肝素对大鼠肾小球系膜细胞增殖和核因子κB的抑制作用

肝素对大鼠肾小球系膜细胞增殖和核因子κB的抑制作用 肝素对大鼠肾小球系膜细胞增殖和核因子 κB的抑制作用 中国药物与临床2007年4月第7卷第4期 ChineseRemedies&Clinics,April2007,Vol7,No.4 阐明的机制.另外,本研究还发现,同A组假手术组相比较,B 组(单纯手术组)HGF的达也显着升高(P<0.05).我们推测 这可能是在疾病状态下.机体内源性激活机制使HGF合成增 加. 总之,PGE.与缬沙坦均可显着影响梗阻肾病肾脏TGF— p.与HGF的表达,两者联用效果优于单独应用;两者均可显 着改善肾脏间质纤维化.联用效果优于单独应用. 参考文献 1BohleA,MullerGA.Pathogenesisofchronicrenalfailureinthe primaryglomerulopathies,renalvasculopathies,andchronicin- terstitialnephritides.KidneyInt,1996,49:2—9. 2MizunoS,MatsumotoK.Hepatocytefactorsuppressesinersitial fibrosisinamousemodelofobstructivenephropathy.KidneyInt, 2001,59:1304—1314. 3Noble—NancyA.HarmP.WayncaB.TargetingTGF-betal0ver_ expressioninrenaldisease:maximizingtheantifibroticactionof angiotensinIIblockade.KidneyInt,1998,54(5):1570. 4HuiAY,DannenbergAJ,SungJJ,eta1.ProstaglandinE2in- hibitstransforminggrowthfactorbeta1-mediatedinductionof collagenalpha1inhepaticstellatecells.JHepatol,2004,4l(21: 25l-258. 5WangYR.Kramer&Stimulationofsolubleguanylatecyclaseslows progressioninanti-thyl-inducedchronicnmcrosis.Kid- neyInt,2005.68:47-6i. 6NagaiK,AoeM.Rapidresponseofhepatocytegrowthfactorin ? 289? pulmonaryischemiainaratmode1.ActaMed,Okayama,2004, 58(3):119—125. 7OrtegaVR,GonzalezRM.Collagenupregulatesexpressionand secretionofTGF—betalbyculturedhumanmesangialcells.AmJ Physiol,2004,286(61):1335—1343. 8ZeisbergM,BonnerG.Renalfibrosis:collagencompositionand assemblyregulatesepithelial-mesenchymaltransdifferentiation. AmJPathol,2001,159:1313—1321. 91wanoM,PliethD,DanoffTM,eta1.Evidencethatfibroblasts derivefromepitheliumduringtissuefibrosis.JClinInvest,2002, l10:34l-350. 10DellK,BohlerT.ImpactofPGEloncyclosporineAinduced up—regulationofTGF—beta1,itsreceptors,andrelatedmatrix productioninculturedmesangialcells.Cytokine,2003,22(6): l89-l93. 11LiT,SurendranK,ZawaidehMA,eta1.Bonemorphogenetic protein7:anoveltreatmentforchronicrenalandbonedisease. CurrOpinNephrolHypertens,2004,13(4):417-422. 12OhnishiT,SuwaM,OvamaT,eta1.ProstaglandinE2perdomi- nantlyinducesproductionofhepatocytegrowthfactor/scatterfac— torinhumandentalpulpinacuteinflamrti.tion.jDentRes. 2000,79(o):7a8-755. (收稿日期:2006—06—13) 肝素对大鼠肾小球系膜细胞增殖和 核因子KB的抑制作用 杜烨辉李德天 肾小球系膜细胞增殖在肾小球肾炎的发生发展中起重 要的病理作用.有研究表明,核因子KB(nuclearfactor—KB, NF—KS)与系膜细胞增殖密切相关l1..近年来有不少体外,体 内试验证实肝素能抑制系膜细胞增殖,减轻肾脏病变l3.,但 其是否能通过NF—KB起作用,目前还没有明确报道.本研究 通过研究肝素对大鼠肾小球系膜细胞NF—KB的作用及其对 系膜细胞增殖的影响,旨在探讨肝素抑制系膜细胞增殖的细 胞内机制. 1与 1.1材料:大鼠肾小球系膜细胞株购自上海长征医院,常规 培养于含10%胎牛血清(FCS)和抗生素的RPMI1640培养基 中,置于37oC,5%CO孵箱中孵育,每周传代1~2次. 1.2四甲基偶氮唑蓝(M1Tr)法测定肝素对系膜细胞增殖的 作者单位:121000辽宁省锦州市中心医院肾内科(杜烨辉);中国 医科大学附属第二医院肾内科(李德天) 影响:将系膜细胞接种于96孔板(1x104/~L),37oC,5%CO孵 箱中培养24h,待细胞贴壁,弃上清,加无血清RPMI1640培 养液200IXl,孵育24h,使多数细胞同步于GD期,弃上清.分 组如下:?对照组:仅加入培养液:?脂多糖(LPS)组:加入培 养液和LPS(5~g/ml,购自美国Sigma公司);?肝素组:除加 入培养液和脂多糖(浓度同前)外,加入肝素(购自美国Sigma 公司),肝素的终浓度分别为3,30,300Ixg/m~.每种浓度设6 个复孔,孵育20h,加入M1Tr试剂(购自美国Sigma公司), 100L,孵育4h,弃上清,加二甲基亚砜,200蚜L,轻摇 动,用酶标仪测定570nm波长的吸光度. 1.3细胞核蛋白的提取:参照Edgar等l5方法略加改进.将系 膜细胞接种于3个25cm的培养瓶中,37oC,5%CO孵箱中 培养24h,待细胞贴壁,倒掉瓶内的培养液,换无血清RPMI 1640培养液孵育24h,使多数细胞处于静止期,加药,分组 如下:?对照组;~LPS(5Ixg/m1)组;?肝素组(肝素+LPS): 肝素的终浓度为300Ixg/ml,培养24h,倒掉培养液,用预冷 ? 290?中国药物与临床2007年4月第7卷第4期ChineseRemedies&Clinics,April2007,Vol7,No.4 的磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2次,将贴壁的系膜细胞轻轻刮 下.用预冷的PBS冲洗2次,4oC,1500g离心5rain,弃上 清.沉淀悬浮于400l冷缓冲液A中[10mmolHEPESpH 7.9,10mmolKC1,0.1mmol乙二胺四乙酸(EDTA),0.1mmol EGTA,lmmolDTY,0.5mmol(PMSF)],冰浴膨胀15rain,加 入10%Nonidet-40液25,充分搅拌10s后,4~C,12000g 离心lrain,弃上清,沉淀再悬浮于50l冷缓冲液B中(20 mmolHEPESpH7.9,4OOmmolNaC1,lmmolEDTA,lmmol EGTA,lmmolDTY,lmmolPMSF),在4oC振动平台上充分 振荡15rain.4oC.12000g离心10rain,取上清,一70?冻 存.提取的核蛋白常规采用紫外分光光度法测定提取蛋白浓 度. 1.4WeflernBlot法测定NF—KB蛋白P65的表达:按测定的 蛋白浓度取相应体积的细胞核蛋白提取液和等体积的2x~l/ 样缓冲液混合(相当于每泳道50g蛋白),煮沸5rain.经 10%聚丙烯酰胺凝胶SDS—PAGE电泳,200V,50rain,然后电 转移至硝酸纤维素膜上,80v,2h.膜在封闭液(含5%脱脂奶 粉和0.5%Tween20的PBS)中0?封闭过夜,然后用含 0.5%Tween20的PBS洗膜3次,用兔抗鼠p65多克隆抗体 (1:400稀释)室温封闭2h.充分洗膜后,用加入生物素化羊 抗兔IgG(1:1000稀释)室温封闭2h.充分洗膜后,与增强化 学发光剂ECL准确作用1rain,洗涤后在x线片上自显影, 扫描,照片.重复3次,结果用天能GIS(3.7版本)凝胶图像处 理系统软件进行定量分析. 1.5统计学处理:各组数据以互虹表示,多组资料间比较采 用单因素方差分析,I_SD法多重比较组间差异.以P<O.05判 断为差异有统计学意义.所有数据用SPSS11.0统计软件包进 行统计处理. 2结果 2.1肝素对LPS诱导的系膜细胞增殖的影响:结果表明,肝 素显着抑制LPS诱导的系膜细胞增殖(P<0.05),且随浓度增 加作用增强(P<0.05,见表1). 裹1肝素对LPS诱导的系膜细胞增殖的影响(;蜘) 注:a与对照组相比;与LPS组相比;与肝素3,30I~g/ml组相比 2.2肝素对NF—KBP65表达的作用:见图l.在核蛋白提取 物中,对照组并不能见到NF—KBP65的表达.而加入LPS作 用24h后.可以明显见到NF—KBP65蛋白表达.加入肝素 后.NF-KBP65的表达降低.应用GIS凝胶图像处理系统(3.7 版本)软件对所得的3次结果进行定量分析.与LPS组(213~ 26)相比,肝素组NF—KBP65蛋白水平(175~20)的表达明显 减弱(P<0.05). 第1次结果 第2次结果 第3次结果 量曩簟 1对照组;2LPS组;3肝索组 图l肝素对NF—KBP65蛋白表达的作用 3讨论 在肾小球炎症和硬化过程中,系膜细胞的病理性增殖扮 演着重要的角色,通过抑制过度增殖的系膜细胞,有利于防 治肾小球炎症的进行性发展.许多研究证明,肝素能显着抑 制肾小球系膜细胞增殖及其炎症因子的分泌[3..本实验亦证 实,肝素确实能抑制u】s诱导的系膜细胞增殖.关于肝素抗 增殖的机制.Striker'-']等指出,肝素能阻断细胞周期进程,抑制 细胞内与增殖相关的信号传导,如抑制蛋白激酶C和有丝分 裂原活化蛋白激酶的活化,调节血小板衍化生长因子,表皮 生长因子等的合成及功能. NF—KB是一种重要的转录因子,介导细胞内的信号传 导,它主要是由p50和p65两个亚单位组成的二聚体.正常 情况下,NF—KB与抑制蛋白IKB结合在一起存在于胞质中. 在某些刺激因素作用下,IKB与NF—KB解离并被降解,NF— KB随即被激活进入胞核,发挥基因转录调控作用[.近来研 究表明.NF—KB与肾小球系膜细胞增殖和分泌炎症因子密切 相关[1,2].而最近的研究又发现蛋白激酶C(PKC)参与介导T 淋巴细胞中NF-KB活化[,并且是通过激活IKB激酶使IKB 磷酸化后被降解,从而使NF—KB活化[9].还有研究证实细胞 内PKC信号通道的下段途径与NF—KB激活有关,但其确切 机制还不清楚r]. 由此我们推测,肝素作为PKC抑制剂,抑制了LPS导致 的NF—KB活化,从而抑制了系膜细胞增殖.我们的实验结果 显示,正常对照组核蛋白提取物中,NF—KBP65不表达,LPS 刺激组NF—KBP65明显表达,肝素组NF—KBP65表迭减弱, 证实肝素能抑制NF-KB活化.Thourani等["]在心肌缺血再灌 注模型中也证实了肝素能够抑制NF-KB活化.但是,肝素是 否通过抑制PKC—NF—KB通路而发挥作用及其确切机制尚 有待于进一步研究. 综上所述.本实验提示.肝素抑制LPS诱导的系膜细胞 增殖可能与其抑制NF—KB活性有关.但其确切机制尚有待 于进一步研究. 参考文献 1Guijar~C,KimY,KasiskeBL,eta1.Centralroleofthetran- scriptionfactorNF—k~ppaBinmesangialcellproductionof chemokines.ContribNephrol,1997,120:210-218. 2KashiharaN.MaeshimaY,SekikawaT,eta1.Inhibitionofhu— 中国药物与临床2007年4月第7卷第4期 ChineseRemedies&Clinics,April2007,Vol7,No.4 manmesangialcellproliferationbydecoyoligonucleotidetarget- ingthetranscriptionfactor,NF-kappaB.JAmSocNephrol, 1995,6(3):834. 3CastellotJJ,HooverRJ,HarperPA,eta1.Heparinand glomerularepithelialcellsecretedneparin-likespeciesinhibit mesangialcellproliferation.AmJPathol,1985,120:426-435. 4FloegJ,EngE,YoungBA,eta1.Heparinsuppressesmesangial cellproliferationandmatrixexpansioninexperimentalmesangio- proliferativeglomerulonephritis.KidneyInt,1993,43:369-380. 5EdgarS,PatrickM,MithaelM,eta1.RapiddetectionofO~-- tamerbinding-proteinswithmini-extractspreparedfromasmall numberofcells.NucleicAcidsRes,1989,17:6419. 6StrikerLJ,PetenEP,ElliotSJ,eta1.Mesangialcellsturnover: effectofheparinandpeptidegrowthfactors.LabInvest,1991, 64:446—456. 7BaldwinASJr.TheNF-kappaBandIkappaBprotein:newdis- ? 291? coveriesandinsights.AnnuRevImmunol,1996,14:649-683. 8SunZ,ArendtCW,EllmeierW,eta1.PKC-thetaisrequired forTCR-inducedNF-kappaBactivationinmaturebutnotim- matureTlymphoeytes.Nature,2000,404(6776):402-407. 9DienzO,HehnerSP,DrogeW,eta1.Synergisticactivationof NF-kappaBbyfunctionalcooperationbetweenvavandPKC thetainTlymphoeytes.JBiolChem,2000,275:24547-24551. 10OgataN,YamamotoH,KugiyamaK,eta1.Involvementofpm— teinkinaseCinsuperoxideanion-inducedactivationofnuclear factor-kappaBinhumanendothelialcells.CardiovascRes, 2000,45:513-521. 11ThouraniVH,BrarSS,KennedyTP,eta1.Nonanticoagulant heparininhibitsNF—kappaBactivationandattenuatesmyocar- dialreperfusioninjury.AmJPhysiolHeartCircPhysiol,2000, 48:2084—2O93. (收稿日期:2006—10—12) 扶正女贞素片和贞芪扶正颗粒对小鼠免疫功能的影响 任润和 近年来,我国各型癌症的发生率呈逐年上升趋势.资料 显示癌症的发生与机体免疫功能抑制密切相关.多种药物可 以纠正免疫抑制状态,而中药以其独特的优势为人们逐渐接 受和认可,并得以广泛应用…,其中贞芪扶正颗粒和扶正女贞 素片在临床上应用比较广[].两药组方应用相近,但成分上 存在单方与复方的不同,性价比亦有一定差距.为验证比较 两药药效,我们从小鼠免疫功能的角度进行了初步证实观 察,现报告如下. 1实验材料 1.1受试药物:扶正女贞素片(主要成分为齐墩果酸),20 mr,/片(山西省临汾健民制药厂生产).临用前将药片研成细 末,用蒸馏水配成相应浓度的混悬液.贞芪扶正颗粒,15袋 (甘肃扶正药业科技股份有限公司).临用前用蒸馏水配成相 应浓度的溶液,备用. 1.2其他药物与试剂:氯化钠注射液,250ml/瓶(阿拉宾度? 同领药业有限公司);地塞米松磷酸钠注射液,5mg/ml(天津 金耀氨基酸有限公司). 1-3受试动物:健康成年昆明种小鼠,雄雌兼用,日龄为45 d,体重为18,22g,由山西医科大学实验动物中心提供.一般 灌胃给药前禁食不禁水8h. 1.4实验仪器:Tu一1800型紫外可见分光光度计,北京普析 通用仪器有限公司;BS110型电子天平,德国Sartorius公司. 直径140cm.高55cm动物游泳池,酒精灯,一次性无菌注射 器,灌胃器,秒表等. 作者单位:030001太原,山西医科大学第一医院药剂科 2方法和结果 2.1动物用药剂量计算:扶正女贞素片临床人日用量为:成 年人每日3次,每次4片,即日用总量为240mg,按60kg体 重计算,人日用齐墩果酸剂量约为4mg?kg--?d,.按体表面积 折算小鼠的等效剂量为36.36mg?kg--?d,,本实验设齐墩果 酸小鼠的用药剂量为36.36mg?kg-,?d一. 贞芪扶正颗粒人临床日用量为:成年人每日2次,每次1 袋,即日用总量为30g,按60kg体重计算,人日用贞芪扶正 颗粒剂量约为0.5g?kg--?d,.按体表面积折算小鼠的等效剂 量为4.55g?kg-,?d,,本实验设贞芪扶正颗粒小鼠的用药剂量 为4.55g?kg-1,d,. 2.2统计学方法:实验结果以表示,用SPSS9.0统计软件 对各组结果进行方差分析.以分组t检验比较各组间差异有 无统计学意义. 2.3对小鼠体重及脾脏重量的影响:健康昆明种小鼠96只, 体重18,22g,雄雌各半,随机均分为6组,每组16只,雄雌 各半.分别为I组:正常对照组(盐水组),灌胃生理盐水10 ml?kg一,?d--;lI组:免疫功能抑制组(地塞米松组),灌胃生理 盐水10m1.k?d,,腹腔注射地塞米松25ml?kg-?d;III组: 扶正女贞素片A组,灌胃扶正女贞素片36.36mg?kg--?d--;IV 组:贞芪扶正颗粒A组,灌胃贞芪扶正颗粒4.55g?kg--?d--:V 组:扶正女贞素片B组,灌胃扶正女贞素片36.36mg?kgq?d,, 同时腹腔注射地塞米松25mg?kg--?d一,;VI组:贞芪扶正颗粒 B组,灌胃贞芪扶正颗粒4.55g?kg-1.d,,同时腹腔注射地塞 米松25mg?kg--?d,.每日用药1次,连续用药10d.用药期间