国标-鲤春病毒血症病毒(SVCV)

国标-鲤春病毒血症病毒(SVCV) lCS 65(020(30 B 41 a园 中华人民共和国国家 15805 (5—2008 GB,T ( 1580511995部分代替GB,T 鱼类检疫方法 第5部分:鲤春病毒血 methods (SVCV) of fish— Quarantine 症病毒 of viraemia Part virus(SVCV) :Spring carp 5 2008—07-3 2008—1卜01实施 1发布 宰瞀髁鬻黼警矬瞥星发中布 1” 国国家标准化管理委员会仪 15805(5—2008 GB,T 刖 吾 GB,T 15805《鱼类检疫方法》分为下列部分: ——第1部分:传染性胰脏坏死病毒(IPNV); ——第2部分:传染性造血器官坏死病毒(IHNV) ——第3部分:病毒性出血性败血症病毒(VHSV) ——第4部分:斑点叉尾鲴病毒(CCV); ——第5部分:鲤春病毒血症病毒(SVCV); ——第6部分:杀鲑气单胞菌; ——第7部分:脑粘体虫; 本部分为GB,T 15805的第5部分。 15805(1 1995《淡水鱼类检疫方法第一部分》中的本部分代替GB,T 15805(1 7章。 本部分与GB,T 1995的第7章相比主要变化如下: 第 _-_删除了临床检查; 改用PCR方法代替中和试验鉴定 SVCV B“SVCG;增加资料性附录病毒基因的全序列 (1588 bp)”; 1(1 ——结构格式按GB,T 2000的规定，作为部分编写。 本部分的附录A为性附录，附录B为资料性附录。 本 部分由中华人民共和国农业部提出。 本部分由全国水产标准化技术委员会归口。 本部分起草单位:农业部全国水产技术推广总 本部分主要起草人:孙喜模、江育林、陈爱平、站、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为:陈辉、朱泽闻。 15805(1—1995。——GB,T (5—2008 15805GB,T 鱼类检疫方法 第5部分: (svcv) 鲤春病毒血症病毒 1范围 GB,T 15805的本部分规定了细胞分离病毒后，用RT—PCR技术SVCV的方法。 本部分 SVCV的分离和鉴定，SVC的流行病学调查、诊断，以及口岸出入境、国内跨区域移 适用于 动的检疫。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过GB,T 15805的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用 件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分，然而，鼓励根据本部分达文 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于成 部分。 本 6682 IsO GB,T 1992分析实验室用水和试验方法(neq :1987) 3696 GB,T 18088--2000 出入境动物检疫采样 3试剂和 3(1 6682 水:GB,T 1992，一级。用于RT—PCR(包括核酸抽提)时所用的水要用焦碳酸二乙 (DEPC)处理以除掉RNA酶。 脂3。2 SVCV参考株:由农业部指定的动物病原微生物菌(毒)种保藏机构提供。 3(3 Taq酶:一20?保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 U,mL。一20?保存，不要反复冻融或温度剧烈变3(4逆转录酶AMV:10 化。 3(5 RNA抑制剂(RNasin):40 u,pL。一20?保存，不要反复冻融或温度剧烈变 化。3(6 mmoldNTP(含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10 ,L)。 588 3(7引物:该试验选用SVCV的糖蛋白基因作为PCR的模板。该基因长1 bp，在这里用了两 引物:F1和R2扩增该基因中的714 bp片断，而F1和R4则从该片断中再扩增606 bp片断。所对际上是“半套式”的PCR(semi—nested PCR)。使用时浓度为40 vmol,L。其序列如下: 以实5’一AGA TGG TAT GGA CCC CAA TAC ATH ACN R2: R4: 5’一CTG GGG TTT CCN CCT CAA AGY CAY一3’。 TGY一3’。 5’一TCT TGG AGC CAA ATA GCT CAR F1: RTC-3’。 3(8无水乙醇:分析纯，使用前预冷到一20?。 3(9矿物油:要求无DNA酶和RNA 酶。 3(10 DNA分子质量标准(Marker)。 4器材和设备 4(1 96孔细胞培养板。 4(2倒置显微镜。 4(3恒温培养箱。 4(4普通冰箱和低温冰箱。 1 GB,T 15805(5— 2008 4(5组织研磨器。 4(6离心机和离心管。 4(7 PCR扩增仪。 4(8电泳仪。 4(9微量移液器及吸头。 4(10紫外观察灯。 5 SVCV的分 离 5(1采样 按GB,T 18088 2000的规定执行。对有临床症状的鱼，如是体长?4 cm 的鱼苗取整条鱼;体长cra,6 4 cm的鱼苗取内脏(包括肾);体长大于6 cm的鱼则取脑、肝、肾、脾。而对无症状的鱼要取肾、 脾、鳃和脑组织;成熟雌鱼还需取卵巢液。 5(2样品处理 应在lo?以下。先用组织研磨器将样品匀浆成糊状。再按1:10的最终稀释度重悬 于细胞培养液(见第A(10章)中。如果在匀浆前未用抗菌素处理过样品，则须将样品匀浆后再悬浮于含有 l h,4 ooo 1u,mL青霉素和1 000,g,mL链霉素的细胞培养液中，于15?下孵育2 h或4?下孵 育6 000 h,24 r,min离心15 rain，收集上清液。卵巢液也要用上述浓度的抗菌素处理以防污染。 h。7 不必匀浆但需稀释两倍以上。用相同的方法离心卵巢液样品并在以后的步骤中直接用其上清液。 5(3病毒分离 对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将这1:10、1:100和1:1 000三个稀释 的上清液以适当体积分别接种到生长约24 h的CO、EPC或者FHM细胞单层中，每孔(2 cm2)度h,1 的细胞 单层最多接种100 pL稀释液。15?,20?吸附0(5 h后，加入细胞培养液。置于1520 2(SVCV)() ?,?培养。试验中要有孔阳性对照接种参考株和空白对照未接种病毒的细胞。 阳性对照和待测样品都接种细胞后，7 d40100 内每天用倍到倍倒置显微镜检查，接种了被检匀浆上清稀释液的细胞培养中是否出现细胞病变(cPE)。空白对照细胞应当正常。如果除阳性对照细胞 外，没有CPE出现，则在培养7 d后还要用敏感细胞进行再传代培养。传代时，将接种了组织匀浆上清 000 稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以7 r,min，4?离心15 min，收集上清液。将上清液接种到新 鲜细胞单层，培养7 d。每天用40倍到]00倍倒置显微镜检查。如果样品经过接种细胞和盲传后均没 有CPE出现，则结果判为阴性。如有CPE出现，则要用RT-PCR方法进行鉴定是否由SVCV引 起。如果阳性对照也未出现CPE，则试验无效。应采用敏感细胞和一批新的组织样品重新按上述方法 进行病毒学检查。 6 SVCV的鉴 定 6(1样品处理 将450 pL细胞病变悬液放入1(5 mL的离心管，再加入450 tzL CTAB溶液(见第A(1章)并 h。 匀。25?作用2 混6(2 RNA抽提000 S。12 r,min在含有样品的塑料离心管中加入600 pL2(A3)30 抽提液见第(章，用力混合至少 离心5 min，小心取上层水相(约800 lzL)。再加入700 pL抽提液1(见第A(2章)，用力混合至少30 S。 12 000 r,min离心5 ，小心取上层水相(约600 pL)。再加入一20?预冷的1(5倍体积的无水乙醇 min 000 (约900 pL)，倒置数次混匀后，一20?8 h以上沉淀核酸。12 r,rain离心30 min，小心弃去上清 液。干燥后加10 pL水溶解，作为PCR模板。 6(3变性和退火 在PCR管中加入10 pL模板和2(5 pL引物R2，加2(5 pL水使总体积为15 pL。置于70?反应 2 15805(5—2008 GBT , 5 rain。立即冰浴，低速离心约5 s，使液体集中在底部。 6(4 cDNA合成 在上述反应管中继续加入:5 dNTP、0(5,LL gL的5倍逆转录酶浓缩缓冲液(见第A(5章)、2”L minu)、1 u)和1(5 RNA酶抑制剂(20 反应pL逆转录酶AMV(10 pL水。总体积为25“L，42?60 以合成模板的cDNA。 6(5 PCR扩增DNA 在上述反应管中再继续加入:10倍Taq酶用浓缩缓冲液(见第A(7章)8 pL、25 mmol,L的氯化镁 2 (MgCl2)(见第A(6章)8 pL、dNTP 2弘L、引物R2 2弘L和引物F1 pL、Taq酶5 u、加水到总体积 为 100”L。每管如入50 pL矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增 仪。先94?预变性，再94?1 min一50?1 min，30次循环，然后72?8 min，最min一72?1 后 4?保温。 66 (琼脂糖电泳 用TBE电泳缓冲液(见第A(4章)配制2,的琼脂糖(含1 p(g,mL EB，见第A(8章)平板。将平 放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6 pL样品和2 pL样品缓冲液(见第A(9章)混匀板 加入样品孔。在电泳时设立DNA标准分子量作对照，推荐使用putl9 DNA,MspI(Hpaid。5 V,cm后电泳 约0(5 h，当溴酚蓝到达底部时停止。在紫外灯下观察核酸带并判断结果。 6(7套式PCR 如果PCR后产物电泳时看不到DNA带，取5 pL产物做模板;如果PCR后产物电泳时能 DNA带，只是要求进一步核实，则需将产物按1:1 000稀释后，取5 pL做模板。 看到2 2(5 2(5 然后依次加入以下试剂:Taq酶5 U，dNTP pL，引物R4 pL和引物Fl pL，Taq酶用 pL10倍浓缩的缓冲液10 pL，25 、加水到总体积为100 pL。 mmol,L的氯化镁(MgCl2)10 每管加入50 pL矿物油。短时间低速离心让矿物油集中在上层。再将反应管置于PCR扩增 12 1 12 1 941 rain，30次循环，然后72?8 rain，最后4?保先预变性，再?min一72 一50 min仪。 温。 6(8对照的设立 6(8(1在6(1的样品处理过程中应设立阳性对照、阴性对照和空白对照。 6(8(2取含有已知sVCV参考株的细胞悬液作为阳性对照。 6(8(3取正常的细胞悬液作为阴性对照。 6(8(4取等体积的水代替模板作为空白对照。 CPECPE7结果判定 样品经过接种细胞和盲传后均没有出现，则结果判为阴性。有出现，则要 RT-PCR 方用法进行鉴定是否由SVCV引起。 PCR后阳性对照会出现一条714 bp的DNA片段。阴性对照和空白对照没有该核酸带。套PCR606 bpDNA 后阳性对照会出现一条的片段。阴性对照和空白对照均没有该核酸带。式待测样品PCR扩增后能在相应714 bp DNA位置上有带，并且套式PCR扩增后能在相应606 bp 位置上有带;或者虽经PCR扩增后可能因浓度太低看不到可见的DNA带，但套式PCR扩 应606 bpPCR714 位置上有带者，均可判为阳性。无带的判为阴性。仅在扩增后有bp增后能在相PCR606 bpDNA 的DNA带，但 套式重复两次仍不能扩增出的带的样品也判为阴性。 DNA714 bp606 如果扩增出的带的大小不是与应判为阴性。如果带的大小和阳性片段接bp 难以确定，则需要测序，根据是否和已知DNA片段的序列吻合来判定。 近 3 15805(5,2008 GB,T 附录A (规范性附录) 试剂配制 标准中所有试剂，除特别注明外，全部采用分析纯的试剂。 A(1 CTAB溶液 ammonium 20 bromide)2,，氯化钠(NaCI)1(4 mol,L，EDTA mmol,L按CTAB(hexadeeyl trimethy Tris—HCl 20 mmol,L pH=7(5配制。用前加巯基乙醇至终浓度为 0(25,。 A(2抽提液1 将三氯甲烷:异戊醇按24:l的比例混合，密闭避光保存。 A(3抽提液2 1 mol ,L Tris水溶液饱和的酚:三氯甲烷:异戊醇=25:24:l混合，密闭避光保存。 A(4 TBE电泳缓冲液(5倍浓缩液) Tris54 硼g 27(5 (HBOs)g 酸 2(922 EDTAg 水 1 000 mL 8(0用5 mol,L的盐酸(HCI)调到pFl A(5逆转录酶AMV的5倍浓缩缓冲液 Tris—HCl 250 mmol,L，pH 8(3 250 mmol,L 氯化 氯化钾(KCI)50 mmol,L (MgClz)镁 DTT50 mmol,L A6(MgCl2) (氯化镁溶液 浓度为25 mmol,L。 A(7 Taq酶用10倍浓缩缓冲液 8(8 Tris—HCl500 mmol,L，pH 500 氯化钾(KCl) mmol,L Triton X-100 1, A(8 EB(ethidium bromide，核酸染色剂) 用水配制成i0 mg,mL的浓缩液。用时每10 mL电泳液或琼脂中加1 pL。 A(9样品缓冲液 mL水溶液中含:溴酚蓝0(25 g，蔗糖40 g。 每100 A10 TCl99培养基，按说明书的要求配制。然后加入10,的胎牛血清，抽滤除(细胞培养液 20?保存。 菌，一4 GB,T 1 5805 (5—2008 附录B (资料性附录) SVC病 588 G基因全序列(1 bp)毒 l actccaactt tcagctacatttgctaattgaacagacatc atgtctatca cgcattcctt aaatatatca61 aggaatcccc atatttgttc catctggtcg tggcagcctg tgattcagcc l 21 cctacccaac atttgattat caatgtccaa tccatggaaa acgatgggtt tgagtgccac 1 81 ataaaatctc caaattgaca catctgtatt cagtacagat aaagtgtctg 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