淋巴细胞亚群

淋巴细胞亚群 机体免疫状态是衡量机体是否患病的重要指标，目前多采用流式细胞术来监测机体的免疫状态，其中最重要的指标是检测T、B和NK淋巴细胞的水平。 T细胞主要包括T辅助细胞(Th)和T抑制细胞(Ts)细胞亚群。CD3+细胞代表外周血中总的成熟T细胞，理论上应约等于CD4+细胞和CD8+细胞的总和，但往往出现CD4+加CD8+细胞之和大于CD3+，这是因为CD4+细胞包括CD3+/CD4+细胞(真正Th细胞)和CD3-CD4+细胞(非Ts细胞)，而后者包括CD3-CD8+CD16+56+细胞(一部分NK细胞)和CD3-CD8+CD16+56-(未知细胞)。由此可见，真正的TH细胞是CD3+CD4+细胞，真正Ts细胞是CD3+CD8+细胞。尤其当患者NK细胞明显增加时，会使CD4细胞和CD8细胞的总和远大于CD3+细胞，因此，用三色荧光标记才能分析真正的辅助性T细胞和抑制性T细胞。 首先在淋巴细胞中识别出CD3细胞，然后在CD3细胞中再区分CD4+和CD8+细胞。NK细胞的表面无T细胞和B细胞表面标志，但有CD16和CD56等标志，用CD16+56抗体能鉴定出NK细胞(一定是CD3阴性)，CD3-CD16+56+细胞才是真正的NK细胞。根据是否表达CD8，又可将NK细胞分为CD3-CD8+CD16+56+细胞(所占比例小，不影响CD8比例)和CD3-CD8-CD16+56+细胞(主要成分)。 B细胞的表面标志是CD19，理论上CD3-CD19+细胞才是真正的B淋巴细胞。但CD3+CD19+细胞很少，可忽略不计，所以CD19+细胞就是B淋巴细胞。 在抗肿瘤效应中，CD4和CD8分别是T淋巴细胞的辅助,诱导细胞亚群与抑制/细胞毒细胞亚群，CD4细胞的主要功能是通过其分泌的淋巴因子，增强和扩大免疫应答过程，辅助诱导其它免疫细胞如杀伤性T细胞，B细胞等共同发挥抗肿瘤作用，CD4细胞的减少，导致免疫功能低下。CD4/CD8比值是重要的免疫状态监测指标，其比例的降低与免疫系统损害的程度相关。 CD4降低见于恶性肿瘤、遗传性免疫缺陷症、艾滋病、应用免疫抑制剂者;CD8降低见于自身免疫性疾病或变态反应性疾病;CD4/CD8比值升高见于恶性肿瘤、自身免疫性疾病、变态反应、病毒感染等;CD4/CD8比值降低见于艾滋病(常小于0.5)。监测器官移植排斥反应时，CD4/CD8比值升高预示可能发生排斥反应。 淋巴细胞担负着免疫的主要功能。淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，通过流式细胞仪检测分析即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。最常检测的亚群包括T细胞(CD3)、B细胞(CD19)、NK细胞(CD16+56)、辅助性T细胞(CD3+CD4+)和抑制性T细胞(CD3+CD8+)等等。 (1) 应用CD3/CD19区分T淋巴细胞和B淋巴细胞 CD3是T细胞的特异性抗原，CD19则用来识别B细胞(因此应用CD3/CD19双标试剂即可以区分和鉴定T淋巴细胞和B淋巴细胞亚群;CD3、CD19阳性表达为独立的阳性细胞群体。如出现双阳性细胞均为假象。这样就可不用同型对照来设定阴性或阳性界线。此外，此检测还会出现双阴性群体，这些都是NK细胞，这些细胞也提供了双阴性群体的对照。 (2) 应用CD3/CD4来鉴定CD4+T细胞 首先用CD3来区分全部T细胞(而CD3/CD4双阳性细胞为真正的辅助/诱导性T细胞，这是HIV病毒感染的主要对象;CD3-/CD4+细胞群是由单核细胞组成，这些细胞相对于CD4+和T细胞来说弱表达CD4，在光散射参数的位置分布也较广。所以CD3/CD4抗体组合能够完全把CD4阳性辅助/诱导性T细胞区分开。另外，应用适当的双色组合如CD4与CD29,CD4与CD45RA,也可以测定T辅助细胞的的亚群。如CD4+2H4(CD 45RA)+细胞是Ts的诱导细胞;CD4+ 4B4 (CD29)+细胞Th的诱导细胞。同理,•利用CD8+CD45RA和CD8+CD29+ S6F1可测定T抑制细胞的亚群。T辅助细胞还可分成Th1、Th2两个亚群，同时标记细胞内细胞因子IFN-γ和IL-4，可区分Th1细胞(CD4+/IFN-γ+)和Th2细胞(CD4+/IL-4+)。 (3)应用CD3/CD8鉴定CD8+T淋巴细胞 CD8的表达不只限于细胞毒性T细胞，此抗原在部分的NK细胞上也能检测到。所以利用CD3抗体才能把该细胞亚群分开。 若采用三色测定可给出更为准确的各亚群的情况:如真正的T辅助细胞应是CD3+ CD4+CD8-,真正的T抑制细胞应是CD3+CD4- CD8+,单标CD8+细胞中不仅有T抑制细胞,还含有30%左右的NK细胞;而CD3+CD4-CD8-细胞群是γδT细胞,此类细胞与感染有关(CD3+CD4+ CD8-细胞+CD3+CD4-CD8+细胞+CD3+CD4-CD8-细胞+CD3+CD4+CD8+细胞=CD3+细胞。 (4) 自然杀伤细胞(NK)的检测 ?CD16(FcR?)表达于大多数NK细胞上，但也表达于中性粒细胞，此抗原NK细胞的表达比较弱，并在NK细胞活化时丢失;?CD56表达于大多数NK细胞上，也表达于一些T淋巴细胞，与CD3联合使用可以区分CD3+/CD56+T淋巴细胞和CD3-/CD56+NK细胞。?联合使用3种抗体最完全地鉴定所有的NK细胞。NK细胞或表达CD16，或表达CD56，但它们不表达CD3。CD16和CD56联合使用，根据荧光强度可将NK细胞从双阴性细胞中区分出来。这样运用该试剂组合，NK细胞可形成独立的群体与其它细胞相区分。 图1 流式分析细胞亚群 外周血是临床检验中的重要标本。FCM分析外周白细胞的主要目的是了解各种白细胞的数目与分群情况。以下给出常用细胞亚群的正常范围供参考,请注意同一CD中有多种克隆的McAb,同一CD中不同McAb•所测出的数值不同,每个实验室应测定自己实验室的正常数值: 表1 人外周血各细胞亚群表面抗原和流式检测的正常参考值 细胞表面抗原 细胞名称 正常参考值(%) T细胞抗原 CD2 总T细胞 62.5-89.0 CD3 成熟T细胞 61.1-77.0 CD4 T辅助/诱导性细胞亚群 15.8-41.6 CD5 T细胞(B细胞亚群) 69.5-88.0 CD8 T细胞/细胞毒性细胞亚群 18.1-29.6 CD28 T细胞受体共刺激分子 39.5-6408 CD8+/CD28+ 细胞毒性T细胞 8.6-15.5 CD8+/CD28- T抑制性细胞 9.9-24.8 CD3+/HLA-DR- 静止T细胞 55.3-77.1 B细胞抗原 CD19 全部B细胞 7.3-18.2 CD20 全部B细胞 7.3-18.2 NK细胞抗原 CD3-/CD(16+56)+ NK细胞 8.1-25.6 造血干细胞、祖细胞 CD33 粒细胞前体 21.3-30.4 CD34 多能干细胞 0.1-0.5 活化细胞表面抗原 CD3+/HLA-DR+ 活化T细胞 1.2-5.8 CD3-/HLA-DR+ 活化B细胞 3.0-11.7 CD3+/CD25+ 活化T细胞 1.01-2.20 CD5+/CD19+ 活化B细胞 3.1-6.6 CD69 活化诱导分子(AIM) 0.8-3.5 CD38 活化T细胞 42.4-60.0 免疫调节细胞 CD4+/CD29+ T辅助性细胞诱导亚群 9.8-26.0 CD4+/CD45-RA+ T抑制性细胞诱导亚群 15.5-25