麻杏石甘汤不同配伍中（可编辑）

麻杏石甘汤不同配伍中（可编辑） 学校代号 10199 学 号 200701074 硕 士 学 位 论 文 麻杏石甘汤不同配伍中 钙及相关无机离子的研究 学位申请人 陶 贵 斌 指导教师姓名职称 贡济宇 教 授 专 业 名 称 药物分析学 培 养 方 式 全 日 制 申请学位类型 科 学 学 位 论文提交日期 2010年 4 月 分类号 密级 UDC 编号 硕士学位论文 麻杏石甘汤不同配伍中 钙及相关无机离子的研究 陶 贵 斌 指导教师姓名:贡济宇教 授 (长春中医药大学) 申请学位级别: 硕 士 专业名称:药物分析学 论文提交日期: 2010年 4月论文答辩日期: 2010 年 6月 学位授予单位: 长春中医药大学 ?2010 年 6月 提交确认:作者签名 导师签名: 长春中医药大学学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是个人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经特别加以注明引用的内容外,本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名 年 月 日 关于学位论文成果归属权的声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师指导下自选课题或导师承担的国家立项资助的课题的一部分,系本人在导师指导和资助下独立进行研究工作所取得的成果,归属权为长春中医药大学和本人导师所有。特此声明,本声明的一切法律责任由本人承担。 论文作者签名 指导教师签名 年 月 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解长春中医药大学有关保留使用学位论文的规定,同意学校保 留并向中国科学技术信息研究所及中国学术期刊(光盘版)电子杂志社送交论文的复印件和电子版,允许被查阅和借阅。本人授权长春中医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》及《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》进行检索,可以采用影印、缩印或其他复印手段保存和汇编本学位论文。 (保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名指导教师签名 年 月 日 目 录 中文摘要 1 英文摘要 2 前 言 4 文献综述 6 一 中药配伍物质基础研究 6 1 确定研究重心深化“配伍”概念 6 2 研究方向 6 3 复方研究 7 二 麻杏石甘汤的研究进展 8 1 麻杏石甘汤中有效成分提取分离方法 8 2 麻杏石甘汤有效成分的研究进展 9 3 麻杏石甘汤中无机离子的形态分析及含量测定方法 10 4 药理作用 14 5 麻杏石甘方剂的临床研究 15 三 小结 16 四 展望 16 实验研究 17 一 材料 17 1 药 材 17 2 实验材料与试剂 17 3 实验仪器 17 二 实验内容 17 1 供试品溶液的的前处理 17 1.1 供试品溶液的制备 17 1.2 供试品的处理 18 2 总钙、结合钙、游离钙的含量测定 18 2.1 测定方法 18 2.2 标准溶液的配制与标准曲线 19 2.3 方法学考察其它无机离子总含量的测定 19 2.4 供试品溶液中游离钙与结合钙的含量测定 23 3 其它无机离子总含量的测定 27 3.1 标准溶液 28 3.2 供试品溶液中Cu2+、Fe3+、Mg2+的含量测定结果 29 结果和讨论 31 1 无机离子含量测定的方法选择 31 2 石膏单煎液中无机离子与有效成分的相互作用 31 3 麻杏石甘汤不同配伍后钙离子的存在形式 31 致 谢 33 参考文献 34 中文摘要 本文对麻杏石甘汤不同配伍中无机离子的含量测定以及钙的存在形式进行了研究。 通过原子吸收分光光度法测定麻杏石甘汤不同配伍中钙的含量,研究配伍对钙含量的影响,比较生甘草与炙甘草对钙含量的影响。测定方法的回归方程为Abs0.00591C+0.00036,相关系数r0.9998,加样回收率为101.4%。麻黄和杏仁分别使石膏溶出量增大,甘草使之降低,而炙甘草比生甘草的降低效果更为显著,共煎药液中石膏中钙的溶出量没有明显的增大。不同配伍对麻杏石甘汤含钙量影响明显,本实验为研究麻杏石甘汤的配伍规律提供一定的依据。 通过L9(34)正交试验来确定732#型阳离子交换树脂分离游离钙和结合钙的最佳实验。方差分析表明,以稀释后样品的浓度为指标,影响结合钙与游离钙分离工艺因素的作用顺序为交换柱的柱高>上样量>收集液的量>洗脱液的量,交换柱的柱高、上样量和收集液的量的影响有显著性差异,而与洗脱液的量无明显差异,同时还应考虑到经济这方面的因素,最佳工艺:上样量为100 ml、离子交换柱柱高8 cm、洗脱液的量为50 ml、收集液的量为115 ml。 采用全自动固相萃取仪分离游离钙和结合钙,与离子交换树脂其分离效 果进行对比。由全自动固相萃取仪分离麻杏石甘汤不同配伍中的结合钙,其含量 测定普遍较离子交换柱所得到结合钙的含量高。从结合钙和游离钙含量测定结果 来看,全自动固相萃取仪其精密度要远远高于离子交换树脂,同时也大大地减少 了人为误差。 本文的实验研究为麻杏石甘汤的复方有效成分研究奠定了基础。 关键词:麻杏石甘汤 配伍 无机离子 结合钙 游离钙 离子交换树脂 含量测 定 ABSTRACT The article of ingShi Kennedy soup in the compatibility of different inorganic ions content determination of calcium and forms are studied The Ca content which blends differently through atomic absorption spectrophotometric method determination hemp apricot Shi Gantang, the research blends to the calcium content influence, with roasts the licorice compared with the fresh licorice to the calcium content influence. The determination method's regression equation is Abs0.00591C +0.00036, correlation coefficient r 0.9998, adds the type returns-ratio is 101.4%. The ma-huang and the almond cause the gypsum to dissolve the output separately to increase, the licorice causes it to reduce, but roasts the licorice to live the licorice to reduce the effect to be more remarkable than, altogether decocts medicinal herbs in the fluid in the gypsum the calcium to dissolve output not obvious enlargement. Blends differently to hemp apricot Shi Gantang the calcareous quantity influence is obvious, this experiment blends the rule for research hemp apricot Shi Gantang to provide certain basis. Through L9 34 orthogonal test to determine 732 # type of cation exchange resin,combination with calcium separation stroke-prone experiment scheme. L9 34 anova table shows that the concentration on diluted sample for index, calcium and influence factors of separation technology stroke-prone order:the high of cation exchange resin,exchange of sample weight,the amount of collecting liquid, the eluent. In the analysis of variance in the table, the exchange, the sample weight on the column of collecting liquid and the effect of significant difference, while the eluent is no obvious difference, still should also consider the factors, the optimal process: for 100 ml samples, ion-exchange column column high 8cm, the eluent 50ml, for the amount of 115ml for collecting liquid. Using automatic solid-phase extraction apparatus, and combined with calcium separation stroke-prone with ion exchange resin in its separation results are compared. Through the automatic solid-phase extraction apparatus ingShi separation of compatibility with wigan soup is different, its content determination of calcium is generally ion-exchange column are combined with high calcium. From the combination of calcium and content determination result, stroke-prone full-automatic solid-phase extraction apparatus its precision than ion exchange resin, also greatly reduce human error. Key words:Hemp apricot Shi Gantang Blending inorganicions Combined with calcium stroke-prone Automaticcation exchange resin Content determination 前 言 中药配伍理论是中医药理论的精华之一,开展复方制剂配伍规律的研究对继承和发展中药配伍理论有重要意义,其药效物质基础及量效关系的研究是阐明中药配伍规律,进而合理应用的基础和关键。中药复方的组成往往是一个有层次和结构的有机整体,其疗效是复方中各成分的综合结果。中药复方的物质基础研究应以其化学成分的组合、量比和相互共同作用为特色;探索复方制剂过程中化学成分的变化规律,可为优化处方、制定科学的制剂工艺、提高制剂质量提供依据,同时,通过复方的药效和物质基础的研究,还可以为开发新药奠定理论和方法学基础,开拓具有中国特色的创制新药的新领域、新途径、新方法。 麻杏石甘汤出自汉代医圣张仲景的《伤寒论》,由麻黄、杏仁、炙甘草、石膏四味药组成,具有辛凉宣肺、清热平喘的功效。麻黄为麻黄科植物草麻黄(Ephedra sinica Stapf.)的干燥草质茎,杏仁为蔷薇科植物山杏(Prunus armeniaca //.u im.)的干燥成熟种子,甘草为豆科植物甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)的干燥根茎(炙),石膏为含结晶水硫酸钙(Ca2SO4?2H2O),方中麻黄和石膏共为君药,杏仁降利肺气而平喘,为臣药,炙甘草益气和中,为佐使药。临床上常用于治疗急慢性支气管炎、支气管哮喘。近年来,世界卫生组织的 生物医学专家们倡导临床医学的个体化具体治疗方法, 引起了医药界同仁们的极大关注,有认为个体化具体治疗方法是临床试验的最高层次, 这种观念无疑将对辨证论治为指导的麻杏石甘汤临床研究起到巨大推动作用。 中药复方是一个复杂体系。通过对麻杏石甘汤探索性研究结果可以提示,其总疗效并不一定是多个药效物质生物效应的简单叠加,方中的化学成分不等于方中单味药化学成分之和,在煎煮过程中还可能生成新的有效组分而产生生物效应。如三黄泻心汤全方的化学成分在煎煮后,即产生新的成分,经进一步分析,其新成分可能是在共煎过程中生成的,并与量的配比有关。 针对本课题研究,课题研究组现提出以下两种假说:?中药复方的组效关系论即:中药复方的药效作用有赖其物质基础,即所含的化学物质组或药效活性物质组(可能是一种或多种化学物质)其与所适应的证候(功效)存在相关性,我们将其称之谓组证关系(Composition-syndrome relationship)或组效关系(Composition-activity relationship)。通过活性组分与证侯间的相关性研究,可以寻找和揭示复方的配伍规律、药效作用机制等一系列核心问题,解决制约中药复方配伍机制和作用规律研究的“瓶颈”问题。?复方中的化学成分(包括药材原有的无机成分、有机成分以及复方配伍后生成的各种新成分)共同构成复方的物质基础。中药复方的配伍过程即是复方中固有物质成分的相互作用过程,即复方中化学物质的自然修饰过程,这种自然修饰导致复方中化学物质在组成和含量上的变化,其中与复方治疗症候相关的化学物质群,即为该方的活性物质组。 中医以石膏清阳明气分之热,除热盛之烦躁。《伤寒论》中以石膏为主的白虎汤、麻杏石甘汤为清热名方。以往药理学认为石膏可增加血钙浓度,抑制神经性激能,减低血管渗透性,故有解热、镇痉、抗敏作用。清热之功主要是钙离子 的作用。但据报道,石膏所具有的退热作用与其主要成分硫酸钙无关,因此石膏之清热作用还应注意钙以外的其他物质。据分析,微量元素在解热作用中可能起着一定作用,但需与有机成分“协同”地作用。此外还应指出,据现有药理实验,若排除钙的药理作用,其理由尚嫌不足。 汤剂中除Ca2+之外,还有其它无机离子如:Cu2+、Mg2+、Fe3+等可与有机成分形成络合物,近年已有研究表明,中药的药效可能与其微量元素的种类和含量、存在状态以及配位化合物存在着一定的关系故对中药材中微量元素的含量与其药效的研究,其含量测定方法也受到学者们的广泛关注。 到目前为止,单味药基础实验研究开展得较为深入,但仍存在着化学成分与生物活性研究的脱节现象,既往那种分离、提取、再合成的研究方法,虽取得了一定成就,但失去了复方药味有机配伍的特性。我们认为多学科交叉渗透以及高科技手段引入仍然是单味药研究的先导,其目的是搞清单味药药效作用的物质基础,为本汤剂的研究提供可靠依据。 本课题主要研究麻杏石甘汤配伍前后无机离子Ca2+、Cu2+、Mg2+、Fe3+等的含量变化情况。经过文献查找调研,发现对于研究麻杏石甘汤有机成分(如麻黄碱、苦杏仁碱、甘草酸)文献较多,在汪洋“麻杏石甘汤中微量金属测定方法的改进”的基础上进行深入研究。这些研究有助于对复方各味药的配伍用量的优化;同时有助于选择工业化大生产的最佳制备工艺;以及明确复方中无机成分使制剂的疗效和质量研究有了必须的基础。 文献综述 一 中药配伍物质基础研究 1 确定研究重心深化“配伍”概念 中药复方是由其各组成要素(单味药)通过一定的配伍关系而构成,具有一定的治疗功能.但是,中药复方系统的功能绝非其各组成药物功能(元功能)的简单相加(原功能)[1-2]。因为系统的功能主要取决于系统的结构[3].系统内部诸要素的有序结合,会使系统具有比原功能大得多的功能,也会出现原功能中所没有的新功能.因此,中药复方作为一个系统,它的功能是原功能与构功能之和(这里,随所考察的系统的不同功能,构功能可以为正,亦可为负)。如广泛应用于临床的麻杏石甘汤,具有辛凉疏表,清肺平喘功能。并非其各组成要素麻黄、杏仁、甘草、石膏四味药功效的简单相加,而是由上述诸药严谨的配伍结构所产生的构功能与其原功能两者共同决定的系统功能.这已初步为现代实验研究所证实.可见,中药复方系统功能具有“非加合性” 符合结构挟定功能的命题.因此,马有度[4]认为中药复方研究的重心应放在揭示配伍结构上.只有把复方系统的配伍关系搞清楚,找出其规律性,才能确切地阐明复方的作用机制,从而为临床实践的灵活运用提供科学依据改变当今许多医生临证杂凑成方的状况. 2 研究方向 2.1 单味中药研究 2.1.1 麻黄 麻黄中所含的生物碱和挥发油是其有效成分,其中麻黄碱(Ephedrine)、伪麻黄碱可解除支气管痉挛,松弛支气管平滑肌,且作用较缓而持久[5]。麻黄应仅取草质茎入药。因麻黄草质茎中生物碱的含量分别约为过度茎和木质茎的9.35倍,挥发油的含量分别为后者的2~3倍[6]。 2.1.2 杏仁 杏仁中的有效成分是苦杏仁甙(Amygdain)。杏仁含有苦杏仁甙约3%,苦杏仁甙受杏仁中的苦杏仁酶(Amygdalase)及樱叶酶(Prunase)、β-葡萄糖甙酶等水解,依次生成野樱皮甙(Prunasin)和扁桃腈(Man-delonitrile),再分解生成苯甲酸和氢氰酸;因其分解后而产生的氢氰酸可镇咳及祛痰;而达到润肺止咳的效果[7]。亦含有脂肪油(杏仁油)约50%,在肠内起润滑通便作用;因大肠与肺相表里,可通肠气,所以有清泄肺卫之郁热,而达到止咳、平喘的效果[8]。杏仁生用不宜捣碎存放,炮制以蒸品为好。近年实验发现,生杏仁粗粉室温干燥条件下存放3天,苦杏仁甙可损失20%;而生杏仁待水沸后,以流通蒸气蒸20min,低温干燥所得的蒸品,其煎液中苦杏仁甙含量最高。提示苦杏仁处方应以蒸品为佳。若生用者不宜捣碎存放,应临时制备。 2.1.3 甘草 甘草中含甘草酸(Glycyrrhizic acid)及18a-甘草次酸(18a-glycyrrhetinicacid),可经由吸附作用和肾上腺皮质激素(adrenocorticol hormome)作用,达到抗炎、抗过敏反应及抑制平滑肌活动而解痉的目的[9]。 2.1.4 石膏 方中生石膏的成分主要含有硫酸钙(CaSO4?2H2O)对支气管神经、肌肉有抑制及镇静的作用,加上钙质能降低支气管通透性,故有解除支气管痉挛的作用[10]。 3 复方研究 中药复方是依据严谨的中医药配伍理论而组成的,绝不是简单的单味药相加。所以复方的物质基础研究也应该体现整方的化学研究。复方的研究历来以 拆方为主,整方研究却很少见。当然拆方研究也有其价值,因为单味药的化学成分有相当一部分在复方中并未变化,所以从单味药的研究可以在一定程度上窥探复方的化学组成。也有避繁就简之方便。 从新药发现的角度来看,也不排除有发现新的天然药物的可能性。如中医临床实践中认为当归芦荟丸对慢性粒细胞型白血病有肯定疗效,在几家单位的协作下,发现青黛中的靛玉红除对慢性粒细胞型白血病有效外[11],对急性粒细胞型白血病也显示了疗效,但拆方的思想方法是在近代还原论方法的影响下形成的。复方的研究可以有拆方的思路,但也应体现系统的思想。“系统论”指出,“整体大于部分之和”。复方是由单味药组成,但绝不等于单味药的简单罗列,从功效上讲,其不是相加关系,而是相乘的。西药是现代有机化学合成的产物,生物体中的次生代谢产物是生物合成、生物代谢的结果,而中药复方这个巨系统中,由于制剂过程中的热、光、酶和溶媒作用(这相当于反应条件),一些适合反应的成分会因此形成新的物质(不妨把它称为天然化学反应)。这种新的物质也不能说就是有效成分,但这种反应的可能性是存在的,它反映了复方动态过程的复杂性,也是拆方研究不容易发现的。如日本学者原田[12]等在研究麻黄汤时发现,麻黄汤中的苦杏仁甙在酶的作用下生成苯甲醛,这些醛类成分又与麻黄碱作用生成了一种新化合物。虽然新化合物不稳定,在热水中分解成具有麻黄碱,桂皮醛和苦杏仁苷相类似的作用。但这说明反应是可以发生的。又如鞣质与生物碱的生成沉淀反应,可能是避免副作用的有利反应。 复方中除了质的变化以外,量的变化是较常见的。如皂苷类,粘液质类成分的助溶、增溶作用,成分反应造成溶解度增加的现象等。量的变化是很重要的,中医有句话:“中医不传之秘在量也。”实际上,宏观上药味不变,仅仅药量的变化 就可能成了功效不同的另一方。如由麻黄、苦杏仁、甘草和石膏四味药组成。具有辛凉疏表,清肺平喘之功效。所以复方的研究如果脱离了整体思想,将仍然是不够完全的。当然整方研究的难度较大,但如果在现代科技的各种材料、技术,尤其是药理的配合下,并不是无法进行的。刘氏[13]等用中药的有效部位作指示成分来控制生产投料量,并采用均匀设计方法来筛选处方,使制剂具有较为稳定的疗效基础,从而增加中药药理可信度和重复性。李氏[14]等采用均匀设计方法筛选出牡丹皮与薄荷的最佳配比剂量,研究表明,最佳配比的剂量组药理药效作用显著,呈明显的量效关系。 二 麻杏石甘汤的研究进展 1 麻杏石甘汤中有效成分提取分离方法 麻杏石甘汤属于中药复方,与中药材单味药提取分离有诸多不同,中药复方提取分离工艺,一般说来,各种方法有自己的优缺点,使用时应在中医药理论指导下,保持中医方剂特色,根据中药复方中有效部位、有效成分及其性质等具体问题选用合适的方法。 由于本复方汤剂中药物成分有不同的特点,参考部分文献[15]并结合本处方中所含有的化学成分,可有水提取法、减压水提法、单提挥发油法、半仿生提取法(简称SBE法)[16-19]。 1.1 水提取法 按照处方比例称取药材,加水煎煮三次,加水量分别为药材重量的10、6、6倍,提取时间均为1小时。合并煎煮液,滤过,浓缩至适宜的量即得。 1.2 减压水提法 在水提法中由于温度过高,可能会对部分有效成分造成破坏,因此可在减压的条件下按水提法的操作进行提取。 1.3 单提挥发油法 将处方中的几种药材单独蒸馏收集挥发油,药渣再按处方比例同其余的原料药按水提法操作,最后将挥发油和煎煮液合并即得。 1.4 半仿生提取法 模拟生物体内药物吸收的特点,通过调节水提法中煎煮液的pH值来提取药物的有效成分。 近几年,中药复方在提取方面又有了新的进展。如复方超临界萃取工艺、半仿生提取法、微波萃取法等。这些方法与传统的中药活性成分提取技术相比,具有简便、快速高效、选择性强、能耗少和环境污染小等优点,因而越来越得到相关领域研究人员的关注。同时,也使中药复方的提取更省时、省力,易于操作。 2 麻杏石甘汤有效成分的研究进展 2.1 复方配伍对麻黄碱含量的影响 麻黄是麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica、木贼麻黄equisetina burge、中麻黄intermedia schrenk et C、A.mey的干燥草质茎。麻黄是我国特产药材也是常用中药,其主要化学成分是麻黄碱,此外还含有少量伪麻黄碱。选杏仁、甘草、石膏作为3个因素选用药和不用药2个水平采用 (2 )正交试验[20],结果石膏和甘草对麻黄碱有降低的作用,杏仁和石膏、甘草和杏仁的交互作用影响不明显,杏仁、甘草、石膏单味药对麻黄碱无明显影响。全方共煎药液中麻黄碱含量降低。甘草和石膏共用,使全方中麻黄碱含量降低。将方药组分为15组[21],用半仿生提取,采用薄层色谱对盐酸麻黄碱进行定性,高效液相色谱定量,结果发现只有麻黄和石膏,甘草和苦杏仁合煎盐酸麻黄碱溶出量最大。 2.2 复方配伍对苦杏仁苷含量的影响 杏仁为蔷薇科落叶乔本植物山杏胁 armeniaca L.val".ansan西伯利亚杏P.sibirical东北杏P.mandshurica (im) koehne或杏P.armeniaca L.的成 熟种子。杏仁中含有苦杏仁苷及脂肪油、蛋白质、各种游离氨基酸[22]。苦杏仁苷属于氰苷类。选用麻黄、甘草、石膏为3个因素,用药和不用药2个水平采用k(27)正交设计,以HPLC法测定苦杏仁苷的含量,结果石膏对苦杏仁苷有明显降低作用。甘草、麻黄,甘草与麻黄、甘草与石膏、麻黄与石膏对苦杏仁苷含量影响不明显。 2.3 复方配伍对石膏溶出量的影响 生石膏的主要化学成分为含水硫酸钙(CaS04?2H20)。此外,尚含有少量的硅酸、氢氧化物及微量铁、锰、铜等元素,煅石膏为无水硫酸钙[23]。药理作用表明:石膏能缩短血凝时间促进胆汁排泄,并有利尿的作用。选用麻黄、杏仁、甘草3个因素用药和不用药2个水平采用k(27)正交设计,用EDTA络合法测定硫酸钙的含量。结果杏仁、麻黄增加了石膏的溶出量,甘草降低了石膏的溶出量。麻黄、杏仁、甘草,杏仁与甘草、杏仁与麻黄、甘草与麻黄对石膏溶出量的影响不显著。 2.4 复方配伍对无机离子的影响 用络合滴定法、原子吸收分光光度法测定石膏与麻黄按不同比例配伍的麻杏石甘方剂中Ca等十一种金属元素的含量[24]。结果表明,当石膏剂量不大时,大部分金属元素的含量随麻黄剂量的增加而增大;当麻黄剂量不大时,Ca含量随石膏剂量的增大而增大,其他元素的含量没有明显变化。临床上热重时多用石膏,其疗效与哪些物质有关,还需要进一步研究。 3 麻杏石甘汤中无机离子的形态分析及含量测定方法 3.1麻杏石甘汤中结合钙、游离钙获得的方法 3.1.1 离子交换树脂[25-26] 离子交换树脂是一类能进行离子交换的功能性高分子聚合物,具有特殊的网状结构,依据树脂合成时所用的原材料来看,目前的树脂可分为酚醛型、聚苯乙烯型、环氧型和丙烯酸型,其中以聚苯乙烯型比较普遍,化学性能稳定,交换容量大。一直以来广泛应用于分析化学、食品及医药行业等领域。曾环想、程刚[27]等人对该方法在药物传递系统中的应用做了相关概述,从离子交换树脂的种类、性能、掩味作用、稳定作用、促溶作用、缓释作用等方面做了介绍。随着现代化有机合成技术的迅速发展,更多性能优良的离子交换树脂的问世,为今后的科研做出更大的贡献。 3.1.2 固相萃取仪 固相萃取是从20世纪70年代初发展起来的样品富集技术,特别适用于水样处理。是一种填充好固定相的短色谱柱。当液体样品通过固相吸附层时,基体被除去,待测物被富集,然后用少量溶剂(10~20m1)洗脱回收待测物。固相萃取的原理是利用组分与吸附剂(固定相)间选择性吸附与选择性洗脱的过程,达到提取分离、净化和富集的目[28]。郑春英等[29]Sep-pak固相萃取柱分离连翘超声提取液,并用水及25%甲醇洗去杂质,50%甲醇洗脱下连翘苷,最后用HPLC分析控制连翘的质量。白果种子中的主要有毒成分4一氧甲基吡哆醇(MPN)可用C18固相萃取柱提取分离后用二极管阵列检测器高效液相检测,以10%乙腈一磷酸缓冲液(PH3)作为流动相。红豆杉属植物中的紫杉烷类化合物具有独特抗癌作用,雒丽娜等[30]用PRP-6固相萃取柱来 预处理提取液,纯化效果显著,分析结果准确可靠且可重复使用。 用固相萃取分离皂苷类物质。在用高效液相色谱-蒸发光散射检测(HPLC?ELS D)法测定三七药材中人参皂苷Rg、Rb和三七皂苷 R l的含量试验中,黄永焯等[31]用 Ac-cuBOND? ODS固相萃取柱对三七药材粉末提取液进 行预处理,并对该柱的分离性能作了检测。也有用 Kromasil ODS柱分离刺五加制剂后用 HPLC测定其刺五加苷B、苷E的含量[32] 。 在分离黄酮类物质的研究中固相萃取也有举足轻重的作用。陈蕾等[33]用酸性氧化铝固相萃取柱纯化菊延保康颗粒剂样品液以测定隐丹参酮、丹参酮I和丹参酮 ?。方继辉等[34]用Sep-Pak C18 微柱处理中成药的提取液以测量葛根素的含量。测定香砂养胃丸中橙皮苷的含量也可用Sep-Pak C18 微柱净化处理样品溶液再用高效液相测定。从槐米中提取芦丁的试验中也用到固相萃取,李力更等[35] 用Agilent ?C18微柱分离,固相萃取一分光光度法(SPE?U v) 建立了测定中药槐米中芦丁含量的经济、简便、快速、准确地分析处理方法。此种固相萃取柱也可被用来分离淫羊藿苷。固相萃取也用于生物碱的分离。有报道用C18 固相萃取小柱纯化菊延保康颗粒以测定延胡索乙素[36]。林估等[37]使用 WATERS公司HLB型固相萃取小柱分析药酒中的番木鳖生物碱,并用GC/MS测定,结果令人满意。3.2 麻杏石甘汤中无机离子含量测定的方法 目前,对于麻杏石甘汤中无机离子的含量测定研究较少,通过查找文献,出有以下几种对无机离子的测定方法,可参考这些方法来测定本汤剂中的无机离子: 3.2.1 酸碱滴定法 酸碱滴定法是以酸碱反应为基础的滴定分析方法,是滴定分析中的中药方法之一。陈志强、武志富[38]等人利用此化学方法测定几种贝类中药钙的含量,测定的结果与红外光谱测定的结果相一致,结果准确度较高,实验操作简便。 3.2.2 络合滴定法 又称配位滴定法,是以配位反应为基础的滴定反应。孙彩云、刘端[39] 等人采用EDTA络合滴定法测定鸡蛋壳样品中的钙、镁含量,方法准确可靠,简便易行。 3.2.3 紫外分光光度法 程国华[40]利用此方法进行亚叶酸钙含量测定,其设备简单,操作方便,是药学、中药学科研及生产实践中最常用的方法之一。 UV?v is是基于物质对紫外?可见光辐射的选择性吸收来进行分析测定的方法。金属微量元素本身在紫外?可见区没有强吸收,或在紫外区虽有吸收但为了避免干扰或提高灵敏度,可加入适当的显色剂,发生配位反应、氧化还原反应或者缩合反应后显色,产生强的吸收,利于测定。该方法应用广泛,操作简单快捷,仪器结构简单,并且具有较高的精确度与准确度,在当前有其实用意义[41]。刘建华等[42]将中药材消化,制得储备液,以1 mol/L NaAc溶液调节适pH值,以10%盐酸羟胺将Fe3+还原为Fe2+,加入0.15%邻二氮菲作为显色剂,与Fe2+形成红色二元络合物,混匀。静置后用紫外分光光度计在510 nm波长处以0.00 ml Fe标液为空白进行参比,测定各样品的吸光度,并通过标准曲线回归方程求出鱼腥草、石菖蒲、板蓝根、何首乌、柴胡、甘草、银杏叶、茯苓、黄芩等10种治疗呼吸系统疾病的中草药中Fe的含量。 3.2.4 原子吸收分光光度法(AAS) 本方法具有灵敏度高、选择性好、准确度高、抗干扰能力强、精密度高、分析速度快、应用范围广、仪器简单、操作方便等特点。目前能够直接测定的元素达70余种,它已成为一种常规的分析测试手段,得到广泛的应用。 AAS的测量对象是呈原子状态的金属元素和部分非金属元素,系由待测元素灯发出的特征谱线通过供试品经原子化产生的原子蒸气时,被蒸气中待测元素的 基态原子所吸收,通过测定辐射光强度减弱的程度,求出供试品中待测元素的含量。按照其原子化器不同AAS主要分为:火焰原子吸收分光光度法、石墨炉原子吸收分光光度法、氢化物发生原子吸收分光光度法及冷蒸气发生原子吸收分光光度法。 3.2.4.1 火焰原子吸收法 师长宏、高双斌[43]等人利用火焰原子吸收法测定血清中结合钙和非结合钙,可以比较彻底的把非结合钙分离出来。 该方法是以化学火焰使待测元素原子化,从而进行测量的方法。其操作简单,火焰稳定,重现性较好,但是原子化效率低,气态原子在火焰吸收区中停留时间很短,通常只可以液体进样。薛国庆等[44]1(v/v)HNO3?HClO4混酸将柴胡中药材消化完全,蒸发至近干,冷至室温,加浓HNO3及适量水溶解消化产物并定容得供试品溶液。试验中在对消化产物定容前加入一定量优级纯Sr(NO3)2(1%,m/m), 以消除硅酸根和磷酸根在对Ca2+测定中的干扰。平行测定栽培柴胡中Ca、Mg、Fe、Cu、Zn、Pb等元素含量,其加标回收率为99.57%~102.10%,RSD为0.18%~2.26%,准确度高,精密度好,且多元素同时测定无干扰。 3.2.4.2 石墨炉原子吸收分光光度法 该方法是在通入保护气情况下,以电热石墨炉将供试品溶液干燥、灰化,再通过高温原子化阶段使待测元素形成基态原子,从而进行测量的方法。该法试样用量少,灵敏度高,检出限要比火焰原子吸收法低1~3个数量级,选择性好,原子化效率几乎达到100%,基体干扰少,所以该方法准确可于各种元素的测定,但是由于取样量小,其重现性差,操作复杂。庄晓燕等[45]将枸杞子药材经炭化、灰化后以HNO3与水(双蒸馏水)溶解,制得待测液。以石墨炉原子吸收分光光度法测 定微量元素的吸光度,石墨炉升温程序为:首先干燥,干燥温度为80~120?,30 s;然后进行灰化、原子化、清除。根据测得的吸光度,由标准品的校正曲线求枸杞子药材中7种元素含量分别为:Co 0.091μg/g、Mo 0.339μg/g、Ge 0.671μg/g、Ni 1.095μg/g、V 0.245μg/g、Pb 0.610μg/g、Cd 0.030μg/g。 3.2.5 原子荧光光度法 该方法是将样品溶液在火焰或非火焰中原子化产生的基态原子,用光源照射激发,当受激原子返回低能态时,发出原子荧光,通过检测装置测定原子荧光强度从而测定样品中待测元素的方法。原子荧光光度法的检出限低于原子吸收法,谱线简单且干扰少,但线性范围较宽,仅用于测定As、Sb、Bi、Se、Te、Ge、Sn、Pb、Zn、Cd、Hg等元素。韩凤兰等[46]将自然干燥的宁夏黄芪样品用带有聚胺脂内衬的植物粉碎机粉碎,置马弗炉内220?焦化,取适量焦化样品在玛瑙钵中研成粒度约150目粉末,移至32 mm模具中,以28 t压力制备分析样片,采用原子荧光光度法测定Fe、Cu、Zn、Pb、Ni、Ba、Mn、Ca、Al等16种元素含量,其检出限在0.74~2.0μg/g,精密度RSD为0.2%~10.2%。 3.2.6 高效液相法 高效液相色谱是分析化学中发展最快、应用最广泛的方法之一。梁晓艳[47] 建立反相高效液相色谱法,同时测定钙镁D片中维生素D2和D3的含量,方法简单,易于操作,分离效果好,结果准确,受干扰因素小。 该方法利用微量金属离子与有机试剂形成稳定的有色络合物,然后用HPLC分离,紫外?可见检测器检测,克服了分光光度分析选择性差的缺点,可实现多元素同时测定[48]。卟啉类试剂具有灵敏度高,能和多种金属元素生成稳定的络合物,目前已广泛用作HPLC测定金属离子的衍生试剂[49]。杨亚玲等采用了 4?对氨基苯基?卟啉(T4?APP)柱前衍生,利用固相萃取富集技术实现Cu、Ni、Sn、Cd、Pb、Hg等的T4?APP络合物的高倍数富集,利用HPLC测定了三七、牛角天麻、无根藤和冬虫夏草中的Cu、Ni、Sn、Cd、Pb、Hg等含量,检出限分别为1.8×10-9、1.5×10-12、2.2×10-12、1.5×10-12、1.8×10-12、2.2×10-12ng/L,回收率分别为98%、102%、103%、99%、96%、102%[50]。综上所述,目前中药材中微量元素含量测定的方法既有经典的分光光度法,也有原子荧光光度法、ICP?AES法、ICP?MS法、HPLC法等新方法、新技术,其中ICP?MS法还因为检测限低,灵敏度高,且专属于元素分析而被2005版《中国药典》载入其中。 4 药理作用 4.1 镇咳作用 麻杏石甘汤回流液冷动干燥粉状物162mg/kg,对二氧化硫(Sq)气诱发的小鼠咳嗽有明显的镇咳作用,抑制率可达63.1%[51]。麻杏石甘汤加味剂、7g/kg醇提液腹腔注射,对氨水刺激小鼠所致的咳嗽有明显的抑制作用;麻杏石甘汤醇提液10g/kg静脉注射,对刺激麻醉猫喉上神经及机械刺激麻醉猫气管粘膜所致的咳嗽有明显的抑制作用,在给药后5min所有动物的咳嗽反应均消失,而给药后75-90min内咳嗽反应减弱,50%以上并恢复至接近正常,在镇咳同时对呼吸有轻度兴奋作用[52]。麻杏石甘汤1d用量溶于5倍量的精制水中,用胃导管注人雄性豚鼠胃内,以猫毛作物理刺激引起咳嗽反射,其结果有明显的镇咳作用[53]。另有报道,麻杏石甘汤中主要镇咳作用的中药为麻黄[54]。 4.2 祛痰作用 麻杏石甘汤加味水煎液、醇提液25g/kg腹腔注射,二者均使小鼠气管冲洗液酚红含量明显增加,说明本品具有一定的祛痰作用[55]。 4.3 解热作用 麻杏石甘汤10ml/kg(1g生药/m1)对伤寒一副伤函三联菌所致发热家兔有明显的降温作用,给药lh后即起效,较对照组降低1.27?[56、57]。麻杏石甘汤5.6g/kg对2.4一二硝基苯酚所致发热大鼠有较好的退热作用,维持作用可达4h[58]。 4.4 抗炎作用 麻杏石甘汤加味水煎液10g/kg腹腔注射,对甲醛引起大鼠足趾肿胀及绵球肉芽组织增生均有明显的抑制作用。麻杏石甘汤5.6g/kg对小鼠二甲苯耳肿胀及大鼠蛋清性足肿胀也有明显的抑制作用。另有报道,预服麻杏石甘汤组的家兔鼻腔与肺部病理变化显著低于观察组,说明本方能有效地保护家兔抵御肺炎双球菌对其呼吸道的影响[59]。 4.5 增强机体免疫功能作用 对麻杏石甘汤进行免疫药理实验,结果显示该方能提高小白鼠巨噬细胞的吞噬率和血清溶菌酶含量,促进淋巴细胞转化,从而使非特异性和特异性免疫功能均有所增强[60]。并可降低哮喘体内I g E的含量,抑制肥大细胞的增殖、分化和释放炎性介质,从而增强机体免疫功能[61]。 4.6 改善血流循环 麻杏石甘汤50ml/只灌胃,给药30min后,家兔血压有明显升高趋势,此作用能维持约12h左右,给药3Omin后,家兔出现了一过性心率过快,约持续20min左右,随后心率由快转慢,呼吸可由开始90次/min,减少到50次/min,使呼吸变浅减慢[62]。4.7 其他作用 麻杏石甘汤煎剂对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌有较明显的抗菌作用;对陕 西61 -1 珠甲型流感病毒有明显的拮抗作用[63]等等。 5 麻杏石甘方剂的临床研究 5.1 支气管哮喘 辨证施治哮喘,分辨冷、热及肺、脾、肾虚弱等。而麻杏石甘汤是治疗热喘之良方。松田邦夫将哮喘分为4型:变态反应型、咳嗽不止型、心身症型、虚弱体质型[64]。其中对于咳嗽不止型治疗建议:发作期给予麻杏石甘汤,非发作期给予小柴胡汤合麻杏石甘汤。 周耀群[65]以麻杏石甘汤为主方,随症加减治疗47例内源性哮喘病人。治疗后完全缓解17例,显效13例,有效11例,总有效率达87%。并且47例病人治疗前后白细胞总数(P 0.01)与嗜酸粒细胞(P0.05)下降具有统计学意义。治疗前后IgE测量显示IgE下降也具有统计学意义(P0.05)。李永贵[10]以麻杏石甘汤合葶苈大枣泻肺汤加味治疗支气管哮喘138例,治愈98例,好转23例,总有效率达87.7%。尹全真[66]采用麻杏石甘汤与定喘汤加味治疗小儿哮喘60例,治愈40例,好转15例,总有效率达92%。 5.2 急、慢性支气管炎与支气管肺炎 支气管肺炎属祖国医学“咳嗽”、“喘证”范畴,多因人体正气不足,卫外低下时感受外邪而致病。西医认为支气管炎是由感染、物理、化学刺激或过敏等因素引起的气管一支气管黏膜的急性炎症。 皱凤伦[67]采用银车麻杏石甘汤雾化吸入佐治小儿细菌性支气管肺炎,并以常规抗生素、退热、止咳等对证处理进行治疗对照组比较疗效,治疗组共30例,显效20例,有效9例,总有效率为96.6%,对照组共29例,显效7例,有效18 例总有效率为86%,统计学处理治疗组疗效显著优于对照组(P0.01)。曹宁等[68]采用麻杏石甘汤加味治疗小儿支原体肺炎30例,并以红霉素治疗为对照组进行疗效比较,中医治疗组平均退热时间、咳嗽时间、音消失时间、肺部阴影消失时间均明显较对照组缩短,差异均有非常显著性意义。朱必泉[69]以麻杏石甘汤玉屏风散为主防治小儿咳喘(支气管炎),治愈119例,有效81例。 5.3 心血管疾病 肺心病属祖国医学“咳喘”、“痰饮”、“水肿”等范畴。其发生发展与肺、心、脾、肾有关。中医分型为:寒痰阻肺型、湿痰郁肺型、脾肾两虚型、元阳欲脱型。周灿等[70]以麻杏石甘汤合千金苇茎汤加减治疗寒痰阻肺型(17例)均取得良好疗效。杨氏报道以麻杏石甘汤合五皮饮加减治疗46例肺心病伴心力衰竭。 5.4 皮肤病 荨麻疹在祖国医学中属“风疹”、“瘾疹”等范畴。顽固型荨麻疹一年四季均可发生。病因病机多为素体郁热,复感风热之邪,客于肌肤,或挟湿热,滞而不去,留于肌肤发等。现代医学认为,该病发病机理与变态反应有关。韩晓雪[71]采用麻杏石甘汤加味治疗2例神经性皮炎,获良效。郑锟[72]采用麻杏石甘汤加味治疗顽固性荨麻疹14例,痊愈12例,显效1例,总有效率为92.86%。 三 小结 麻杏石甘汤的现代研究进展可喜,但仍存在着许多问题。如其药理效应归结有祛痰、解热、抗炎、增强机体免疫功能,抗菌抗病毒等作用,与中医临床治疗肺热咳喘证有着密切联系,但目前复方药效的作用机制尚不十分清楚,其药效的物质基础及量效关系都有待进一步阐明;在复方中,增大石膏的用量或是增大其他药物的剂量,均可使煎液中钙的含量增加,在清热滋阴方中一般是热重多用石 膏,若疗效与石膏中的钙有关还可以增大其他药物的用量而不增加石膏的用量,但其疗效与有效成分的关系还须进一步探讨。对于麻杏石甘汤有关这方面的研究仍较少,有待继续探索;麻黄碱、钙离子等体内溶出、吸收、转运、排泄作用机制已有初步研究,但该方的体内药动学尚未见报道。 这些问题都需在今后的科研工作中给予解决。 四 展望 鉴于中药复方研究的复杂性和重要性,中药复方的研究仍处于百花齐放,百家争鸣的格局。当今科学技术的