阿魏酸钠对反复前脑缺血再灌注大鼠海马及额叶胶质纤维酸性蛋白表达的影响

阿魏酸钠对反复前脑缺血再灌注大鼠海马及额叶胶质纤维酸性蛋白达的影响 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 阿魏酸钠对反复前脑缺血再灌注大鼠海马及额叶胶质纤维酸性蛋白表达的影响 (作者:___________单位: ___________邮编: ___________) 作者,满玉红 李立森 于挺敏 【摘要】 目的 探讨内皮素,ET,受体拮抗剂阿魏酸钠对大鼠前脑缺血再灌注后海马和额叶胶质纤维酸性蛋白,GFAP,表达的影响。 双侧颈总动脉夹闭法制备大鼠前脑缺血再灌注模型,HE染色观察阿魏酸钠治疗前后海马CA1区神经元形态学改变,免疫组化法检测缺血再灌注后2、4、6 w海马和额叶胶质纤维酸性蛋白,GFAP,的表达。结果 阿魏酸钠治疗组海马神经元缺失、变性、坏死较对照组轻,缺血再灌注后海马和额叶GFAP的表达随时间延长逐渐增多,阿魏酸钠治疗组GFAP的表达较假手术组多,较缺血再灌注组减少,差异显著,P0.05,。结论 大鼠前脑缺血再灌注后GFAP表达增多,阿魏酸钠能够降低其表达,对脑缺血性损伤具有保护作用。 【关键词】 阿魏酸钠,脑缺血再灌注,胶质纤维酸性蛋白,星形胶质细胞,内皮素 胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞,AST,特有的细胞骨架 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 蛋白。GFAP表达量能够代表AST功能状态。目前研究认为,脑缺血后AST中GFAP表达增加,早期可保护神经组织,晚期则促进胶质瘢痕形成,阻碍神经再生。内皮素,ET,是人体内一种生物活性多肽,具有强烈的缩血管作用,在活化的脑AST上存在ET受体,可能参与脑缺血损伤过程。研究证明阿魏酸钠具有拮抗血管ET受体、减轻血管内皮细胞损伤的作用,可促进脑缺血后神经功能恢复及血管生成〔1〕,但是否能通过调节AST活性发挥对脑缺血的保护作用未见报道。本文旨在探讨阿魏酸钠对脑缺血后AST上调GFAP表达的影响,进一步阐明阿魏酸钠的脑缺血保护作用机制。 1 材料与方法 1.1 动物分组及前脑缺血再灌注模型制备 雄性Wistar大鼠45只〔长春高新医学动物实验中心提供,动物合格证编号SCXK,吉,20032004〕,体重200,250 g,随机分为3组,?假手术组,?缺血再灌注组(对照组),?缺血再灌注阿魏酸钠治疗组(治疗组),每组15只,各组按手术后2、4、6 w再分为3个亚组,每亚组5只。。大鼠10%水合氯醛,100 mg/kg,腹腔注射麻醉,仰卧位固定,颈部正中切口,对照组和治疗组分离双侧颈总动脉,注意保护迷走神经,无创微动脉夹夹闭双侧颈总动脉15 min,然后恢复血流再灌注60 min,再夹闭15 min,松开动脉夹,恢复血流,缝合切口。假手术组只分离双侧颈总动脉,不予夹闭,余同对照组。术中用红外线灯和保温垫使大鼠肛温保持在,36.0,37.0,?。术后同等条件下正常饲养,分别于各时间点处死大鼠取脑标本。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 1.2 给药方法及剂量 治疗组于动物清醒后24 h内给予阿魏酸钠腹腔注射治疗,给药剂量依照如下换算公式,大鼠给药剂量,mg/kg,=6.25×人口服剂量,mg/kg,,人静点阿魏酸钠剂量按400 mg?60 kg-1?d-1计算。每日腹腔注射1次。1 w后重新测量体重,调整给药剂量。对照组和假手术组给予等量的生理盐水腹腔注射。 1.3 标本采集和组织切片制备 不同时间点,大鼠10%水合氯醛,100 mg/kg,腹腔注射麻醉后经0.9%生理盐水250 ml心内灌注冲洗,10%甲醛溶液前固定,取脑,4%多聚甲醛溶液后固定72 h,常规脱水,透明,石蜡包埋,冠状切片,片厚4 μm,分别行HE染色和GFAP免疫组化染色。 1.4 GFAP免疫组化检测,SP法, GFAP免疫组化试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供,按操作。阴性对照用0.02 mol/L PBS代替GFAP一抗,其余实验步骤不变。 1.5 结果判定及统计学处理 GFAP免疫组化阳性结果判定,400倍光学显微镜下每张载玻片海马和额叶各计数3个视野,胞质呈棕黄色或棕褐色的细胞为GFAP阳性细胞。 1.6 统计学处理 全部实验数据以x?s表示,组间比较采用方差分析和F检验,组内比较采用t检验。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 2 结 果 2.1 HE染色结果 光镜下假手术组未见异常,神经元、胶质细胞结构完整,间质无水肿,对照组部分神经元及胶质细胞变性坏死,随时间延长胶质细胞逐渐增生,部分标本可见较多圆形或椭圆形肥胖型星形胶质细胞,胞质丰富,嗜伊红色,核小,致密并偏于一侧,治疗组脑组织肿胀及星形胶质细胞增生较轻。 2.2 GFAP免疫组化染色结果 阴性对照切片各部位均未见到免疫反应阳性细胞。假手术组各时间点GFAP表达无明显差异。对照组海马和额叶GFAP表达在2、4、6 w 3个时间点呈持续增加。治疗组GFAP表达较假手术组高,较对照组低,差异显著,P 0.05,。见表1。表1 前脑缺血再灌注不同时间点海马和额叶GFAP阳性AST数(略) 3 讨 论 GFAP在有活性的AST中表达相对较多,其表达量的多少可作为研究脑损伤后AST反应的标志,研究显示脑缺血再灌注后胶质细胞增生活化在全脑均较活跃,这种反应在早期以增殖、细胞体和核过度肿大为特征〔2〕,伴随细胞内线粒体数目增加,一些重要酶类活性增强,分泌多种神经营养因子和保护性细胞因子,有利于神经功能的恢复〔3〕。但脑缺血急性期后胶质增生导致胶质瘢痕的形成,将阻碍神经纤维再生,影响神经功能重建。因此,应调控急性期后AST的GFAP过度表达,加强缺血后的脑保护。 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 正常时ET的产生与降解处于动态平衡,脑缺血后,ET释放增加,通过ET受体导致血管收缩,诱导AST释放谷氨酸,加重神经元损伤。因ET对血管内皮细胞及AST的作用在于与受体的结合,故若能有效拮抗ET与其受体结合,既可改善脑缺血,又能保护脑组织。 阿魏酸为中药当归、川芎的主要有效单体成分,其钠盐为阿魏酸钠,是ET1受体拮抗剂,能与ET1竞争性结合受体,前期动物实验研究已经发现阿魏酸钠能使脑缺血再灌注大鼠白质区GFAP表达增高〔4〕。陈莉芬等〔5〕发现阿魏酸钠对大鼠脑皮质微血管内皮细胞(BMEC)缺氧损伤具有保护作用,其机制与减少BMEC分泌ET1,抑制NFκB蛋白表达,促进κBα蛋白表达有关。临床研究阿魏酸钠治疗脑梗死患者,其血清中ET1和IL8较对照组明显下降,说明阿魏酸钠可保护内皮细胞,有效降低细胞因子的产生〔6〕。本实验制备大鼠脑缺血再灌注模型,HE染色下见额叶、海马神经元变性坏死,肥胖型AST增生,GFAP表达增多,表明本模型造成了缺血性损伤,AST活化。给予阿魏酸钠治疗后,神经元变性坏死减轻,GFAP表达减少,证明阿魏酸钠可调节GFAP的过量表达,从脑缺血后不同时间海马、额叶GFAP表达的情况看,治疗组缺血后2、4、6 w GFAP均较对照组表达减少,说明阿魏酸钠减轻了前脑缺血的程度,从而减轻了AST的活化反应。阿魏酸钠上述作用的机制可能与如下因素有关,?对血管的作用,阿魏酸钠能缓解由ET引起的血管痉挛和血管重构,增加血管舒张因子一氧化氮(NO)的合成,对血管内皮有双重保护作用〔7〕,并能清除和抑制氧自由基,抗脂质过氧化,减 DOC格式论文,方便您的复制修改删减 轻对血管壁的损伤,对脑缺血再灌注后氧化性DNA损伤具有保护作 用〔8〕。?对AST的作用,过度活化的AST的ET受体表达增多, 且活化的AST可合成和分泌ET,影响局部血液循环,AST的ET受 体的激活还可诱导细胞内钙离子升高,磷脂酰肌醇分解、cAMP合成 减少,诱导迟发型神经元死亡〔9〕。?阻断p38MAPK磷酸化,从而 阻断细胞外信号向细胞内传递,抑制神经元细胞凋亡。 因此,阿魏酸钠能降低AST的过度兴奋,稳定内环境,减轻脑缺 血再灌注导致的神经元损伤,减轻反应性胶质化程度,整体上保护神 经元,促进中枢神经系统功能恢复。 【参考文献】 1 周 琴,廖维靖,杨万同,等.阿魏酸钠促进局灶性脑缺血 再灌注后神经功能恢复和血管生成作用的研究〔J〕.中国康复医学杂 志,2006,21,3,,2003. 2 Kajihara H,Tsutsumi E,Kinoshita A,et al.Activated astrocytes with glycogen accumulation in ischemic penumbra during the early stage of brain infarction,immunohistochemical and electron microscopic studies〔J〕.Brain Res,2001,909:92101. 3 Gabryel B,Trzeciak HI.Role of astrocytes in pathogenesis of ischemic brain injury〔J〕.Neurotox Res, 2001;3(2):20521. DOC格式论文,方便您的复制修改删减 4 于挺敏,满玉红,曲丽丽.阿魏酸钠对大鼠脑白质胶质纤维酸性蛋白表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2007,27,11324. 5 陈莉芬,陶 陶,余 震,等.阿魏酸钠对缺氧致脑血管内皮细胞NFκB、κBα表达的影响〔J〕.第三军医大学学报,2007,29,3,,22830. 6 李郭飞,王朝辉,黄德晖.阿魏酸钠对急性脑梗死ET1和IL8水平的影响〔J〕.中国实用神经疾病杂志,2007,10,6,,57. 7 黄永华.内皮素与中枢神经系统疾病〔J〕.北京医学,2002,22 (1),435. 8 章军建,刘煜敏,刘汉新,等.阿魏酸钠对大鼠脑缺血再灌流后氧化性DNA损伤的保护作用〔J〕.中华神经科学杂志,2001,17,2,,198200. 9 李子广,吴华璞,郭 梅,等.阿魏酸钠对MCAO大鼠缺血/再灌注损伤p38MAPK信号通路的影响〔J〕.中西医结合心脑血管病杂志,2009,7,2,,1935. DOC格式论文,方便您的复制修改删减