S_1核酸酶作用与微环DNA分子的克隆策略_cropped

S_1核酸酶作用与微环DNA分子的克隆策略_cropped 19 卷 2 期 Vol . 19 No . 2 生 物 工 程 学 报 Chinese J ournal of Biotechnology 2003 年 3 月March 2003 S核酸酶作用与微环 D NA 分子的克隆策略 1 3 白艳玲 杨之龙 乔明强 张秀明 周 静 高才昌 ( )南开大学生命科学学院 ,天津 300071 S核酸酶具有降解单链 DNA 或 RNA 的作用 。在适当的条件下 , 该酶能将不同的环形 DNA 米曲霉来源的 摘 要 1 分子从超螺旋转变成开环和线形结构 ,对质粒 pUC19 的实验证明 , S核酸酶的这种转变作用与加入的酶量呈正相 1 μ关 。在 25L 总反应体积中 ,按 100ng DNA 加入 5u 至 17u 的 S核酸酶 ,能获得较高比例的线形 DNA 。由于微环 DNA 1 分子太小 ,单酶切位点的出现率较低 ,很难用常规方式进行克隆 ,以 S核酸酶进行线形化是微环 DNA 克隆的途径 。 1 () pC3 是已知最小的真核生物线粒体 DNA 类质粒 537bp,经 S核酸酶线形化后 ,成功地克隆到 pMD182T 载体上 。 1 关键词 S核酸酶 ,微环 DNA ,线形化 ,分子克隆 1 () 中图分类号 Q78 文献标识码 A 文章编号 100023061 20030220240204 在多数原核生物和一些真核生物中存在主基因组以外 法 。 1 - 3 的双链环形 DNA 质粒或类质粒 。研究这些额外遗传物 质的结构 、功能及起源 ,不仅在探讨遗传物质的构成与生物 1 材料与方法 进化方面有重要的理论意义 ,而且为生物工程新载体的开发 1. 1 材料 提供可靠的依据和资源 。为了研究这些分子的性质 ,首先必 pUC19 为质粒 ;微环 DNA 类质粒 pC3 来源于“津研 须将其克隆到已知的载体上 。通常采用限制性内切酶 ,将环 形目的 DNA 切成线形 ,然后与适当的载体连接 。然而 ,对于 ( ) 四号”黄瓜 Cucumis sativus黄化子叶线粒体 , 所用黄瓜种子 黄瓜线粒体类质粒 pC3 这样的微环 DNA ,一方面 ,核酸分子 由天津市黄瓜研究所提供 。 本身较小 ,常见限制酶单酶切位点的出现率较低 ,另一方面 , 1. 2 试剂与酶DNA 的二级结构 、修饰或其他未知原因对限制性内切酶的 ( ) 米曲 霉 Aspergillus oryzae 来 源 的 S核 酸 酶 、pMD182T1 活性也有抑制作用 ,使微环 DNA 难于被消化成线形和进行 Vector 及随机引物标记试剂盒购自 Ta KaRa Biotechnology 有限 克隆 。所以 ,在这种情况下需要寻找新的克隆途径 。 ( ) 公司 ; dATP、DNA 聚合酶 Taq plus、X2gal 及 IPTG 购自 Sangon ( ) 多年来 ,米曲霉 Aspergillus oryzae来源的 S核酸酶对单 1 32 α公司 ; T4 DNA 连接酶购自华美生物工程公司 ; 2P dCTP 购 链 DNA 或 RNA 的降解功能被广泛关注 ,基于 S核酸酶的性 1 自北京亚辉生物医学工程公司 ;三羟甲基氨基甲烷和琼脂糖 质开发了 S核酸酶保护法 、双链 DNA 末端平滑化等多 1 购自 Promega 公司 。 种分子生物学技术 。有文献报道 , S核酸酶能在适当的条 1 1. 3 质粒提取件下 ,随机地在环形超螺旋 DNA 分子上单位点切开单链或 参照文献 7 碱裂解法大量提取质粒 pUC19 ;参照文献 8 - 9 提取黄瓜线粒体总 DNA ,样品经 1 %琼脂糖凝胶电泳 分离 ,切下类质粒 pC3 泳带 ,按文献 10 回收 DNA 。 4 1. 4 S核酸酶作用1 ,使之转变成开环或线形 。然而 , S 核酸酶对超螺旋双链 1 μ以无菌去离子水稀释 S酶至适当浓度 ;在 p H 4. 6 、25L 1 DNA 分子的这种作用尚未引起普遍关注 ,只有少数研究组 总反 应 体 积 中 含 有 终 浓 度 0. 03molΠL CHCOONa 、0. 28molΠL 3 5 - 6 利用其进行 DNA 形状分析 。 NaCl 和 0. 01molΠL ZnSO,在 22,23 ?条件下 ,酶与底物 DNA 4 微环 DNA 分子的线形化是其克隆操作中的关键环节 。 μ反应 15min 后 ,立即放入冰浴中 ,并加入 1L 0. 5molΠL EDTA 本文以 S核酸酶对环形 DNA 分子的作用为中心 ,探索并确 1 终止反应 。 定环形 DNA 分子线形化的稳定酶反应条件 ,为难以被限制 性内切酶消化的微环 DNA 分子的克隆建立了一种新 的 方 收稿日期 :2002211208 ,修回日期 :2002212224 。 () 基金项目 :国家自然科学基金资助 No . 39770414。 3 通讯作者 。Tel :86222223503692 ; Fax :86222223508800 ; E2mail :gaocc @public . tpt . tj . cn 1. 5 线形 D NA 的末端加尾 参照文献 4 , 对线形 pC3 进行末端加“A”反应 。 线形 DNA μ2. 5g2 + ) μ(10 ×Buffer 含 MgL 5 μ5mmolΠL dATP 10L (μ) μ5uΠLTaq plus 1L μddHO 加至 50L2 74 ?2h ? 71,72 ? 2min ? 酚Π氯仿抽提 ,醋酸钠 、无水乙醇 沉淀 DNA 。 1. 6 探针标记 图 1 S核酸酶对 pUC19 的作用结果 1 依据试剂盒说明 ,以纯化的黄瓜线粒体类质粒 pC3 为模 Fig. 1 Snuclease digestion of pUC19 DNA molecules 1 32 α板 ,按随机引物法合成带 [2P 标记的探针 。 Electrophoresis was done with 1 . 2 % agarose gel . Lanes 1,11 were load2 1. 7 Southern 杂交ed with DNA samples after Snuclease digestion. The amount of enzyme 1 按标准方法操作 。added per 100ng DNA was 0 . 3u ,0 . 6u , 1u , 1 . 5u , 2u , 2 . 5u , 3u , 4u , 5u , 11u and 17u , respectively. Lanes 12 was loaded with DNA sample 2 结果与讨论 after EcoR ?digestion. Lanes 13 was loaded with DNA sample not treat2 ed with any enzymes. M was DNA marker . CCC , OC and L represents co2 2. 1 S核酸酶对 pUC19 的线形化 1 valently closed circle , open circle and linear conformation , respectively S核酸酶是单链 DNA 或 RNA 的特异性降解酶 ,但不同 1 的酶量对底物的作用结果迥然不同 ,中等酶量可以在切口或 2. 2 黄瓜线粒体类质粒 pC3 的线形化 小缺口处切开双链 DNA ,过量的酶可以将双链核酸完全消 上述结果明 ,在适当的酶量范围内 , S核酸酶能将微1 11 化 。在适当的条件下 , S 核酸酶能将