黄芪当归合剂抑制马兜铃酸Ⅰ导致的肾小管上皮细胞损伤

黄芪当归合剂抑制马兜铃酸Ⅰ导致的肾小管上皮细胞损伤 黄芪当归合剂抑制马兜铃酸?导致的肾小 管上皮细胞损伤 北京大学(医学版) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES)Vo1.38No.4Aug.2006?3 81? 黄芪当归合剂抑制马兜铃酸I导致的 肾小管上皮细胞损伤 李彪.,唐嘉薇.,蔡少青,李晓玫 (1.北京大学第一医院肾内科,北京100034;2.北京大学药学院天然药物研究室) ? 论着? [摘要]目的:探讨黄芪当归合剂(astragalusandangelicamixture,A&A)对外源性马兜铃酸I(aristolochicacid I,AA—I)所造成的肾小管上皮细胞损伤的干预作用.方法:以体外培养的人近端肾小管上皮细胞系(HK-2)为 研究对象,在AA—I(2.5m#L)刺激细胞4h后,给予A&A药物血清并使细胞继续生长至48h,应用流式细胞仪分 析细胞DNA含量了解细胞凋亡情况;采用ELISA法检测细胞培养上清液中纤维连接蛋白(fibronectin,FN)及转化 生长因子131(transforminggrowthfactor—beta1,TGF一131)分泌水平;比较A&A干预前后AA—I诱导的细胞凋亡,TGF- B1及FN分泌的改变.结果:正常HK-2细胞能够分泌少量TGF一131(7.05?1.98s/L),正常血清与A&A均不能够 诱导TGF—pl的明显分泌(6.35?1.99s/Land6.57?2.19s/L,.对照组,P>0.05),AA —I能够诱导细胞分 泌TGF一131(18.26?5.98g/L,.对照组,P<0.05),与AA—I作用组相比,A&A能够抑制TGF-[31分泌(6.66? 0.70g/L,.AA—I,P<0.05),抑制率达63.5%;A&A还能够阻断细胞凋亡,阻断 率达93.7%(3.32%?0.41% . 19.19?6.32%,A&A+AA—I.AA—I,P<0.001),并能抑制AA—I诱导HK-2细 胞分泌(1.64?1.11倍.2.93 ?0.87倍,P<0.05),抑制率达44%.结论:A&A能够减轻AA—I诱导的肾小 管上皮细胞损伤,其机制可能与抑 制TGF一131的作用有关. [关键词]马兜铃酸;上皮细胞,肾小管;细胞凋亡;细胞外基质;当归,黄芪,复方合剂 [中图分类号]R282.710.7[文献标识码]A[文章编号]1671—167X(2006)04~381-04 Astragalusandangelicamixtureinhibitstherenaltubularepithelialcellinjury inducedbyaristolochic?acidI LIBiao,TANGJia.wei,CAIShao—qing,LIXiao—mei (1.DepartmentofNephrology,PekingUniversityFirstHospital,Beijing100034,China;2.P ekingUniversitySchoolof PharmaceuticalSciences) ABSTRACTObjective:ToinvestigatewhetherChineseherbastragalusandangelicamixture(A&A) haveinfluenceontherenaltubularepithelialcelliniuryinducedbyaristolochic— acidI.Methods:Human proximaltubularepithelialcelllineHK-2waspre—treatedwithAA— I(2.5mL)f0r4hours.Cellswere thentreatedwithorwithoutA&Aforadditional44hours.Cellapoptosiswasevaluatedb yusingFACS. Secretedfibronectin(FN)andTGF—B1levelswereassayedbyELISA.ThechangesofAA—I—induced FN.TGF— B1levelandtherateofapoptosiswerecomparedbeforeandafterA&Atreatment.Result s: TherewasbasementsecretionofTGF—B1byHK-2cells(7.05? 1.98L).Bothnormalserum(N—S) andA&AcouldnotinducethecellstosecretI'GF—B1(6.354-1.99Land6.574-2.19L,傩. control.P>0.O5).AA—IcouldinducetheTCF—B1secretionbyHK-2cells(18.26? 5.98L,傩. control.P<0.O5).A&AcouldblockAA—I—inducedTCF— B1secretionby63.5%(6.66?0.7Og/L. . AA—I.P<0.O5).ItalsosuppressedAA—I—inducedcellapoptosisbv93.7%(3.32%? 0.41%傩. 19.19%? 6.32%respectively.P<0.001)andFNsecretionbv44%(1.644-1.1lfolds.2.934- O.87foldsrespectively.P<0.O5).Conclusion:A&AinhibitsAA— Iinducedinjuryinhumanrenal proximaltubuleepithelialcells.whosemechanismmaybepartiallythroughblockingTCF.1 31secretion. KEYWORDSAristolochicAcid:Epithelialcells.kidneytubules;Apoptosis;Extracellular matrix;An— gelicasinensis,astragalusmembranaceus,drugcombinations 含马兜铃酸中药所致的肾损害是一类特殊的肾 小管间质损害,主要现为进行性肾问质纤维 化.马兜铃酸肾病(aristolochicacidinducedBe— phropathy,AAN)的发病机制尚不完全清楚,临床病 基金项目:国家自然科学基金(30330710)和教育部教育振兴行动特殊专项(" 九八五")资助SupportbytheNationalNaturalSci— cnccsFoundationofChina(30330710)andSpecialFundforPromotionofEducation,Ministr yofEducationP.R.C. ACorrespondingauthor'se-mail.xiaomcil@mcdmail.corn.cn 北京大学(医学版) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) 理研究发现,肾小管上皮细胞的中毒性损伤,细胞凋 亡,转分化以及肾间质组织缺血等均可能参与病变 的发生,发展过程.我们以往的研究表明,马兜 铃酸类化合物的主要成分马兜铃酸I(aristolochic acidI,AA-I)能够刺激肾小管上皮细胞分泌转化 生长因子-B1(transforminggrowthfactor.beta1,TGF. B1)和细胞外基质成分纤连蛋白(fibronectin,FN), 能够诱导细胞发生凋亡,其损伤机制可能是通过 TGF-61来介导J.目前,由于AAN患者就诊时往 往已处于慢性肾功能衰竭的阶段,临床上尚缺乏确 切的治疗措施.黄芪当归合剂(astragalusandange1. icamixture,A&A)是北京大学第一医院肾内科根 据传统中药方剂改良所得的中药复方制剂,既往的 系列研究表明,在嘌呤毒素导致的慢性肾病和单侧 输尿管结扎导致的梗阻性肾病大鼠模型中,A&A均 能够通过减少肾问质炎性细胞浸润,抑制肾小管上 皮细胞表达TGF-B1等机制改善肾纤维化程度. 本研究应用血清药理学方法,在细胞水平初步探讨 外源性A&A对AA.I所造成的肾小管上皮细胞损害 的干预作用. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1试剂AA.I(纯度>98%)来源于北京大 学药学院天然药物学系,溶解于二甲基亚砜(DM- SO,美国Fluka公司)中,储液浓度为5L,于4? 保存.试验所用黄芪(radixastragaliseuhedysari)购 自山西省浑源县,当归(radixangelicaesinensis)购自 甘肃省岷县.药物的购买,质检和制备均由北京大 学药学院天然药物学系协助完成.细胞培养液 DMEM(dulbeccominimumessentialmedium)购自美 国GIBICO;胎牛血清(fetuscalfserum,FCS)购白天 津生物制品公司;TGF-Bl酶联免疫检测板购自深 圳晶美公司;FN及FN抗体购自美国CHEMICON公 司;辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体购自中 山生物技术有限公司;碘化丙啶(propidiumiodine, PI)及TritonX.100购自美国Sigma公司.其他一些 常用的试剂购自国内各公司. 1.1.2实验动物正常雄性SD大鼠购自北京大 学医学部实验动物科学部,动物等级为二级,重量为 250?10g. 1.2方法 1.2.1细胞培养人类近端肾小管上皮细胞系 (HK-2)购自美国ATCC公司.HK一2细胞采用含 10%(体积分数)胎牛血清的DMEM培养基培养,培 养在5%(体积分数)二氧化碳,37?恒温孵箱中. 细胞生长至95%融合后,换用含0.05%(体积分 数)FCS的DMEM培养液,继续培养24h,使细胞处 于相对生长静止状态后,加入AA-I(2.5ms/L)刺激 48h,预实验中已证实上述条件下AA-I并无明显 细胞毒性. 1.2.2A&A药物血清的制备按本研究所建立的 方法制备A&A【7j,每毫升含量相当于黄芪,当归生 药各0.7g.经胃管给正常雄性SD大鼠灌服(每只 3mL/d),共7d.最后一次灌药后半小时取血,分 离血清.对照组大鼠灌服等量自来水,同期分离血 清作为对照.使用截留分子质量为10000的超滤 膜将上述血清分别超滤,用0.22m滤器过滤除 菌,冷冻抽干待用.经检测证实两组血清内毒素含 量均为正常水平且无明显差异.预实验发现,上述 药物血清的超滤液在稀释至10%(体积分数),20% (体积分数)和40%(体积分数)的体内药物浓度时 均对AA.I刺激的FN分泌有抑制作用,而以40% (体积分数)浓度的药物血清抑制作用最强,因此选 择该浓度进行以下实验. 1.2.3干预实验细胞生长至95%融合后,换用 含0.05%FCS的DMEM培养液生长过夜,共分为6 组.(1)空白对照组(CON):仅加培养液;(2)正常 血清对照组(N.S):加入对照组血清滤液;(3)A&A 对照组(A&A):加入A&A组血清滤液;(4)AA-I刺 激组(AA-I):加入2.5mg/L的AA-I;(5)AA-I 刺激加正常血清对照组(A+N-S):2.5mg/L的AA- I刺激4h后再加入对照组血清滤液;(6)AA-I刺 激加A&A血清滤液组(A+A&A):2.5mg/L的AA- I刺激4h后再加入A&A血清滤液.经上述处理的 细胞继续生长至48h,收集细胞上清液为样品,分别 测定TGF.B1和FN分泌量,以相应样品贴壁细胞蛋 白浓度校正测定结果;收集贴壁细胞为样品,分析细 胞DNA含量,观察亚二倍体占细胞总DNA含量的 百分比,以评定细胞凋亡情况. 1.2.4细胞DNA含量测定用胰蛋白EDTA 消化并获取各组1×10.个/mL细胞,用含1mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)的PBS洗一次,以70%(体 积分数)乙醇,4?固定14h以上;离心去除固定液 后,PBS洗一次,加入2g/LRNaseA在37?下温育 30min,再加入1g/L的PI室温孵育20min,加入适 量PBS后于流式细胞仪(FACSCalibur,CELLQUEST 软件,美国BD公司)获取15000个细胞进行检测, 分析G0/G1期峰前DNA含量占细胞总DNA含量 的百分比,即亚二倍体含量(%). 李彪,等黄芪当归合剂抑制马兜铃酸I导致的肾小管上皮细胞损伤?383? 1.2.5FN测定采用间接竞争抑制ELISA法检 测.留取各组细胞培养上清液为标本,FN标准品 包被酶联板,4?过夜;37?封闭;加入样品和抗 FN第一抗体后37?孵育30rain;加入辣根过氧化 物酶标记的第二抗体后37?孵育30rain;再加入显 色剂显色,2mol/L硫酸终止反应;在酶标仪(美国 BD公司)读取496nm处光密度值;根据标准曲线 计算样本FN含量,用相应样品细胞蛋白含量(Brad— ford法)校正FN测定的结果.各组样品每次测定 复孔,取均值.结果表达单位为mg/I~. 1.2.6TGF一[31测定采用双抗体夹心ELISA法检 测.留取各组细胞培养上清液为标本,按照试剂盒 操作要求进行,简要过程如下:用试剂盒提供的酸碱 处理待测标本(激活TGF一[31),激活后的标本加入 已经包被抗人TGF一[31单克隆抗体的酶标板上, 37?孵育2h,洗板后加入生物素化抗体工作液, 37?孵育2h,其后加入酶结合物工作液,37?孵 育30rain,室温避光显色10,15rain,加入终止液 后,酶标仪读取450nm处的光密度值.根据标准曲 线计算标本TGF一[31含量,以相应样品细胞中蛋白 含量(Bradford法)校正结果.各组样品每次测定复 孔,取均值.结果表达单位为g/L. 1.3统计学处理 各组实验分别重复4,6次,结果以均数?标准 差表示,用SPSS10.0软件分析,两组以上样本间的 比较,采用单因素方差(ANOVA)分析,两样本之间 的比较,采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意 义. (P>0.05).AA—I(2.5mg/I~)能够诱导HK一2细 胞分泌FN,可使其增至对照组的2.93倍(P< 0.05).正常血清不影响AA—I诱导的FN分泌(P >0.05);而A&A药物血清能够部分阻断AA—I诱 导的FN分泌,阻断率达44%(P<0.05). 表1A&A对AA-I诱导HK-2细胞效应的抑制作用(;?s) Table1A&AinhibittheeffectsofAA.Io13HK-2(?s) }P<0.05,comparedwithCON;#P<0.05,comparedwithAA—I 2.3A&A抑制AA—I诱导的细胞凋亡 如表1所示,,正常HK-2细胞在生长过程中有 一 定数量的细胞发生凋亡(3.75%?1.12%).与 对照组相比,正常血清与A&A药物血清本身均不能 够改变HK一2细胞的基础凋亡率(4.05%?1.31%, 3.83%?1.81%,.CON,P>0.05).AA—I(2.5 mg/I~)作用48h能够诱导19.2%的细胞发生凋亡, 较对照组显着增高(P<0.05);与AA—I刺激组相 比,正常血清不能够干预AA—I诱导的细胞凋亡 (20.79%?12.71%,.CON,P>0.05);而A&A 药物血清能够阻断AA—I(2.5mg/I~)诱导的细胞 凋亡(3.32%?0.41%,.CON,P<0.001),阻断 率达93.7%. 2结果3讨论 2.1A&A抑制AA—I诱导的TGF一[31表达 如表1所示,正常HK-2细胞能够分泌少量的 TGF一[31(7.05?1.98L).与对照组相比,单纯 给予正常血清或A&A药物血清均不影响HK-2细 胞分泌TGF,[31的基础水平(P>0.05).AA—I (2.5mg/L)诱导细胞分泌TGF一[31显着增加(18.26 ?5.98g/L,.CON,P<0.05),可达对照组的 2.58倍.正常血清不能够抑制AA—I所诱导的 TGF一[31分泌;而A&A药物血清却能够显着抑制 AA—I诱导的TGF一[31分泌(6.66?0.70g/L,. AA—I,P<0.05),抑制率可达63.5%. 2.2A&A抑制AA—I诱导的FN表达 如表1所示,正常HK一2细胞能够分泌一定量 的FN.与对照组相比,正常血清与A&A药物血清 本身均不能够改变HK一2细胞分泌FN的基础水平 含马兜铃酸的中药在我国使用非常广泛,其常 见的使用方式为单味中药煎剂,复方煎剂以及复方 构成的中成药.临床研究发现大多数患者是在长 期,间断服药后,逐渐出现以肾小管功能损害为主的 慢性肾功能衰竭,即使停药后其肾功能损害也持续 进展,在我国AAN可能是导致终末期肾功能衰竭 的重要原因之一.此类疾病在病理上主要表现为肾 小管上皮细胞严重坏死脱落,肾小管基底膜出现裸 基底膜改变,以及早期出现的肾间质纤维化J.由 于AAN确切的发病机制尚不十分明确,对AAN尚 无成熟的临床治疗.目前认为,总的治疗原则 包括:停用并尽量避免再次使用含马兜铃酸类药物; 避免应用其他可能导致肾损害的药物;对症处理患 者出现的贫血,高血压以及酸中毒等;对进入尿毒症 阶段的患者给予相应的替代治疗.有文献报道糖皮 ? 384? 北京大学(医学版) JOURNALOFPEKINGUNIVERSITY(HEALTHSCIENCES) 质激素对于部分早,中期AAN患者可能有缓解病情 的作用'mJ,但是目前尚缺乏包含大宗病例的前瞻 性对照性研究,以及关于远期效果的观察资料,因此 糖皮质激素的有效性尚有待于进一步研究.其他可 能的治疗措施,如血管紧张素转换酶抑制剂,血管紧 张素?受体拮抗剂等药物的疗效还在探索中?. 因此,努力寻找能够从不同环节治疗AAN,延缓 AAN导致肾衰竭进展的药物十分必要. 中草药是我国宝贵的医药财富,尤其是复方中 药具有多途径,多靶点作用的特点.黄芪和当归作 为中医治疗慢性肾病方剂中的常用药物,其疗效已 为长期临床观察所证实.自上世纪7O年代以来,北 京大学第一医院肾内科在A&A对慢性肾病的治疗 作用及其机制进行的系列研究发现,在慢性嘌呤毒 素肾病大鼠模型中,A&A在减少尿蛋白,减轻肾小 球硬化及肾间质纤维化方面与血管紧张素转换酶抑 制剂(ACEI类)药物相当.进一步的研究表明, A&A抗肾纤维化的机制不是通过阻断RAS系统来 实现的,组织学的研究表明它具有抑制肾小管上皮 细胞产生TGF一131的作用,在单侧输尿管结扎大 鼠模型上观察到A&A还能够减少结缔组织生长因 子的产生?.目前已证实,肾间质纤维化是多种慢 性肾病进展至肾衰竭的共同通路,肾小管上皮细胞 在受到致病因素刺激后可发生凋亡,向肾问质肌成 纤维细胞转分化,自身增生活化并分泌细胞外基质 成分增加,因而是参与肾间质纤维化发生,发展的重 要因素?.本课题组前期关于外源性马兜铃酸I 对肾小管上皮细胞HK-2作用的研究表明,在 AAN中肾间质纤维化的发生机制与其他肾疾病具 有共同特点.本研究基于上述认识,初步探讨A&A 能否干预AA—I对肾小管上皮细胞的作用.有研究 表明,含有黄芪当归中药复方的主要有效成分均为 小分子物质(如黄酮类,糖苷类等),因此,我们在本 研究中利用血清药理学方法制成A&A药物血清并 去除了A&A药物血清中的大分子物质.根据血清 药理学理论,药物血清不仅能够反映药物中可吸收 部分的直接作用,而且能够反映药物成分在机体作 用下形成的代谢产物和药物诱生的机体内源性物质 的间接效果.本研究结果表明,A&A药物血清 确实能够明显抑制AA—I诱导的HK_2细胞表达 TGF一131,抑制率达63%,进而还可阻断93.7%的细 胞发生凋亡,并显着抑制FN的表达.结合本课题 组以往发现阻断TGF一131作用可抑制AA—I诱导的 细胞凋亡和FN分泌的研究结果,提示A&A干预 AA—I诱导的HK-2细胞损伤作用,至少部分是通过 减少TGF一131的作用来实现的.同时,这一结果也 与以往在慢性肾病大鼠模型肾组织标本上观察到的 A&A能够减少肾小管上皮细胞产生TGF一131的结果 相一致J.上述研究结果为进一步探索应用A&A 防治肾间质纤维化,尤其是用于临床干预AAN进展 的治疗提供了实验依据. 参考文献 [1]DepierreuxM,vanDammeB,VandenHK,eta1.Pathologicas? pectsofanewlydescribednephropathyrelatedtotheprobng~use ofChineseherbs[J].AmJKidneyDis,1994,24:172—180. 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