采用四硫富瓦烯为黄嘌呤氧化酶的电子传递体的次黄嘌呤传感器

采用四硫富瓦烯为黄嘌呤氧化酶的电子传递体的次黄嘌呤传感器 采用四硫富瓦烯为黄嘌呤氧化酶的电子传 递体的次黄嘌呤传感器 ?/7—21 分所测试第16卷第1期1997.1.25 FENXICESHIXUEBAO(Journa】ofInstrumentalAnalysis)17 采用四硫富瓦烯为黄嘌呤氧化酶的 电子传递体的次黄嘌呤传感器 (上海大学化学化工系上海200072) 摘要 ?2 (;l一3/ 采用四琉富瓦烯(TTF)作为黄嘌呤氧化酶与玻碳电扳之间的电子传递体.通过牛血清白蛋白和戊二醛 交联剂,把黄曛呤氧化酶固定在Nafion—TTF修饰玻碳电扳上,制备成趺黄壤呤传感器该传感器的线性范围 ,75×l0_mol/L,响应耐IE小于60s 为1.0×3.0 关键词:兰望堕壁,四硫富瓦烯,姿羞堡,基舅墼丝韭-rTF 测定次黄嘌呤,黄嘌呤对评估鱼的鲜度具有重要意义.测定次黄嘌呤方法有纸色谱法[1], 离子交换色谱法D],高效液相色谱法[3],但这些方法较复杂,且费时;而通过测定黄嘌呤氧化酶 催化产生过氧化氢或尿酸的次黄嘌呤传感器受环境中氧浓度的变化影响大,背景电流大, 且由于其工作电位高,导致电活性物质如尿酸,抗坏血酸干扰.本文用Nation把TTF固定在 玻碳电极表面,制成Nafion—TTF修饰电极,然后用牛血清白蛋白一戊二醛交联剂,把黄嘌呤氧 化酶固定在Nafion—TTF修饰电极上,成功地制备了Nation.TTF修饰的次黄嘌呤传感器. Nafion膜能防止TTF的流失.固定在Naf[on膜中四硫富瓦烯的循环伏安图的峰形可逆性好, 首次发现它能够有效地在黄嘌呤氧化酶和玻碳电极之间传递电子.探讨了温度,pH对该传感 器的影响.这种次黄嘌呤传感器具有较强的抗干扰能力,响应时间快的优点,其米氏常数为7. 5×10-4mol/L 1实验部分 1.1仪器与试剂 FDH-3204型循环伏安仪(复旦大学科教仪器厂),TYPE3086函数仪(日本横河公 司). 黄嘌呤氧化酶(XOD)(1.0u/mg,Sigma公司),Nation(Dupont公司),四硫富瓦烯(Sig— ma公司),戊二醛(Merck公司),牛血清白蛋白(上海化学试剂公司),次黄嘌呤(Sigma公司), 其它试剂均为分析纯,试验均用二次重蒸馏水. 1.2Nation—TTF修饰玻碳电极的制作 把玻碳电极在金相砂纸打磨,后在沾有0.1mAI0悬浊液麂皮上抛光成镜面,然后分 :主音姿旱竟旱禁科学基盎会丑中国科学院长春应用化学研究所电升析化学开放宴验室资助课题 *联系人 l8分析测试第l6卷第1期(1997) 别在1+lHNO丙酮,二次重蒸馏水中清洗.待自然晾干后,在电极表面滴加6I含0.07 mol/I四硫富瓦烯的0.1Nation丙酮溶液后,自然晾干. 1.3Nation—TTF修饰次黄嘌呤糖传感器的制作 将5.0mg黄嘌呤氧化酶,3.0mg牛血清白蛋白,0.05mL二次重蒸馏水及5,uL5戊二 醛混和.并迅速搅拌均匀,取l0L滴加在Nafion—TTF修饰玻碳电极的电极表面,自然晾干 后,为了防止电活性物质的干扰,在酶膜的表面再覆盖一层Nation膜电极置于pH7.0的磷 酸盐缓冲液中,放人冰箱中保存(4?) 1.4测定方法 采用三电极体系即次黄嘌呤传感器为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂片为对电 极在10mL烧杯中加入pH7.0磷酸缓冲液5mI,控制温度为25?插入电极,开启搅拌器并 调至恒速,工作电极上加+0.2V(vs.SCE),在测定前试液通氮气6min除去溶液中的氧,然 后以N作保护气.记录加入次黄嘌呤前后四硫富瓦烯的电催化氧化电流随时间的变化,根据 四硫富瓦烯氧化电流的增值与加入葡萄糖的量成正比进行定量分析. 2结果与讨论 2.1Nafion一四硫富瓦烯修饰的次黄嘌呤传感器的循环伏安图 图l是不同扫描速度下Nation一四硫富 瓦烯修饰的次黄嘌呤传感器的循环伏安图. 从图l可知,随着扫描速度的增加,峰电流也 不断增大.固定在Nation的四硫富瓦烯的循 环伏安图峰形可逆性好,氧化峰电位与还原 峰电位的差值为60mV,这表明膜内呈较快g 的电子转移速度,酶膜不影响四琉富瓦烯的, 电化学性质. 2.2次黄嘌呤传感器的性能 图2是加人次黄嘌呤前后传感器的循环 伏安图.其中a是未加人次黄嘌呤的循环伏 安图,由a可知电极呈现快速,可逆的电子传 递,TTF的氧化,还原峰大致相等;随着次黄 嘌呤浓度的增大,TTF氧化峰电流逐渐增 大,还原峰电流逐渐减少图中b是次黄嘌呤 浓度为0.75mmol/L的循环伏安图,由图可 知,由于酶催化反应,TTF的氧化峰明显增 大,说明固定在Nation上的TTF能有效地 在玻碳电极和黄嘌呤氧化酶(XOD)之间传 递电子. 圈1Nation—TTF修饰次 黄嘌蜂传感器的循环伏安图 扫描速度:15,2S,45,65, 85,105,12s,14SmV,s(由内到外) 底}瞳pH7.0磷酸盐缓冲渍. 第16卷第1期(1997)分析测试19 Nation—TTF修饰的次黄嘌呤传感器测定次 黄嘌呤原理如图3所示,它是以测量加人次 黄嘌呤前后TTF的氧化电流增值来定量测 定次黄嘌呤. 次黄嘌呤从溶液中扩散到电极表面,被 固定在电表面上的XOD(FAD)氧化产生黄 嘌呤,而黄嘌呤进一步被XOD(FAD)氧化: 次黄嘌呤+X0D(FAD)一黄嘌呤 +X0D(FADH,) 黄嘌呤+XOD(FAD)一尿酸+ X0D(FADH.) TTF把X0D(FADH)氧化为XOD (FAD): 2TTF+XOD(FADH)一2TTF +X0D(FAD)+2H TTF又在电极上被氧化为TTF,产生 氧化电流: 2TTF一2e—TTF(在电极上) 2.3温度,pH对次黄嘌呤传感器的影响 温度和pH对酶的催化反应速度及活性 都有影响.实验表明温度在1O,45?之间, 随着温度升高,其响应值逐渐增大,当温度超 过45?,其响应值急剧减小.本文选择实验 温度为25?. 由图4可知,在pH7.0,7.5范围内该 传感器的响应值几乎不变,实验选择pH7.0 的磷酸盐缓冲液 2.4次黄嘌呤传感器的工作曲线及响应时 间 在上述最佳条件下,测试该传感器的催 化电流与次黄嘌呤浓度的关系,如图5所示, 线性范围为1.0×1旷5,7.5×10一mol/I,.该 传感器的响应时间小于60S该传感器的米 氏常数可从Miehaelis—Menten方程式求 得 J一,…一K:p(./C) 其中,.为稳态的催化电流,是底物饱和 时的最大电流,C是次黄嘌呤浓席,是米 围2Nalion—TTF修饰的次 黄嘿跨传感器循环伏安田 <a)无敬黄嗫呤'(b)0.75mmo]/L次黄嘿呤. 扫描速度}25mV/s;宴验温度:z5?. 球 脚 氍 搿 二 图3Nalion—TTF修饰次 黄唾哮传感器的响应机理 图4pH对次黄曝哮传癌器的影响 敬黄嘎畔谁度:50×10-1nm]/L 砖 暖砖 V八 Z0分析测试第16眷第1期(1997) 氏常数,它代表整个体系的米氏常数,而不是黄嘌呤氧化酶的米氏常数.该传感器米氏常数为 7.5mmol/l. 图5Nafion—TTF修饰的次黄嘌D令图6坎黄曛D令传感器的稳定性 传瞎器工作曲线 实验温度;25C 2.5干扰实验 取次黄嘌呤浓度为0.7mmol/l一05mmol/lJ一赖氨酸,L一脯氨酸,L一胱氨酸,L一谷氨酸, 甘氨酸,L一组氨酸,,J一亮氨酸,L一蛋氨酸,DL一苏氨酸,DL一苯丙氨酸,乳酸,蔗糖,麦芽糖,脲, 0.1mmol/L尿酸,抗坏血酸等对测定无干扰.这是因为在生理pH值下,尿酸,抗坏血酸为阴 离子,被Nafion阳离子交换膜挡在玻碳电极外,且所采用的媒介体TTF的氧化电位低(0.2 V),所以可消除这些电恬性物质的干扰. 溶液中氧对测定有一定的影响,这是因为氧作为氧化酶天然电子媒介体能与四硫 富瓦烯 竞争,参与酶的电子转移.采用通氮除氧,然后在氮气保护气氛下消除其干扰. 2.6传感器的稳定性 对次黄嘌呤浓度为0.5mmol/l…075mmol/I的溶液重复测定1O次,其相对偏差 分别为2.5,2.8. 传感器保存在CC冰箱中,每隔2天测一次,15天内性能不变.一个月后,酶的括性降 低了 25左右(图6所示). 4结论 本文首次通过实验表明,固定在Nafion中的四硫富瓦烯能够有效地作为黄嘌岭氧 化酶与 玻碳电极之间的电子传递体.该传感器与采用氧电极或通过测定H.0的黄嘌呤酶 电极比较, 它具有受电活性物质干扰小,对次黄嘌呤响应快等优点. 参考文献 1JonesNR.MurrayJ,Liv[ngstonE1.MurrayCK.J.Sci.FoodAgri.,1964,16:763 2BurrJR.ProcessBiochem.1977,12:32 第16卷第1期(1997)分析测试21 3HalfpennyAP,BrownPR.J.Chromat.1985.349:275 4MulehandanlA,LuongJHT,MaleKB.Ana1.Chim.Acta,1989,221:215 5GonmlezE,ParienteF,LorenzoE,HernandezL.AnaJChim.Aeta.1991,242:267 6KarninRA.WfisonGS.Ana1.Chem.,1980,52:1198 (收藕日期:1995.9.7) HvDoxantneSensorwithTetrathiafulvaleneas ElectronShuttlebetweenXanthine 0xidaseandGlassyCarbonElectrode ZhangXiaolin,WuXinxin,DengJiaqi,0}Deyao,LiuHaiying (DepartmentofChemistryandChemicalEngineering,ShahghaiUniversity,Shanghai2000 72) (DepartmentofChemistry,FudanUniversity,Shanghai200433) Abstract TetrathiafuIvaIene(TTF)isemployedtoexpediteelectronexchangebetweenxanthine oxidaseandglassycarbonelectrode.Amperometricsensorforhypoxanthinehasbeendeve- lopedbyimmobilizingglucoseoxidaseonNation— TTFmodifiedcarbonelectrodewithbovine serumalbumincross—linkedbygIutaraldehyde.TheroleofNationmembraneistoprevent theloaaoftetrathiafuIvaleneandtheoxidationofunwantedelectrochemicallyactivespecies ontheelectrode.Thebiosensorrespondsrapidlytohypoxanthinewithin60sanditslinear rangeisl_0×1O,7.O×10,mol/I. Keywords:Biosensor.Nationmembrane.Xanthineoxidase.Hypoxanthine,Tetrathiaful— valene.