稀土离子（Nd^3＋）对金黄色葡萄球菌细胞壁结构的影响

稀土离子（Nd^3＋）对金黄色葡萄球菌细胞壁结构的影响稀土离子(Nd^3，)对金黄色葡萄球菌细胞壁结构的影响第4O卷第6期2007年12月分子细胞生物JournalofMolecularCellBiologyVo1.40,No.6December2007稀土离子(Nd)对金黄色葡萄球菌细胞壁结构的影响霍光华张冬艳"张通(内蒙古工业大学化工学院.呼和浩特010051)摘要本文的研究目的是探索稀土离子Nd对金黄色葡萄球菌细胞壁结构的影响作用.采用透射电镜,氨基酸自动分析仪和红外光普法等检测手段,提出了N可使金黄色葡萄球菌细胞壁的形态和结构发生改变;低于抑茵浓度的NdC13对金黄色葡萄球菌细胞壁的古成具有促进作用;高浓度(指杀菌浓度和抑茵浓度)Nd可断裂细胞壁中肽聚糖的大部分肽键和氢键,致使细胞壁中肽聚糖的交联网状结构被破坏.关键词:稀土金黄色葡萄球菌细胞壁结构金黄色葡萄球菌属于革兰氏阳性细菌,细胞壁厚,由肽聚糖(PG)和磷壁酸两种成分组成.PG是一种坚硬,多孔,不定形的物质,PG分子是由若干PG体所组成的网目状大分子.而PG单体由3部分组成_11:?双糖单位:N一乙酰葡萄糖胺(G)和N一乙酰胞壁酸(M)组成.G和M交替排列,通过B一1,4糖苷键连接成聚糖链骨架;?四肽尾是由L一丙氨酸,D一谷氨酸,L一赖氨酸以及D一丙氨酸连接而成的,又通过一个酰键与M相连;?肽桥为甘氨酸五肽,起着连接前后2个四肽尾分子的"桥梁"作用.这种肽聚糖网格状分子交织成一个致密的网套覆盖在整个细胞上.我们的前期研究工作明l3,多种稀土离子对细菌具有较强的抑菌性.稀土离子对细菌细胞的影响作用是多位点的,本文就稀土Nd对金黄色葡萄球菌细胞壁的形态和结构的影响进行研究,试图从细胞和分子水平上深入探讨稀土离子的生物学效应.1材料与方法1.1菌种金黄色葡萄球菌(Staphylococcuso2tl'eusAS1.0089)由中国科学院微生物研究所菌种保藏中心提供.1.2仪器300—109A超声波细胞粉碎机.电压:220V,功率:220HZ,产地:美国纽约;日立835—50型氨基酸分析仪;H一700透射电子显微镜(日本HITACHI公司),最大加速电压:lOOkv;PE一1730型傅立叶红外光谱仪(美国Perkin—Elmer公司),波数范围4000—400cm,,扫描速度:0.1—2.0cm,/s.1.3稀土氯化物的制备将Nd203(国产,纯度大于99.9%)与1:1的HC1按摩尔比为1:6混合,用沸水浴加热.搅拌反应,蒸干,即得含结晶水的稀土氯化物固体NdC1.6H20.1.4NdCI,对金黄色葡萄球菌的处理用4个经过灭菌的250ml,装有lOOmJ牛肉膏蛋白胨液体培养基的三角烧瓶.并编号为1—4号.在无菌操作条件下进行金黄色葡萄球菌接种,用通气塞扎好El,37?,170r/min的条件下摇床培养12h后,分别加入最低杀菌浓度(MBC),最低抑菌浓度(MIC)和低于抑菌浓度的NdC13,加入量见表1.以不加NdC1为空白对照组.继续培养60h,待用.1.5细胞壁破碎将细菌培养液在6000r/min下离心20min.收集的金黄色葡萄球菌用生理盐水离心洗涤2—3次,放入冰箱中冻融5-6次.用pH为7.2的磷酸盐缓冲液制成细胞悬浮.置于冰水浴中.用超声波细胞粉碎机,调输出功率100W,处理30min,在镜下观察细胞全部破碎.本文2007年3月1613收到.2007年7月2013接受.基金项目:国家自然科学基金项目(20261005)资助,内蒙古自治区高等学校研究项目资助.内蒙古自然科学基金项目(20001302)资助."通讯作者.E—mail:xym@imut.edu.cn438霍光华张冬艳张通40卷1.6细胞壁的提取将破碎的细胞在1000r/min下离心10min,沉淀去除未破坏的细胞.上清液在20000r/rain下冷冻离心20min,沉淀取细胞壁层.用生理盐水离心洗涤2—3次.每次皆去除沉淀物和上清夜交界部分及离心管底部未破坏的菌体,获得粗细胞壁.每100mg粗细胞壁用5mL,pH值为7.2的磷酸盐缓冲液充分悬浮,加入501xL脱氧核糖核酸酶溶液,37cc作用1h.每100rag粗细胞壁加入胰蛋白酶溶液501xL,37qc缓慢搅拌2h.在1000r/min下离心10min,取上清夜,再在20000r/min下低温冷冻离心20rain,取沉淀.沉淀物用二次蒸馏水低温冷冻离心洗涤3次,收获沉淀,即为精细胞壁,置于4?冰箱备用.1.7细胞壁中氨基酸含量分析样品中氨基酸含量分两次测定,先测定样品的游离氨基酸含量,再采用盐酸水解法测定样品中的总氨基酸含量.细胞壁的氨基酸含量计算公式为:细胞壁的氨基酸含量=总氨基酸含量一游离氨基酸含量准确秤取一定量的待测样品(精确到0.0001),加入6mol/L盐酸15ml,抽真空封口.+110~C条件下水解22—24h.过滤,定容50mL,取1mL滤液在小于40~C条件下减压蒸干.用0.02mol/L盐酸定容.采用氨基酸自动分析仪定量分析氨基酸.1.8细胞壁的红外光谱检测方法同文献[3].2结果2.1细胞壁透射电镜观察结果采用透射电镜负染片技术,比较NdC1处理前,后细胞壁的形态特征有何变化,如图1至图4所示.与对照图l相比,图3和图4中的细胞壁的碎片面积明显减小,透光度增强,碎片厚度变薄.而在图2中,细胞壁的碎片面积明显增大,碎片厚度变化不明显.细胞壁的形态变化与Nd3浓度相关.抑菌和杀菌浓度的Nd,对细胞壁的损伤程度较为严重.而低于抑菌浓度的Nd对细胞壁的损伤不明显.2.2细胞壁中氨基酸含量分析经NdC1处理后的细胞壁氨基酸定量分析结果见表2.细胞壁氨基酸含量变化分析结果见表3.金黄色葡萄球菌的细胞壁中共有四种氨基酸,四肽尾是以L一丙氨酸一D一谷氨酸一L赖氨酸一D一丙氨酸形式连接而成的,肽桥为甘氨酸五肽.与不加NdC1比较,加入低于抑菌浓度NdC1,细胞壁中氨基酸含量明显上升,有以甘氨酸和赖氨酸增加明显.甘氨酸五肽在肽聚糖网状结构中起着连接前后2个四肽尾分子的"桥梁"作用.NdC1是在菌培养12h和加入后又继续培养60h.实验结果说明了Nd参与细胞代谢活动,低于抑表1在茵液中加入NdCI3的浓度(mol/L)Table1ConcentrationofNdCI3inbacteriumUquid(mol/L)图1S.aureu$细胞壁(×20000)Fig.1Cellwallofaureu图2低于MIC处理的细胞壁(×20000)Fig.2CellwallaftertreatedbyNdCI3belowMIC6期稀土离子(Nd)对金黄色葡萄球菌细胞壁结构的影响439图3MIC处理的细胞壁(×2O000)Fig.3CellwallofaftertreatedbyNdCI3inMIC图4MBC处理的细胞壁(×2O000)Fig.4CellwallofaftertreatedbyNdCI3inMBC表2细胞壁氨基酸定量分析结果(mg/100mg)Table2Contentofaminoacidincellwall(mg/100mg)表3NdCI处理后的细胞壁氨基酸含量增长率(%)Table3IncreaserateofaminoacidincellwallaftertreatedbyNdCI3(%)菌浓度NdC1能促进金黄色葡萄球菌细胞壁的合成,加固肽聚糖的网状结构.与不加NdC1比较,加入杀菌浓度NdC1,细胞壁中氨基酸含量明显下降,约降低了2倍以上.丙氨酸含量下降最多.为82.52%.下降幅度依次为丙氨酸>谷氨酸>赖氨酸>甘氨酸.虽然甘氨酸下降最少,但因甘氨酸分子量小,实际上受损害是严重的.实验结果说明了大于抑菌浓度NdC1能破坏细菌细胞壁结构.细胞壁中氨基酸含量的变化程度与Nd浓度呈正相关.抑菌和杀菌浓度的Nd对细胞壁的损伤程度更为严重.2.3细胞壁的红外光谱检测结果经NdC1处理后的细胞壁红外光谱检测结果见图5,图6,图7和图8.主要红外光谱吸收频率(cm)及归属见表4.图5中IR谱是金黄色葡萄球菌细胞壁肽聚糖层糖,肽的特征吸收.在1659.74cm和1541.96cm出现可分别归属于细胞壁肽聚糖层酰胺(O=CN—H)I谱带的C=O伸缩振动带(=0)和酰胺?谱带的C—N伸缩与N—H弯曲振动偶合产生的吸收带VC-N+~N州l5-6].从图6至图8中的峰形及表3中数据可见,经低于或等于抑菌浓度的NdC1,处理后,峰的强度基本没有改变.当经杀菌浓度的NdC13处理后,vc=0带和vcIN+8N-H带红移;在533.14cm处出现的1)Nd一伸缩振动吸收谱带.说明了Nd,+使大部分的肽键受损断裂.肽键受损断裂的程度与Nd,+浓度呈正相关,浓度越大,损伤程度越严重.图5中1075.96cm谱带指认为糖类羟基(一C一0一H)的0一H变形和C一0伸缩振动偶合产生的吸收带(vc-o+8oIH)Es].在图6至图7中,Nd可能与糖霍光华张冬艳张通40卷?e,9瓣旨重?e,9斜旨盔400030o020o010o0波数Wavenumbers图5金黄色葡萄球菌细胞壁的红外光谱图F-g.5IRspectraofcellwall40o0300020o01000波数Wavenumbers(cm一1)图6加入低于MICNdCI处理后的细胞壁的红外光谱图Fig.6litspec~aofcellwallaftertreatedbyNdCI3belowMIC类羟基的氧原子发生络合作用而引起v.o+8..H由1075.96cm红移至1070.84cm一,在图8中由1075.96cm蓝移至1081.08cm-.图5中3288.19/cm谱带指认为肽链侧链的氨基酸残基离子化氨基(.N—H+)的伸缩振动带(vNH)].在图6至图8中,Nd3+可能与大部分氨基的氮原子螯合配位,导致伸缩振动带vNH蓝移,并且强度大幅度减弱在图7和图8中伸缩振动带vNH消失.而伸缩振动带vc.红移不明显.在图8中,VOH峰为多聚缔合羟基吸收带口].经杀菌浓度的NdC1处理后,该谱带由钝峰变为锐峰,说明了缔合的氢键可能断裂,羟基游离【9_.可以断定是Nd3+使氢键断裂,破坏了肽聚糖的立体结构.3讨论以上实验结果说明了Nd可使金黄色葡萄球菌细胞壁的形态和结构发生改变.NdC1浓度不同,影响结果不同.低于抑菌浓度的NdC1对金黄色葡萄球菌细胞壁的合成具有促进作用;高浓度(指杀菌浓度和抑菌浓度)NdC1,可断裂细胞壁中肽聚糖的大部分肽键,Nd与肽键断裂后游离氨基中的氮原子有直接的键合作用;Nd使098765432JD????n?如6期稀土离子(Nd)对金黄色葡萄球菌细胞壁结构的影响441模模0.600.550.500.450.400.350.300.250.200.150.104000300020001000波数Wavenumbers图7加入MICNdCI3处理后的细胞壁的红外光谱图Fig?7IRspectraofcellwallaftertreatedbyNdCI3inMIC0.220.200.180.160.140.120.100.080.060.040.024000300020001000波数Wavenumbers(cm-)图8加入MBCNdCI3细胞壁的红外光谱图Fig.8IRspectraofcellwallaftertreatedbyNdCI3inMBC表4NdCI3处理前后金黄色葡萄球菌细胞壁的主要红外光谱吸收频率(cm一)及归属Table4SignificalIRabsorptionfrequencies(cm-)andasc~ptionofcellwall氢键断裂,破坏肽聚糖的立体结构.由此可见,一定浓度的Nd3+可使细胞壁中厚而致密的肽聚糖交联网状结构遭到破坏.结构变得稀疏,网孑L增大.导致细胞壁通透性增大.破坏作用与Nd.浓度呈正相关,浓度越大,损伤程度越严重.?0暑.Ios《II嘟qJ象1q《442霍光华张冬艳张通40卷参考文献[1]Schleifer,K.H.&O.Ka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