正交试验法筛选蛤蟆油粗多糖酶解提取工艺的研究

正交试验法筛选蛤蟆油粗多糖酶解提取工艺的研究 正交试验法筛选蛤蟆油粗多糖酶解提取工 艺的研究 吉林农业大学2011,33(4):403,407 JournalofJilinAgriculturalUniversity E-mail:flndxb@.sina.com 正交试验法筛选蛤蟆油粗多糖酶解提取工艺的 研究 杨靖,李硕,陈大勇,卫功庆 吉林农业大学中药材学院,长春130118 摘要:为确定胰蛋白酶酶解法提取蛤蟆油多糖的最佳提取工艺,以料液比,加酶量,酶解时间和pH值为因 子,了(3)正交试验,测定了多糖纯度和多糖得率.结果表明:最大多糖得率条件为料液比1:200,加酶 量11%,酶解时间12h,pH7.5,此条件下蛤蟆油多糖得率为7.2%;最高纯度条件为料液比l:300,加酶量 11%,酶解时间4h,pH7.5,此条件下蛤蟆油多糖纯度为16.9%. 关键词:蛤蟆油;多糖;酶解;提取工艺;(3)正交试验 中图分类号:R284.2文献标识码:A文章编号:1000—5684(2011)04.0403.05 DOl:CNKI:22—1IO0/S.20110608.1604.002 网络出版地址: .正交试验法筛选蛤蟆油粗多糖酶解提取工艺的研引文格式:杨靖,李硕,陈大勇,等 究[J].吉林农业大学学 报,2011,33(4):403.407. AStudyonZymohydrolysisExtractingTechnologyofPOlysaccharides fromOviductusRanaebyL9(34)OrthogonalDesign YANGJing,LIShuo,CHENDa—yong,WEIGong—qing CollegeofChineseMedicinalMaterials,.illinAgriculturalUniversity,Changchun130118,China Abstract:Inordertoinvestigatetheoptimizationofzymohydrolysis'extractingtechnologyofpolysaccha— tidesfromOviductusRanaebytrypsinase,waterfraction,trypsinaseconcentration,zymohydrolysistime andzymohydrolysispHweretakenasfactorsforIJo(3)oahogonaldesigntrials.Theindexesofextracting outputandpurityofpolysaccharideswereexamined.Resultsshowedthattheoptimumconditionsforthe highestoutput(7.2%)were:theratioofwatertosamplewas1:200,trypsinaseconcentrationwas 11%;zymohydrolysistimewas12h,andzymohydrolysispHwas7.5.Theoptimumconditionsofthe highestpurity(16.9%)were:theratioofwatertosamplewas1:300;trypsinaseconcentrationwas 11%;zymohydrolysistimewas4h,andzymohydrolysispHwas7.5. Keywords:OviductusRanae;polysaccharides;zymohydrolysis;extractingtechnology;L9(3)orthogo— naldesign 蛤蟆油(OviductusRanae),系蛙科动物中国林 蛙(Rannechensinensis)雌蛙的输卵管干制品[?,为 我国名贵滋补中药材,具有抗应激,抗衰老,防治 小儿哮喘,增强免疫力引,抗疲劳[,抗肿瘤等药 理作用[.蛤蟆油基本化学成分:水分11.82%, 粗蛋白54.93%,粗脂肪4.36%,粗灰分4.88%, 无氮浸出物23.21%,热能20.72kJ/g;另外还富 含多种维生素,氨基酸,脂肪酸及矿物质元素[引. *基金项目:吉林省科技发展项目(08SYS.097) 作者简介:杨靖,男,硕士研究生,主要从事特种经济动物繁育方向的研究. 收稿日期:2010.12.16网络出版时间:2011-06.0816:04 **通讯作者 404吉林农业大学2011年8月 虽然对蛤蟆油化学成分的研究报道较多【6...,但 对蛤蟆油多糖的研究报道较少. 天然产物多糖已成近年来的研究热点.诸多 研究结果表明多糖可增强机体免疫功能_1,不但 能增强网状内皮系统的吞噬功能【4J,还可以促进 蛋白质,特别是免疫球蛋白的合成_l,具有较高 的抗癌,抗基因病毒活性_1.蛤蟆油多糖是蛤蟆 油成分之一.范玉林等测得蛤蟆油中还原糖含量 为6.8%,多糖含量为6.18%[.由于成分,结构 及组织器官的复杂性,对蛤蟆油多糖的研究进展 缓慢,其诸多药理作用与多糖成分是否有关还不 明了.为此,研究蛤蟆油多糖的提取工艺对于下 一 步蛤蟆油有效成分的研究与开发利用有着极为 重要的意义. 1材料与方法 1.1材料 蛤蟆油购于长春市古鳄参茸商行,由长春中 医药大学张辉教授鉴定为长白山产蛤蟆油;酶活 力>250NFU/mg的胰蛋白酶(1:250)和酶活力 ?5万U/g的中性蛋白酶购于西安沃尔森生物技 术有限公司;胃蛋白酶(1:3ooo)购自中国惠世生 化试剂有限公司,其他均为分析纯试剂(北京化工 厂). 1.2主要设备 2列6孑L水浴锅(河北黄骅市航天仪器厂), DT一500电子天平(常熟金羊硅码仪器公司), 101—2一S鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂), 754GD紫外可见分光光度计(山东高密彩虹分析 仪器有限公司),PHS一3C精密数显酸度计(杭州 雷磁分析仪器厂),FD一1A一50冷冻干燥机(北京 博医康实验仪器有限公司). 1.3方法 1.3.1酶种类的选择选用中性蛋白酶,胰蛋 白酶,胃蛋白酶对蛤蟆油干粉进行水解,以多糖得 率为指标进行比较.分别称取蛤蟆油干粉5g,按 料液比1:100加入蒸馏水于50?恒温水浴锅中 浸泡24h,匀浆,分别加5%底物浓度的胃蛋白酶 (pH2.0,37oC),中性蛋白酶(pH7.0,50?),胰 蛋白酶(pH8.0,37?),酶解2h(在消化过程中, 每隔10min摇1次)_l..之后放入沸水浴中加 热10min灭酶活性,12000r/min离心,取上清液 浓缩,加入3倍体积95%乙醇沉淀低温静置过 夜,4000r/min离心10min,将沉淀置于滤纸上, 用乙醇,丙酮各洗涤3次.在40?温水下将沉淀 溶解,离心去水不溶性杂质,Sevage法除蛋白,浓 缩,加入3倍体积95%乙醇,低温静置过夜, 4000r/min离心10min,取沉淀冷冻干燥,得蛤蟆 油粗多糖. 1.3.2蛤蟆油多糖提取工艺蛤蟆油烘干(测 得蛤蟆油含水量为21.94%),捣碎,过筛,称取 45g蛤蟆油干粉加4500mL蒸馏水浸泡12h后 匀浆;各取500mL,分别加入0,500,1000mL蒸馏 水,使其料液比为1-100,l:200,l:300.分别加入 不同量的胰蛋白酶,在一定pH值下(用0.1mol/L 的NaOH或HC1调节【1),37?酶解一定时间,沸 水浴中加热10min灭酶活性,12000r/min离心取 上清液浓缩,加入3倍体积95%乙醇沉淀;低温 静置过夜,4000r/min离心10min,将沉淀置于滤 纸上用乙醇,丙酮各洗涤3次_l.在40?温水 下溶解,离心去水不溶性杂质;Sevage法除蛋白, 浓缩,加人3倍体积95%乙醇,低温静置过夜, 4000r/min离心l0min,取沉淀冷冻干燥,即得蛤 蟆油粗多糖. 1.3.3正交试验设计以提取蛤蟆油多糖过程 中的蛤蟆油与水的混合料液比,加酶量,酶解时间 和pH值为因素,按表l设计I_9(3)正交试验. 表1正交试验因素水平表 Table1.Orthogonaltest JournalofJilinAgriculturalUniversity2011,August 杨靖等:正交试验法筛选蛤蟆油粗多糖酶解提取工艺的研究405 1.3.4多糖定性试验莫利胥反应:取2mL多 糖溶液,加入等量的10%甲.萘酚溶液,混合均匀 后,将试管倾斜,沿着试管壁慢慢加人等量浓硫 酸,小心将试管竖立,使液层界面清晰,静置.如 果有多糖存在,上下层中间出现紫色环,紫色环上 呈束状乳白色,环下呈透明状物态.如无环出现, 可微热几分钟.经过定性试验,试管中经微热后 出现紫色环,确定糖类物质的存在. 利用苯酚一硫酸比色法u'J测定多糖含量,在 490nm处测定吸收值,吸收值与糖含量呈线性关 系. 1.4多糖得率和纯度的计算 多糖得率=提取物中所含多糖重量/原料干 品重量x100%. 多糖纯度=提取物中所含多糖重量/粗提物 P<0.05. 2结果与分析 2.1不同酶对蛤蟆油多糖提取影响的比较 胰蛋白酶酶解蛤蟆油多糖得率为2.3%,远 远高于胃蛋白酶(0.19%),略高于中性蛋白酶 (2.16%).由于酶的类型和底物蛋白的组成不 同,致使各种酶对蛋白底物的酶切专一性不同. 动物多糖大多是由多糖连在较大蛋白链上,需要 尽量切除蛋白而保留多糖部分,酶的专一性越差 越有利于多糖的分离提取,所以不同酶酶解蛋白 后获得多糖的效果有较大差异.从试验结果来 看,对于酶法水解林蛙油制备多糖,胰蛋白酶较适 宜,而且在试验过程中,胰蛋白酶酶解后的沉淀量 较少,其将大分子的蛋白酶解为小分子的多 重量×100%.肽时较其他蛋白酶更加彻底.所以选择胰蛋白酶 多糖净得量=样品量(g)×多糖得率.为最佳水解酶,并确定其最适酶解条件. 1.5数据统计与分析2.2提取物得率试验结果 数据统计采用SPSS13.0,显着性水平设置为正交试验所得数据见表2. 表2多糖提取率试验结果 Table2.Resultsofpolysacchaddesextractiontrail 试 N 蛸 o. . 液比 A A B 量 . 酶解时C lidliquidofEnzymolys 间 is.品So. 阳ti0Am0untenzvmetimepn 得率/% Extraetionrate 吉林农业大学JournalofJilinAgriculturalUniversity ?,}弛如记 336365455 233.223, 瑚瞒瞒mH:2H:., H"-二C.:0.: 砣甜3 ,2323.23 髓瑚珏?"5 ...222333 一一一舵 值m .04n舵娼只最 406吉林农业大学2011年8月 通过方差分析得出,B因素对多糖提取率影 响显着(P<0.05),A,C,D因素均无显着性影响 (P>0.05).加酶量对提取率影响最大,其次是 酶解时间,料液比,pH值,即B>C>A>D.最优 条件为A2B3C3D.,即最高提取率的条件为料液比 1:200,酶浓度11%,酶解时间12h,pH7.5.测得 提取率为7.2%,多糖纯度为9.12%. 2.3多糖纯度试验结果 正交试验所得结果见表3. 表3多糖纯度试验结果 Table3.Resultofpuritytrai 试验号 NO. A 料液比 Solid?liquidratio B 加酶量/% Amountofenzyme C 酶解时间/h Enzymolysistime D pH 粗提物纯度/% Finenessof crudeextraction 1 4 , 6 8 9 K1 K2 K3 k1 2 3 最优值 Theoptimum 6.00 6.53 88 8.56 9.65 10.73 8.52 11.27 14.25 通过方差分析得出,料液比,加酶量对多糖纯 度影响显着(P<0.05),酶解时间,pH值对多糖纯 度影响不显着(P>0.05).料液比对多糖纯度影 响最大,依次是加酶量,pH值和酶解时间,即A> B>D>C.最优条件为A3c】D1,即料液比1: 300,酶浓度11%,酶解时间4h,pH7.5.测得提 取率为4.74%,多糖纯度为16.9%. 3讨论 3.1酶对提取率的影响 通过蛤蟆油粗多糖得率对3种不同的酶进行 比较,结果发现,胰蛋白酶最适合用于蛤蟆油粗多 糖的提取,这是由酶的特异性和蛤蟆油蛋白质的 组成所决定的.由于胰蛋白酶对蛤蟆油的特异性 最高,水解蛋白质也就最充分,释放出的多糖也就 最多.所以,酶的选择对本试验意义重大. 3.2提取条件对提取率的影响 最高提取率的条件料液比1:200,酶浓度 11%,酶解时间12h,pH值7.5.酶浓度对提取物 产量影响显着,其他因子的影响均不显着. 理论上,在一定范围内提取率随着料液比的 增加而增大,液体太少达不到与底物充分混合的 目的,而液体太多又会在后续的浓缩和脱蛋白中 损耗多糖,同时浪费大量的人力和试剂|j.本试 验所设计的料液比皆属于合理范围,对试验结果 无显着影响. 在加酶量达到饱和之前,多糖得率与加酶量 成正比,加酶量越大,酶解速度越快,反应越充分. 达到饱和后,多糖得率不会因为加酶量的增加而 继续增加,反而使体系中杂质增加_1,提高成本. 所以,本试验所设酶浓度处于未达饱和水平. 多糖得率随着酶解时间的延长而增加,到一 定时间后增加变得缓慢,此时蛤蟆油中多糖浓度 与液相中的多糖浓度达到了平衡,便不再增 加El4].但是延长提取时间易出现样品变质等不 良后果,增加试验风险. 3.3提取条件对提取物多糖纯度的影响 最高多糖纯度的条件为料液比1:300,酶浓 JournalofJilAgriculturalUniversity2011August m卯卯勰H勰口:Lc ,} o= 鹏??珏u日 甜舛H:20们 杨靖等:正交试验法筛选蛤蟆油粗多糖酶解提取工艺的研究407 度11%,酶解时间4h,pH值7.5.料液比和加酶 量对提取物中多糖纯度影响显着.在试验设计范 围内,料液比值越大,提取物中多糖纯度越高.料 液比可能通过影响酶解后的多糖分离过程而影响 提取物中多糖纯度. 3.4提取物产量与多糖纯度的关系 从试验结果可以看出,最大多糖得率的条件 与最高提取物多糖纯度的条件不同.料液比和酶 解时间对二者的作用不同,可能是主要影响因素. 参考文献: 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].2010版.北 京:中国医药科技出版社,2010. 于洋,姜大成,张炜煜.哈蟆油对免疫力低下小鼠体内脂 肪酸含量的影响[J].长春中医药大学,2008,24(4): 150—151. 李津明,宋茜,孙仁爽,等.林蛙油酶解前后抗疲劳作用对 研究[J].黑龙江医药,2008,21(2):30.34. 高燕玲.甘肃产哈蟆油对小鼠免疫能力和应激性能的影响 [J].中药材,1996,19(2):90.92. 白雪松,宋春梅,杜鹃,等.林蛙油研究进展[J].吉林医药 学院,2009,30(4):227.228. 田春雨,杨东,曹阳,等.哈蟆油的营养保健成分及药理作 用[J].长春中医药大学,2006,9,22(3):56. 肖炜,邓虹珠.哈蟆油化学成分与药理研究概况[J].中药 材,2002,25(9):681.683. 刘郁,刘连新.林蛙油的成分及药理研究进展[J].海峡药 (上接第402页) [2]AntonioE~idente,AminaHAbou?Donia,FikfiaADarwish,eta1. 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