家兔大肠杆菌——魏氏梭菌二联苗研制及与两种单苗免疫比较试验

家兔大肠杆菌——魏氏梭菌二联苗研制及与两种单苗免疫比较试验 家兔大肠杆菌——魏氏梭菌二联苗研制及 与两种单苗免疫比较试验 26ChineseJournalofRabbitFarming6/2002一实验与研究一 家兔大肠杆菌一魏氏梭菌二联苗研制 及与两种单苗免疫比较试验 鲍国连佟承刚韦强季权安 (浙江省农业科学院畜牧兽医研究所,杭州310021) 摘要应用改进液体培养法研制家兔大肠杆茵一魏氏梭茵二联苗,大肠杆茵抗原含量一般可达 220亿,250亿/mL,并对二联苗和对应的两种单苗进行了免疫比较试验.结果二联苗免疫兔对大 肠杆菌和魏氏梭茵免疫效力分别达91.7%(22/24)和95.2%(20/21),而对应的大肠杆菌单苗和 魏氏梭茵单苗的保护率分别为91.3%(21/23)和87%(20/23);免疫后持续4个月,二联苗对大肠 杆菌和魏氏梭茵的保护率分别为83.3%(10/12)和81.8%(9/l1);对应的两种单苗保护率分别为 75%(9/12)和80%(8/10);临床应用效果良好.结果表明,研制的二联苗保护率高,两种组分联合 制苗无干扰现象,降低了防疫成本. 关键词家兔;大肠杆茵;魏氏梭茵;大肠杆菌一魏氏梭茵二联苗 家兔腹泻病是影响养兔业发展的重要疫病,发 病率和死亡率高,经济损失严重.腹泻病因复杂,致 病因子多.经123例腹泻死亡兔病原分离鉴定,埃 希氏大肠杆菌(Esherichiacoli)89株,占首位,其中 以O为优势血清型菌株;魏氏梭菌(Clostridium z越)11株,居第2位,经血清中和保护试验,结 果证明为A型….为了预防和控制本病,已成功研 制了家兔大肠杆菌苗和魏氏梭菌苗13】,然而单苗 需要两次免疫注射,费时费工,成本高.为此,我们 针对家兔腹泻病最主要的两种病原菌,进行了家兔 大肠杆菌一魏氏梭菌二联苗(简称二联苗)的研制, 并与单苗进行了免疫效果比较试验,现报道如下. 1材料和方法 1.1制苗菌株 1.1.1大肠杆菌:ZR.,.,:血清型为O从腹泻死 亡兔中分离所得的致病性大肠杆菌;毒力标准:培 养l6小时马丁肉汤菌液0.2mL接种小白鼠死亡, 或lmL注射50日龄家兔于48小时内死亡. 1.1.2魏氏梭菌:SA...为A型;毒力标准:培养 菌液0.02mL接种16,18g小白鼠于24小时内死 亡. 1.2二联苗制备 1.2,1大肠杆菌抗原制备:种毒通过兔只复壮 后,挑选典型菌落3个以上,接种于血琼脂斜面, 37~C培养18小时后,洗下菌苔接种于适量的改良 马丁肉汤中,37%培养16小时作为种子液,经纯检 后扩大培养,在对数生长期内分三级加入改良马丁 肉汤,静止3小时开始通气,加入0.1%绵羊裂解 血,培养18小时终止.含菌量一般可达220亿, 250亿/mL,加入0.3%福尔马林灭活20,24小 时. 1.2.2魏氏梭菌抗原制备:SA...菌种移植于厌氧 肉汤胃膜消化液中,37?培养1820小时,取其菌 液耳静脉注射1,1.5kg家兔,从死亡兔肝脏回收 该菌,纯检扩大作为一级种子.先在肉汤胃膜消化 液中加入1%硫乙醇酸钠,然后用7.5%NaHCO,调 pH至7.8,8.0,再加入4o7o二级种子后,置37培 养5小时(出现大量气泡高峰时即可停止培养),纯 检后用小白鼠进行毒力测定,加入0.8%福尔马 林,置35,37?条件下脱毒5天,适量浓缩. 1.2.3二联苗配制:将大肠杆菌抗原组分原液稀 释至150亿/mL,然后与魏氏梭菌苗作1:1混合, 用2NNaOH调pH至7.0,7.2,加入氢氧化铝胶 作佐剂,体积之比为1/15. 一 实验与研究一中国养兔杂志6/200227 1.3二联苗检验 1.3.1无菌检验:每批二联苗抽样,分别接种于 改良马丁肉汤,厌氧肉汤,血琼脂斜面各1管,每管 接种0.2mL,置37?培养5,7天应无菌生长. 1.3.2安全检验:每批苗选择4只1.5,2.0kg的 健康易感兔,每只皮下注射5mL,观察7天应健活, 无不良反应. 1.4免疫试验 1.4.1试验动物:1.5,2.0kg的健康青年兔,清 洁级,浙江省农科院实验兔场提供;16,18g小白 鼠,由浙江省卫生防疫站提供. 1.4.2免疫方法:每只兔皮下接种二联苗2mL. 1.4.3攻毒方法:经预备试验测定后,大肠杆菌 和魏氏梭菌攻毒均采用每只家兔肌肉注射液体培 养菌液1.5个MLD,对照组同样攻毒,观察7天. 2结果 2.1免疫效力测定 用二联苗,大肠杆菌单苗,魏氏梭菌单苗各3 批,分别免疫家兔45只,23只,23只,于免疫接种 后14,21天攻强毒进行效力测定,结果见表1. 表1二联苗与两种单苗免疫效力比较 由表1可见,二联苗免疫兔的大肠杆菌苗和魏 氏梭菌苗组的保护率分别为91.7%(22/24)和 95.2%(20/21),而对应的两种单苗的免疫效果分 别是91.3%(21/23)和?7%(20/23),表明二联苗 保留了两种单苗的免疫效果,保护率高,两种组分 联合制苗无干扰现象. 2.2免疫持续期测定 选用3批二联苗和对应的两种单苗,二联苗免 疫24只家兔,大肠杆菌苗免疫12只,魏氏梭菌苗 免疫12只,于免疫后121天进行攻毒,期间有3只 兔因怀孕,疾病等原因未攻毒,结果见表2. 由表2可见,疫苗免疫持续4个月,二联苗免 表2二联苗与两种单苗免疫持续期测定结果 疫兔对大肠杆菌和魏氏梭菌的保护率分别达 83.3%(10/12)和81.8%(9/l1),而单苗免疫的保 护率分别为75%(9/12)和80%(8/10),表明二联 苗免疫持续4个月仍保持着较好的效果. 2.3兔场试用情况观察 研制的二联苗在浙江部分常发大肠杆菌,魏氏 梭菌性腹泻的兔场应用,免疫45,90日龄兔,免疫 2万余头份,无不良反应.免疫后腹泻发病率和死 亡率明显下降,经部分兔场调查统计,死亡率由 16%下降到2.4%. 3结论 3.1该二联苗制备采用改进的液体培养工艺在 对数生长期分级加样法,使大肠杆菌含量达220亿 , 250亿/mL,比固体法制备单苗I引,大幅度降低了 成本,提高了制苗产量,还便于工厂化生产. 3.2免疫试验结果证明,二联苗对大肠杆菌和魏 氏梭菌的保护率高达91.7%和95.2%,免疫持续4 个月以上,有良好的免疫效果. 3.3采用两种组分联合制苗,无干扰现象,保持了 两种单苗的免疫效果I2”,简化了免疫程序,降低 了防疫成本. 4参考文献 1佟承刚等.家兔感染性腹泻病因研究.中国兽医杂志. 1991,2:l5—17 2鲍国连等.家兔大肠杆茵灭活苗研究.浙江农业, 1991.3:153—156 3佟承刚等.家兔魏氏梭茵疫苗研制和免疫效果的研究. 中国畜禽传染病.1991.2:9—11 4史国瑞等.免巴氏杆茵魏氏梭茵二联苗蜂胶灭活苗的研 制.中国养兔杂志,1999,6:1112 5中华人民共和国农业部.兽医生物制品规程.1985.NY: 15—84 (下转第29页) 一 工作交流一中国养兔杂志6/200229 65%.同时发展了无泊,文达,恒南等专业村8个,通 过”基地+农户”的推广形式,有效地示范带动了全 市毛兔生产的快速发展. 7产业拉动 2001年大丰市和浙江申浩毛纺有限公司联合 建成大丰市海虹兔毛加工厂,年粗加工能力200吨, 生产的”雪绒”牌兔毛纤维已在第三届农业博览会上 荣获金牌,形成品牌优势.今年正投资100多万元新 上毛纺项目,扩大产业化的经营规模,形成区域优 势.目前,大丰市兔毛价格每千克普遍比邻近市县高 2,5元,社会经济效益十分显着. 8服务促动 由于毛兔养殖的迅猛发展,带动了加工,流通等 “三产”的发展,促进了农村劳动力的转移.目前,全 市专职从事兔毛收购的业主近千人,解决了农民卖 毛难的矛盾.市,镇,村三级服务网络体系的完善以 及新现的兔用颗粒料加工队伍达150人,确保兔农 防疫,配种,医疗等综合服务配套到位.同时,小海, 万盈等镇组建毛兔生产合作社,开辟了苏北最大的 兔毛集散交易市场,提高了大丰市毛兔的知名度. 9机制驱动 大丰市在发展毛兔生产上引入”二次分配”体 制.其中以小海康桂林为代表的兔毛经营联合体在 20世纪90年代初就形成股份合作制,在”收”字上 下功夫,实行差价返还,保”利”于农户:凡兔农交售 的兔毛,若5天内涨价则退还涨价部分的50%,降 价与兔农无关,使广大兔农吃上”定心丸”. 10农牧互动 为了加速农业结构调整,大丰市及时调减粮食 种植面积,推广”粮一经一饲”三元种植模式,已发展 种草面积613公顷.通过种草养兔的转化,每公顷新 增收人约3万元,新增纯收人7500元以上,同时, 种草养兔能促进饲草过腹还田,进行循环利用,改良 土壤,提高土地肥力,综合提高粮棉产量.以大中镇 恒南村养兔大户喻祝生为典型,推广果一草复合种 植模式,每公顷新增收入约5.25万元,达到了以牧 促农,以农养牧,农牧并举的可持续发展效果,并推 进了全市种草养畜进程. “十五”期间,大丰市将继续健全市场信息体系, 积极引进”三资”,加大龙头企业建设,建立标准化示 范园区,推进产业化进程,进一步扩大品牌优势,开 拓国际市场,形成区域化,特色化主导产业.口 (收稿日期:2002—07—05) (上接第27页) DevelopmentofDuplexVaccineAgainstRabbitEscheichiaColiandClostridiumWelchii, andComparisonwithCorrespondentSingleValenceVaccines BaoGuolianTongChenggangWeiQiangeta1. (InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryScience,zhcj~Academy ofAgriculturalScience,Hangzhou310021) ABSTRACTAnewduplexvaccinewasdevelopedusinganimprovedliquidcultivationmethod.Theconcentration 0fE.coliinthevaccinereached2.2, 2.5x10”CFU/m1.Thecomparisonofimmunitywiththecorrespondent singlevaccineswasconducted.TheimmuneprotectiverateoftheduplexvaccineagainstE.coilandC.welchiiwere 91.7%(22/24)and95.2%(20/21),respectively.ThesinglevaccinesagainstE. coliorC.welchiihad91.3% (21/23)and87%(20/23)protectiverate.Atfourmonthsafterimmunizationtheprotectionratesoftheduplex vaccinewere83.3%(10/12)forE.coliand81.8%(9/11)forC.welchii.Thesinglevaccineshadtheimmunitv 0f75%(9/12)forE.coliand80%(8/10)forC.welchii.Theresultsshowedthattheduplexvaccinehadhigh protectiverate,nointerferencebetweentwocomponents,reducedthecostofvaccinationinfield. KEYWORDSRabbit,Eshenchiacoli,Clostridiumwelchii,Duplexvaccine口 (收稿日期:2002—1O一28)