 寸 . ,叶寸 一寸 斗 五? 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。 .乳酸茵所产细菌素的分离与鉴定 ..分离与纯化 无论是研究细菌素的性质还是应用,都必须得到一定质量和纯度的细菌 素。细菌素是蛋白类物质,它的提纯方法可以借鉴分离蛋白的许多经典方法。 由报道知:提取细菌素一般分为两步,一是粗提物的制备,二是粗提物的纯化。 细菌素一般都被分泌到生长介质里,首先将产细菌素菌株在特定培养基及培养 条件下培养一定时间后离心去除菌体,得到上清液,通常高分子细菌素提纯时 采用差速离心、梯度离心等方法,而低分子量细菌素采取分级沉淀法和凝胶过 滤法提取。分级沉淀法包括盐析、有机溶剂沉析等,最常用的是硫酸铵沉淀法。 一般采用透析、离子交换色谱脱盐,常用的离子交换柱多为或 柱?’。 粗提物的精纯常采用反相,电泳等方法““,李孱。”等用一 ,用 可萃取疏水性蛋白质的性质,采用温度诱导双水相分离纯化细菌素 响应面法对成相成分一和离子强度进行了优化,最佳浓度分别为 .%?、./、为.、温度?,在此条件下, 的萃取率为%,纯化系数.。 ..乳酸菌所产细菌素的的检测 细菌素的检测方法包括三大类,即液体检测、固体检测和基于对细菌素分 子生物学深入研究的新诞生的分子检测法。液体检测法主要包括生长延迟期 法、比浊法和试管稀释法等,这些方法虽能快速得出结果,但由于操作繁琐, 、 已很少被采用。目前,主要采用固体检测法,常见的有杯碟法滤纸片法 等。总之,这些 和点种法 方法都是基于细菌素通过固体或半固体培养基介质的扩散来抑制敏感微生物, 这样抑菌圈的大小除了与细菌素的抑菌活性有关外,还与细菌素的扩散率有关 ”“,如果细菌素是疏水性的而不易扩散,就难以获得正确的结果。为了解决这 些问题,许多改良的方法都在探索中。荧光物质法可以用来测试微生物的生长 和抑制,另外还有电导法、?法等。分子检测法与传统的检测方法不同, 它着眼于细菌素的蛋白质或基因水平。对于蛋白质水平的分子检测,免疫学 技 术是行之有效的手段,以纯品细菌素、蛋白水解片段或人工合成的肽片段作 为 抗原制备抗体,该抗体可以灵敏地分析、检测待测细菌素;而基因水平的检测 技术依赖于技术,目前应用技术己能扩增从结构、免疫到负责细菌素 加工、修饰及分泌的所有基因,但缺点是无选择性,还有待于进一步的研究。 值得注意的是在测定细菌素活性时一定要排除非特异性的抑菌因素,如细 菌代谢产生的氨、有机酸、游离脂肪酸、过氧化氢等。 .影响乳酸菌产生细菌素的因素 一般在普通培养基和培养条件下就可以产生细菌素,但菌株、培养基组成、 培养条件、培养时间对细菌素的产量有着明显的影响,而且有的细菌素的产 生 还需加以诱导。 ..培养基 ...培养基营养成分 在一般的培养基中添加适量的营养物质及无机盐类,就可以促进细菌素的 产生,但不可过量,否则反而会抑制细菌素的产生,而且不同的细菌对营养的 要求也不同。.. 等报道. 产生抗真菌物质的 最佳条件如下:酵母膏浓度为.~.%,牛肉膏浓度、于.%,胰酶解胨浓 度低于.%,而其它乳酸菌,如明串珠菌和链球菌产生细菌素的最佳酵母膏浓 度分别为.%和.%。关于葡萄糖浓度与细菌素产量的关系,人们也做了不 少研究,发现葡萄糖对细菌素合成的有效浓度在.~.%”。。 ...盐类 盐类对细菌素的产量也有较大影响,这可能因为它们与细菌素生物合成过 程中的酶活相关。.. 发现、。?。、:?。和;?: 的浓度影响细菌素的产量。的浓度从.%~.%变化的时候,抗真菌物 质的浓度也随之增加,。?。、。?。和。?。的促进浓度分别 为~.%、.%、.%,浓度过高则产生抑制作用”“。 ...培养基状态 培养基状态也会影响细菌索的产量,有些细菌素可以在固体培养基上产 生,而另一些可以在液体培养基上产生,也有一些兼而有之。但一般认为增加 培养基浓度或添加乳化剂可以提高细菌素的产量,如添加琼脂、葡聚糖、甘 油、 吐温等等。“”研究 一』产生的细菌素 的产 ?时发现向培养基中添加一磷酸甘油时, 量会增加。当然就特定的细菌素而言,特定的培养基是关键, 的产生 要求在没有的液体中,““研究从阴道分离的 产生的细菌素时也发现含的培养基并非 它产生细菌素的最佳培养基。 另外,培养基中的某些成分可能与产生的细菌素作用而使其失效,在 .等研究. 产生的细菌素的过程中发现:在以 为.的培养基培养时,细菌素的最高产量达/,而以牛奶作 为培养基时,检测不到细菌素的存在““。 ..培养条件 细菌的培养条件不但严重影响到它的生长情况,而且还与细菌素的产量密 切相关。这些因素主要包括培养基的值、培养温度、培养时间、供氧量等 等。 ...值 酸度对细菌素的影响极大,但不同的菌株有着不同的最适酸度,乳酸菌产 生细菌素的最佳一般在~之内,而且很多菌株产细菌素的最佳值并 非最佳生长值“?“,如:. 在值为时生长速度 最快,而产生的细菌素仅为.时的一一半。具体情况可见表卜。 表一:一些嗜酸乳杆菌产细菌素的最佳。 .一: ...培养时间 对于细菌素的产生而言,培养时间和温度都有一个最适范围,一般来讲, 在菌体进入稳定期以前,细菌素的含量随着时间的延长而增加,但稳定期后, 随着培养时间的不断延长,细菌素的活性反而不断损失,这可能是因为对某 些 细菌素而言,延长培养时间,培养基中的成分发生极大的变化,如酸度增加、 一些特殊的抑制剂的产生、蛋白酶的产生,而且随着培养时间的延长细菌素 的 吸附量也有所增加,如细菌素 、、 .等研究表明: 等都出现这样的情况。而 却与此相反, 在培养 小时之后即在对数期晚期,细菌素的含量达到 . / 最高值,而将培养时间一直延长到小时的过程中,细菌素的含量和活性都 没有降低。 细菌素的最佳收获时间依菌种、培养基、培养条件不同而异, . 和 都是在生长周期早期分别产生细 菌素 ?和??的,而则产于. 生长周期晚期。 ...供氧量 对大多数需氧菌来讲,培养时通气可以提高细菌索的产量,兼性厌氧菌对 通气的敏感程度随种而异。如通气可以提高葡萄球菌素的产量,而 则必须在厌氧的条件下产生“。?。 ...生物量 一般生物量也影响到细菌素的产量,大多数学者认为细菌素的产量与生物 在生长到 量真接相关?“?,但也有不少例外的情况,如. ~小时时生物量达到最大值,而在~小时时产生细菌素的量最大。 【 的产生可被由其敏感菌 还有一些细菌素的产生依赖于诱导, 后 产生的一种分子量为的蛋白质诱导, . .口/行口,埘?、三.口 产生的细菌素则受其自身产生的一种多肽 产生基 诱导。研究表明许多细菌素产生基因操纵子上含有调节基因。在 因的操纵子上,诱导因子 对细菌素起重要的调节作用。 诱导因子通过信号转导系统被定位于细胞膜上的组氨酸激酶识别,组氨酸激酶 磷酸化应答调节子 ,应答调节子又作用于细菌素操纵 子上结构与调节基因的启动子,诱导基因的表达。许多热稳定小分子细菌素的 编码诱导因子、组氨酸激酶和应答调节子的基因都位于一个自身诱导调节操纵 子上,且诱导因子本身具有类似细菌素的肽链结构,但不具有细菌素的生物活 性。 .乳酸菌所产细菌素特性研究 ..理化性质 乳酸菌细菌素的早期生化特性研究主要局限于蛋白质类抑制剂的一般性 描述,利用超滤或透析粗略测定细菌素的分子量,抗菌谱的测定等等,目前可 以进行细菌素结构、遗传特性以及作用机制的研究。 ...生物化学性质 细菌素的氨基酸组成分析对于细菌素的特性分析是很重要的,一般疏水小 肽含有较多的非极性残基,如丙氨酸、甘氢酸和缬氨酸。 中疏水和 中性氨基酸残基占.%,其中甘氨酸.%、丙氨酸 .%、缬氨酸.%。 的端序列分析说明它的个氨基酸残基中%是非极性的 同样 疏水残基。 ?遗传特征 细菌素的遗传基因大部分定位于质粒上,只有少数位于染色体或染色体转、 以及的基因都定位 座子上。如产生 于质粒上,大多数嗜酸乳杆菌产生细菌素的基因则定位于染色体““。具体情 况 见表?: 表卜: 几种细菌素的遗传特征?: . 产生 的基因与一个接合质粒相关,利用穿 . 梭载体将该接合质粒上包含 结构和免疫基因在内的.的片 段克隆、导入不产生 的同源乳杆菌中,表达成功。核酸序列分析表 明此片段中存在一个含个开放读码框的操纵子结构,第一个 是 的结构基因,紧随其后的是两个重叠基因,后面的三个 可能参与 的表达和分泌,其功能有待于进一步研究。 ?嗜酸乳杆菌产生的细菌素的免疫学特征 在合成细菌素的操纵子上除了有结构基因和调节基因外,还有免疫蛋白合 成基因,以保护产生菌细胞免受自身合成的细菌素的破坏,但目前还不完全 清 楚二者是如何相互作用的”“。己知的是:产生菌的免疫蛋白合成基因合成免 疫 蛋白能专一地结合于产生菌细胞膜上,不释放到胞外,因此,产生菌对该细菌 素具有免疫性。在合成 的操纵子上,基因 与 被认为和免疫 保护有关。基因 编码的蛋白分子量为,以脂蛋白的形式嵌入在乳酸菌细胞膜中?。同样,表皮 葡萄球菌对的免疫机制也是通过免疫基 因编码个氨基酸的蛋白与细胞膜外表面的弱结合,阻止孔洞的形成而达到 自身免疫。但这种免疫性不是完全的,高浓度的细菌素同样能够杀死产该细菌 素的菌株。 大多数细菌素,尤其是高分子量的细菌素可看作是优秀的抗原,可以诱导 可诱导产生一个可中和其杀菌效果的抗体,用 抗体的产生,如 免疫了的兔子可产生特异中和抗体。但一般乳酸菌细菌 素不具有抗原性,可能是因为分子量太小的缘故。但目前已借助其它方法使分 子量较小的细菌素具有抗原性并产生出单克隆抗体”。。 ..抗菌谱 多数典型的细菌素的抑菌谱都比较窄,如 ,它只能抑制革兰氏阳性菌 及与其产生菌亲缘关系很近菌珠,而对革兰氏阴性菌几乎毫无作用,但 等将量产生的和产生的 ?, 混合,并添加适量的鳌合剂和表面活性刹 它的抑菌效果远远超过了单独使用其中任何一种细菌素??,这种混合抑菌物 质也是食品防腐剂的一个很有价值的方向。嗜酸乳杆菌产的细菌素能抑制一些 食品腐败菌和病原菌如:梭状芽孢杆菌、利斯特菌等。 表卜:是一些细菌素及其抑菌范围。一: : ;。。’ 、“? , . . :, .:。/: .:, ..抑菌机理 型 ? 此类型细菌素中的 被广泛应用于食品防腐,人们对其作用机制的研 究也较深入,因经 处理后的细菌细胞紫外吸收物质有泄露现象,最初认 中的脱水丙氨酸和脱 为它带正电荷,作用类似于一种表面活性剂:因为 的作用机 水丁氨酸可能与细菌细胞中酶的巯基发生作用,进而有人认为 制与这两个脱水氨基酸有关“;还有人认为细菌素的作用机制主要是消耗敏 感 等 菌细胞的质子驱动力, ?;目前认为 型细菌素属于孔道形成蛋白,它们以被称为卜的机制 作用于靶细菌细胞膜,因为此类型的细菌素与细胞膜上的类脂体尤其是带负 电 荷的磷脂关系最大,而且带正电荷的细菌素与细胞膜的最初作用具有电荷依 赖 性,在膜电位达到阈值 的闽值为~时,细菌素才能吸附于敏感 菌的细胞膜上,侵入膜内形成通透孔道,否则,细菌素不能定位于细胞膜。 侵入膜内形成短暂的、多形态的小孔,其寿命一般为几毫秒千分之一秒到 几秒,直径约..,可允许分子量为.的亲水溶液通过,导致 从胞浆中流出,细胞膜去极化及泄露,细胞外水分子流入,细胞自溶而亡 ”“,因此类细菌素作用需膜电位的存在,故称为能量依赖型细菌素。 为了弄清 型细菌素孔道形成机制的细节,主要采用了人造黑 类脂膜, ”。和膜的磷脂组成两类研究模型。 的组成如下:一个聚四氟乙烯制成的容器,用隔板分成两部分,分别装有缓冲 液,隔板上有一个小圆洞,磷脂双层膜插在圆洞内,膜电位由电极提供,完整 的是绝缘的,当孔道形成,破坏了膜的完整性时有电流产生, 的电 流一电压曲线表明只有向传递负电荷的方向提供一个电压时与细菌细胞膜 在膜外蓄积时的情况相同,才能形成孔道,而且孔道直径随电压的增高而增大 起着选择阴离子载体的作用, 、。在磷脂酰胆碱构成的类脂体中, 对阴离子磷脂如磷脂酰甘油的膜的作用一是对其双层结构的局部破坏,二是 依 分子与磷脂的静电反应可把磷脂的头部基团带入 赖膜电位对膜的插入, 孔的表层。 型 ?非 属于此类型的大分子蛋白类细菌素和复合细菌素结构复杂,对其研究较 少,非 型细菌素的作用机制的研究集中在肽类细菌素上。此型细 菌素也是在细胞膜上形成一个亲水孔道,但这个亲水孔道是由膜上的特定的 受 体蛋白介导的,与膜电位无关,这类细菌素被称为非能量依赖型细菌素。与 型相比,此类型细菌素的作用主要是破坏膜功能的稳定性如能 量转导,而不是破坏结构的完整性。 还有一些细菌素的作用机理是抑制敏感菌的和合成,但并不引起 溶菌。如由乳脂乳球菌.产生的窄谱细菌素。 ..影响细菌素作用效果的因素 细菌素作用效果受许多因素的制约,如值、细菌浓度、磷脂成分、蛋 白酶、温度、食品性状等。 不同的细菌素适用的范围不同,但大多数在酸性环境下较稳定,作用 效果也较好, 在值~内都保持活性,而值一旦大于, 它的活性很快减弱”“。那淑敏等报道,在一定范围内,嗜酸乳杆菌产生的细 菌 素的活性随值的升高而逐渐丧失,当调至时产生沉淀,回调 到后,沉淀完全溶解,活性不变。“。 的稳定性与溶液有关,. 下可经 ?灭菌而不失活,.灭菌时活力丧失%,.时灭菌丧失% 活力。而且,牛奶或培养基中的大分子物质对 有保护作用,所以在食品 或培养液中稳定性会大大提高。 细菌素是多肽类或类似多肽类的物质,它们几乎毫无例外地对蛋白酶敏 感,易被各种蛋白酶降解,一胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋 白酶、枯草杆菌蛋白酶、蛋白酶”等都是细菌素的天敌。 在很大程度上、食品种类、浓度、脂肪浓度、含水量等因素都影响 细菌素的作用效果,而且,对于不同的细菌素而言,这些因素的影响也极为不 ?与 的作用效果越好,但 同,一般来说,浓度越高, 此相反:同时,不同细菌素对食品中脂肪浓度的需求也不同,这可能与它们的 而言,脂肪浓度为%,作用效果最好,但对 扩散有关。“,对 ?而言,脂肪浓度越低越好。 研究表明在、”、”等二价或三价阳离子存在时,的作用 显著减弱。因为这些阳离子与磷脂头部基团的负电荷反应,一方面竞争性地抑 制了细菌素的正电荷与细胞膜的静电作用,另一方面中和了磷脂头部基团的负 电荷,使类脂体聚合,从而细胞膜更加坚固。 综上所述,国外对于嗜酸乳杆菌所产生细菌素的研究相对较早,九十年代 和美国的 , 早期日本的 ’ , . 等人就开始研究嗜酸乳杆菌产生的细菌素。到目 前为止己发现的嗜酸乳杆菌产生的细菌素有十多种,它们从细菌素的产生条件 到细菌素的类型、分子量、理化性质、抑菌谱、遗传特性等各项性质都大相径 庭,这说明嗜酸乳杆菌产生细菌素的特性是有菌株差异的。相对国外而言,国 内对于嗜酸乳杆菌的研究主要停留在将它作为第三代酸奶的发酵剂”“”和它 的益生作用上”“,报道的相关文章也多是一些综述类的。所获得的国外的文章 中采取分离、提取细菌素的方法一般是分级沉淀、离子交换色谱、高压液相 色 谱、超滤、凝胶电泳和毛细管电泳。但未给出具体的操作条件,而关于细菌素 检测、机理研究、基因定位等研究方法没有详细的描述。我们经过前期的工作 得到两株生长特性、发酵特性良好的嗜酸乳杆菌,故而借此研究它们包括细菌 素在内的代谢产物。目的是找到合适的分离、提纯、检测细菌素的方法,并期 望找到一种具有应用价值的嗜酸乳杆菌素。第二章试验部分 .试验设备及材料 ..主震仪器设备 旋涡混合嚣 上海精辩实韭段傍有袋公司 趣净王作台 苏净集团安泰公司 电热憾温培养箱 江苏省东台县电器厂 ?型三恒电泳仪 北京市六一仪器厂 电泳槽遣热羧溅于澡籍 重庚银河试验霞器裔戳公司 电热假温水浴锅 北京化玻联医疗器械有限公司 显微镜 重庆光学仪器厂 冷冻离遽离心机 湘仪离心机仪器有限公司 冷冻怒速褒,玉爨 中懑圈翻枣饔,玉羲厂 ~磁力挽袢器 江筇姜堰市银河仪器厂 电子天平 北京赛多利斯天平有限公司 冰箱 安徽浆士达股份有限公司 光疆分毙光度嚣 上海糖密秘学仪爨有瓣公霉 霉菌臻葬箱 上海跃进医疗器械厂 立式臌力蒸汽灭菌器?型 江阴滨江医疗设备厂 微量避样器 上海安亭微量进样器厂 ~型托盘握力天平 上海鬻二天平仪器厂 黧酸度诗 意犬弼晗纳公司芤寨分公司 ..主撄试剂药品 琼脂粉 生化试剂 北京海淀区微生物培养熬制品厂 干酪豢 生化试荆 中国医浆公司北京采购供应蛞东海制药厂 生化试剂 胰蛋白胨型 营养琼脂 生化试剂 北京奥博星生物技术责任有限公司 天福精细化工有限公司 柠檬酸氢二铵 分析纯 乳糖 化学试剂 北京红星化工厂 氯化钠 分析纯 西安化学试剂厂 葡萄糖 分析纯 西安化学试剂厂 硫酸镁 分析纯 西安化学试剂厂 牛肉浸膏 生化试剂 成都市华西生化制品厂 酵母膏 生化试剂 北京奥博星生物技术责任有限公司 乙酸钠 分析纯 西安化学试剂厂 吐温 生化试剂 华美生物工程公司 动物蛋白胨 生化试剂 北京奥博星生物技术责任有限公司 磷酸氢二钾 分析纯 西安化学试剂厂 吐温 化学纯 天津市恒吴公司化学试剂厂 硫代硫酸 分析纯 河南焦作市化工厂 冰醋酸 分析纯 西安化学试剂厂 无水乙醇 分析纯 西安化学试剂厂 异丙醇 分析纯 西安化学试剂厂 重铬酸钾 优级纯 汕头市光华化学厂 鱼蛋白胨 生化试剂 上海东海制药厂 化学纯 中国医药集团上海化学试剂公司 猪胆盐 生化试剂 北京海淀区微生物培养基制品厂 考马斯亮兰 进口分装 上海化学试剂采购供应站 三羟基氨基甲烷 分析纯 西安化学试剂厂 丙烯酰胺 化学纯 汕头光华化学厂 ,’一亚甲基双丙烯酰胺化学纯 中国医药上海化学试剂公司 柠檬酸铁 化学纯 上海警后制药厂 一葡萄糖酸钠 化学纯 北京芳草医药化工研制公司中国医药上海化学试剂公司 甘氨酸 分析纯 分析纯 西安试剂厂 酒石酸钾钠 对氨基二甲基胺盐酸盐 化学纯 :海试剂三厂 硫酸铜 分析纯 郑州化学试剂二厂 对氨基苯磺酸 分析纯 北京化工厂 硝酸银 化学纯 西安化学试剂厂 氨基苯磺酸 分析纯 上海第一制药厂 过硫酸铵 分析纯 西安化学试剂厂 尿素 分析纯 洛阳市化学试剂厂 甲萘胺 化学纯 上海泗联化工厂 蔗糖 分析纯 天津化学试剂一厂 七叶灵 果糖 分析纯 防化学院实验化工厂 山梨醇 生化试剂 上海试剂二厂 一半乳糖 生化试剂 上海试剂二厂 鼠李糖 生化试剂 上海试剂二厂 麦芽糖 化学纯 北京市化学试剂研究所 纤维二糖 生化试剂 中国科学院上海生化研究所 密二糖生化试剂 甘露糖 分析纯 上海恒信生化试剂有限公司 棉籽糖 生化试剂木糖 三级纯 北京市化学试剂厂 一阿拉伯糖 生化试剂 进口分装 甘露醇 分析纯 西安化学试剂厂 ..供试菌种 三. 、. 金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 以上菌种均由本实验室保存..培养基 %脱脂乳;培养基;改良培养基;改起培养基改良番 茄汁琼脂培养基;营养琼脂;蕾养肉汤;培养基;七叶苷培养基 .实验方法 ..检测方法 . 酸度测定方法 滴加两滴酚酞指示剂,然后用 取培养液.,加入蒸馏水稀释 /的溶液滴定。 . 测定法 型酸度计测定。. 值测定 光栅分光光度计.测定。 乳酸菌计数方法 按国际乳品联合会: 酸奶特征微生物的菌落计数。 稀释液为无菌生理盐水。?培养小时。 显微镜下直接记数法。嗜酸乳杆菌素的检测 平板挖井法 ?敏感菌菌悬液的制备 将己活化的敏感菌一金黄色葡萄球菌、大肠杆菌分别接入营养肉汤培养基 中,?下振荡培养小时,取出接入装有营养肉汤培养基的三角瓶中, ?下振荡培养 小时,稀释平板计数,如果浓度过大则可用无菌生理盐水 稀释,一般抑菌试验要求保持每皿 个菌落。 ?抑菌测定 单层琼脂法 将培养基熔化冷却至?,加入.% 充分混合,冷却至 ?,加入上述敏感菌菌悬液,混合后倾注平皿,凝固后放入冰箱?过夜,次 用打孔器打孔,用微量进样器向琼脂孔中加等量的待测液和对照液。将平板 水移入。下培养~小时,测定抑菌圈大小”“。 双层琼脂法: 将含琼脂.%的培养基熔化,冷却至?左右,倾注平皿,凝固后, 熔化含有.%琼脂的培养基,冷却至?,加入上述敏感菌菌悬液,混 合后倾注到下层培养基己凝固的平皿中,等培养基固化后用打孔器小心地打 孔,要求只在上层培养基中打孔,而不破坏下层培养基,然后用微量进样器向 琼脂孔中加等量的待测液和对照液。将平板水平移入?下培养~小时, 测定抑菌圈大小 ? 具体方法见后页电泳条件的确定。 .试验及方法 ..嗜酸乳杆菌的纯化 培养基的制备 配制液体培养基分装入支厌氧试管中,每管,充入氮气排 空空气,封口,于?下灭菌。 纯化菌种 取实验室保存的嗜酸乳杆菌进行系列稀释至。,从~~。 各取. 进行滚管分离。?下培养小时后挑取目标单菌落,接种于培养基中, ?下培养小时,进行鉴定。 ...嗜酸乳杆菌的鉴定 菌落形态观察 采用/?中的方法,采用培养基改良番茄汁琼脂培 养基‘”,取液体菌种.于无菌平皿中,无菌操作倾注左右的 ?的琼脂培养基,冷却后,将平皿置于干燥器中,抽真空,同时采用烛缸 法进行厌氧培养。 细胞形态观察 待测菌涂片固定后,甲苯胺蓝染色,用%的乙酸冲洗至洗液无色,晾干, 光学显微镜观察。 革兰氏染色 待测菌涂片固定后,用结晶紫染色,氏碘液媒染,%酒 精脱色,再用番红复染~,光学显微镜观察。 鞭毛染色 银染法 %%、%% %、福尔马林 甲液:丹宁酸%、 乙液:% 玻片处理:选择光滑无痕玻片,用液煮沸,冷却后用洗液浸泡 过夜,自来水冲净酸液后用蒸馏水冲洗,沥干,放入%乙醇中脱水,取出玻 片,以火焰去乙醇,即可使用。 待测菌固定于干净干燥的载玻片上,滴加甲液染色分钟,蒸馏水冲洗, 干燥或将残水沥干或用乙液冲去残水后,加乙液染色~秒,加热使其稍 冒蒸气而染液不干,冷却后用蒸馏水冲洗,光学显微镜观察。 .芽孢染色 分钟, 待测菌固定于玻片上后,用饱和的孔雀绿溶液约为.%染色 自来水冲洗之后,用.%番红复染秒,水洗沥干,光学显微镜观察。 .氧化酶检测 在干净的培养皿中放一张滤纸,滴加%的二甲基对苯撑二胺润湿滤纸,取 一接种环已培养~小时的菌苔,涂抹在润湿的滤纸片上,秒钟后观察 颜色变化。 .接触酶检测 挑取一接种环己培养小时的斜面菌种,涂抹于已滴有一滴%过氧化氢 的玻片上,观察是否有气泡产生。 .糖发酵 将培养基中的葡萄糖分别换作鼠李糖、山梨醇、半乳糖、纤维二糖、 乳糖、棉籽糖、果糖、甘露糖、甘露醇、木糖、海藻糖、阿拉伯糖、麦芽糖 和蔗糖等十,种糖,并添加%的.%的溴甲酚紫作为指示剂,制成半周体培养 基,穿裁接秘予 培养~天,鼹察培莠蕊激琶熬变毒艺及蓥搴静运凌往。 .七叶灵水解 培养基中加入.%的七叶炙和 %的柠檬酸铁,制成斜面培养基, 彀鞭鲜蘩转接瓣嚣,教入予澡器中,撼奏空,茂霹采焉蕊氯法子?下遴行厌 氧培养。、、天后观察。 ,硝酸攮还原 结养基含有.%瓯。~。 液:对抵基苯磺酸.稀醋酸%左右 液:~黎胺。蒸馏水鞴醋酸%左右 二苯胺试剂:二苯胶。溶予浓硫酸中,露蒸馏承稀释。将 测定菌种接种于硝酸盐液体培养基中,置于?培养、、天后,分别取。一 滂培券滚、渡、液,观察颜色变化。 .葡萄糖羧盐氧讫 用.的磷酸盐缓冲液配成宙有%葡萄糖酸盐的溶液。分装,每管, 灭麓薏巅取已薅券~小避豹蔻罄接入藜莓糖溶滚中铡波浓厚豹均匀戆藏 悬液,?过夜,然后每篱加入.的裴林试剂,沸水煮沸分钟后观察 颜甑变化。 .。唾酸毳拇蘑生长麴线懿溪定 主要检测指标:值、值、吉渥尔酸度、/ 。.螬酸乳杼菌酸耐受性分析 ?酸缝条耱下生长试验:涛已予?下培癸奎黠鼗翳鹣液体蘩券物离心 、、?,取菌体溶于无菌生理盐水中,按 个/的鬣接入 已用的盐酸调节的酸性培养纂中,于?下培养,按既定时间敬出, 灏囊篷。 ?模拟胃酸环境试验:将已于?下培养至对数期的液体培养物离心 ×、、?取薄体溶于不同值的生理盐水中处理~小时, 然屠按令/酌量接入臻养蒸中,予。 培养,绞毵定露阂墩出,测定值。 .。嗜酸嚣毒手藏疆蘸受分辑 、?, 将已于?卜培养至对数期的液体培养物离心×、 取菌体溶于无落生理盐水中,按 个/.的量接入不同胆盐含量的培养 萋中,予?下绩养,按甄定薅淘取毒,测定。转稳。 ..嗜酸乳秆黼抗药性分析 采用药物纸片琼脂扩散法简称纸片法检测菌株的耐药性,以青霉 索耧氨苄毒霉豢俘戈抗藜索。专霉素含夔量荧/片,氯“笋专霉素食药量 为 /片。 ..嗜酸乳杆菌素的粗提方法的确定 去缨稳祭孛貉确定 加热除菌条件:分别聚用?、?两个水平的温度和分、分、分、分、分五个 时间水平处理发酵液后,离一如条件:×, , ?,取上涛滚。颓注平蘧,?下,厌氧臻葵,,、辩蜃诗鼗攀经: / 盐析条件的确定 褥嘻酸巍耱蘩培养至对数鬻,麓蕊杀菌蓐离一良去蓥体,上清渡分裂馥磷酸 和%的调节分别至、、、、、、、,缀慢添加 至锪和度%、%、%、%、%、%,于?下搅拌小时,过滤,沉淀 重爨子无菌承串,爝截留分子量簸透析袋透耩。考马新亮蓝法灞定提取 的总蛋白量,平板挖井检测嗜酸乳杆菌索的抑菌活性。 电泳条件豹确定 采用?系统进行电泳实验,调整浓缩胶、分离胶浓度、 上、下胶值、电泳值、上样量、电压、电流等条件,来选择能较好地分 离小分子量的多肽。主要撵《乍如下: 试荆的配制 ?浓缩胶母液:.%.:% 髂取克袋煺蕺跛彝。克学叉双甭烯酸鞍溶予臻瀣 热的去离子水中,定容,置于檫饿试剂瓶中。 ?分离胶母液:.%,:% 溶于 称取.克丙烯酰胺和.克甲又双丙烯酰胺 温热的去离子水中,定容,羞于棕色试剂瓶中。 注:丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺 具有神经毒性,称量时要带手套。含 有它们的溶液必须添加引发剂和催化剂使其凝结后方可处理。 . ?上胶缓冲液/, 称取.克 碱,溶于双蒸水中,用将值一次性地调至 .,定容至。 . ?下胶缓冲液/, 称取.克 碱,溶于双蒸水中,用将值一次性地调至 .,定容至。 ?% 称取.克,溶于双蒸水中,室温保存。 注:危害呼吸系统,配制时需带口罩。 ?电极缓冲液× 分别称取.克 碱和克甘氨酸,溶于去离子水中,加入 %,定容至。 ?% .克过硫酸氨溶于双蒸水中,要求现用现配。 ?样品缓冲液× 溴酚兰 .上胶缓冲液. 一巯基乙醇 甘油 .加双蒸水至 ?考马斯亮蓝染色液 双蒸水加热溶解.克考马斯亮蓝,添加乙醇, 乙酸,过滤后即可使用。 ?脱色液 分别取乙酸和乙醇,定容至即可。 灌胶?安装电泳明治 将玻璃板、样品梳、用洗涤剂洗净,双蒸水冲洗数次,冉用无水乙 醇擦试,晾干,在两块洗净的玻璃板之间夹住,按照说明书将电泳三明 治安装到电泳模具上。 ?配制分离胶 根据预定胶浓度,吸取定量的分离胶母液,依次加入分离胶母液、缓冲液、 双蒸水、 %,抽气分钟,取出添加%、。缓慢搅拌尽量避 免空气带入胶中。 ?灌注分离胶 沿封条边迅速向两玻璃板问灌注分离胶至距上约处,然后用饱和正丁 醇封口,垂直置于室温下。分离胶聚合分钟后,倾出上层覆盖液,用去离 子水洗涤凝胶顶部数次,除去未聚合单体,尽可能排除凝胶上的液体,再用滤 纸边缘吸净残留液体。 ?配制浓缩胶 根据预定胶浓度,吸取定量的浓缩胶母液,依次加入浓缩胶母液、缓冲液、 双蒸水、%后抽气分钟,取出添加%、。缓慢搅拌尽量 避免空气带入胶中。 ?灌注浓缩胶 将浓缩胶迅速注入两玻璃板间,立即以一定角度斜向插入干净的样品梳, 小心,避免气泡产生。再添加浓缩胶充满梳子问间隙,垂直置于室温下。凝结 后取出样品梳并用双蒸水冲洗数次,尽可能排除凝胶上部的液体,再用滤纸 边 缘吸净残留液体。 ?制备样品 分别取.样品和.样品缓冲液于的离心管中,于 ?下加热煮沸~分钟。 ?上样 依据样品中蛋白质含量、样品槽体积确定上样量。用微量进样器上样。 ?电泳渊节电压、电流,电泳开始,当染料溴酚蓝酊沿到达胶底部后,关闭电 源, 停止电泳。 ?染色 电泳结束后卸下玻璃板,撬开玻璃板,小心地取下凝胶,将其放入染色液 中浸泡过夜,然后移出到脱色液中,一定时间后更换脱色液,直至脱尽底色。 ..影响两株嗜酸乳杆菌产生细菌素的因素的研究 试验不同蛋白胨对细菌素的影响的基本方法 分别采用鱼蛋白胨、动物蛋白胨、干酪素作为对比,培养嗜酸乳杆菌至对 数期后,提取细菌素,经?检测。 试验培养时间对细菌素的影响的基本方法 , 将嗜酸乳杆菌分别培养不同时间后,取出,离心条件:×, ?去菌体,上清液加入三氯乙酸浓度达:%沉淀蛋白质,丙酮洗涤两 次后,悬浮于.的无菌水中,经?检测。第三章 试验结果与分析 。嗜酸乳秆蔼鉴定及冀特性的研究 。。形态及生长特性研究 和 经过前麓工作缝仡褥鲻两株嚷酸毳杆菌分剐为. 快, 三. 。其