鱼腥藻N_乙酰_D_葡萄糖胺2_差向异构酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

鱼腥藻N_乙酰_D_葡萄糖胺2_差向异构酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效达 () 文章编号 : 1006 - 2858 200812 - 1007 - 04 鱼腥藻N - 乙酰 -D - 葡萄糖胺2- 差向异构酶基因的 克隆及其在大肠杆菌中的高效表达 1 2 1 2 王立军, 朱丽, 张怡轩, 戈梅 ()11 沈阳药科大学 制药工程学院 ,辽宁 沈阳 110016 ; 21 上海来益生物药物研发中心 ,上海 201203 ( ) 摘要 : 目的 从鱼腥藻 7120 A n abaen a sp1 PCC 7120中克隆 N - 乙酰 - D - 葡萄糖胺 2 - 差向异构酶 ( ) N2acyl2 D2glucosamine 22epimerase ,A GE基因 ,并在大肠杆菌中表达 。方法 利用 PCR 技术从鱼腥藻 染色体组扩增 A GE 基因 ,通过基因工程方法构建表达质粒 pL Y211 ,在大肠杆菌中表达 ,并利用 Ni2 N TA 柱分离纯化 。利用柱前衍生化的方法 ,通过 HPL C 检测表达产物转化 N - 乙酰 - D - 甘露糖胺 ( ( ) N2acyl2 D2mannosamine ,ManNAc的 活 性 , 并 联 合 N - 乙 酰 神 经 氨 酸 裂 合 酶 N2acet ylneuraminate ) ( ) lyases ,NAL,进行 双 酶 转 化 生 成 N - 乙 酰 神 经 氨 酸 N2acet ylneuraminic acid , Neu5Ac实 验 。结 果 - 1 A GE 基因在大肠杆菌中表达 ,可溶性产物蛋白占总可溶性蛋白质量的 18 % ,经纯化后得到116 g?L - 1 产物蛋白 。双酶转化实验中 ,转化终产物 Neu5Ac 质量浓度为 1418 gL? 。结论 鱼腥藻 7120 A GE 基因 在大肠杆菌中的表达产物具有活性 ,为双酶转化制备 Neu5Ac 进行了初步的探索 。 关键词 : N - 乙酰神经氨酸 ; N - 乙酰 - D - 葡萄糖胺 2 - 差向异构酶 ; N - 乙酰 - D - 甘露糖胺 ; 双酶法 中图分类号 : R 94 文献标志码 : A ( N - 乙酰神经氨酸 N2acet ylneuraminic acid , 进行了有益的探索 。 ) Neu5Ac是合成一种抗流感病毒药物主要前体物1 仪器与材料 1 质,目前获得 Neu5Ac 的方法虽然有多种 ,但由 ( ) PCR 仪 德国 Eppendo rf 公司, FR - 200 紫 于生物转化法制备 Neu5Ac 具有工艺简单 , 纯化 ( ) 外与可见装置 上 海 复 日 科 技 公 司, D K - 方便 、污染少等优点 ,因此目前主要采用该方法制 () 备 。生物转化制备 Neu5Ac 的方法有 2 种 : 单酶 8D 型电热恒温水槽 上海跃进医疗器械厂,J A - 法和双酶法 。其中单酶法 ,即利用 N - 乙酰神经() 25 型高速冷冻离心机 美国 Beckman 公司,电泳 () ( ) 仪 北京东方特力科贸中心, V E - 180 垂直电泳 氨酸裂合酶 N2acet ylneuraminate lyases ,NAL 催 ( () 化 N - 乙 酰 - D - 甘 露 糖 胺 N2acyl2 D2man2 槽 上海天能科技有限公司, U V762 紫外分光光 ) no samine ,ManNAc和丙酮酸直接生成 Neu5Ac 。() 度计 上海精密科学仪器有限公司。 α( ) E1 col i BL 21 D E3 、E1 col i D H5、E1 col i该法步骤简单 , 转化效率及产率都比较理想 , 但 (ManNAc 昂贵的价格限制了这种方法的应用 。双 BL 21/ pL Y - 3 均由上海来益生物药物研发中心 2 酶法,即用 N - 乙酰 - D - 葡萄糖胺 2 - 差向 提供 , E1 col i BL 21/ pL Y - 3 基 因 工 程 菌 含 有 能 ( ) ( N2acyl2 D2gluco samine 22epimerase , 够高效表达 NAL 的表达质粒, PMD - 18 T 日 异 构 酶 ) ( ) ( A GE,先将 N - 乙酰 - D - 葡萄糖胺 N2acet yl2 本 Ta Ka Ra 公 司 , p E T - 30a 德 国 Novagen 公 ) ( ) D2gluco samine , GlcNAc转 化 生 成 ManNAc , 再 由 司, Taq DNA 聚 合 酶 、限 制 性 内 切 酶 日 本 ) ( NAL 最终催化生成 Neu5Ac 。目前使用的 A GE 主 Ta Ka Ra 公司, 氨苄青霉素和卡那霉素 华美生 ) ( ) 要来源猪肾 A GE 基因在大肠杆菌的异源表达 ,但 物工程公司,琼脂糖 美国 Phar macia 公司,1 - ( 由于物种间差异大 ,表达蛋白大部分形成包涵体 , 苯基 - 3 - 甲基 - 5 - 吡唑啉酮 PM P ,美国 Panya ) ( A GE 产量低 。 化学试剂有限公司, PCR 引物 上海生物工程公 本文作者利用基因重组技术 ,克隆并高效表) 司,其他所用化学药品及试剂均购自上海生物工 达了鱼腥藻 7120 A GE 基因 ,并对异构酶进行了 分 程公司和华美公司 ,DNA 序列由日本 Ta Ka Ra 公 离纯化和催化活性试验 ,为双酶法制备 Neu5Ac 司测定 。 收稿日期 :2008 - 03 - 10 () () ( ) ( ) 作者简介 :王立军 1981 - ,男 汉族,辽宁葫芦岛人 ,硕士研究生 ; 戈梅 1971 - ,女 汉族,江苏南京人 ,副研究 员 ,主要从事生物药物的研究 , E2ma il hccbred @gmail1co m 。 3 实验所用培养基均为 LB 培养基, 并根据酶液 和 A GE 粗 酶 液 。制 备 10 mL 转 化 体 系 : - 1 ( ) NAL 粗酶液和 A GE 粗酶液各 114 mL ,0172 mol需要添加氨苄青霉素 100 mgL? 或卡那霉素 - 1 (() ) GlcNAc p H712,013 mol 丙酮酸钠 p H712。30 () 50 mgL? 。 ?转化 13 h 。转化产物利用 HPL C 检测 。 2 方法 3 结果 211 鱼腥藻 7120 A GE 基因克隆及测序 311 A GE 基因的克隆及表达质粒的构建 根据文献报道 , 鱼腥藻 7120 A GE 基因序列 () accessio n : N C 003276 , 设 计 合 成 上 下 游 引 物 以鱼腥藻 7 120 染色体组为 ,进行 PCR( ) P7 、P8, 并在 A GE 基因序列上游添加 N de I 位 () 扩增 ,得到约 1 167 bp 的扩增产物 如图 1A。将 点 ,在 下 游 添 加 Hi n d I I I 位 点 。P7 : AA GC T2 含有质粒pL Y - aage 的亚克隆子送样测序结果表 ( ) TAC TCAAC GCC TC GAAC T G Hi n d I I I , P8 : 明该片段长度为 1 167 bp ,与文献报道鱼腥藻 7 120( ) CA TA T GGGGAAAAAC T TACAA GCACN de I。 A GE 基因序列完全吻合 。表明实验中克隆得到的基 采用常规分子克隆技术 ,以鱼腥藻 7120 染色因是鱼腥藻 7 120 中预测的 A GE 编码基因 。pL Y - 体为 模 板 , 按 照 常 规 的 PCR 条 件 , 94 ?变 性aage 经 N de I 和 Hi nd III 双酶切后插入到质粒p ET - 2 min ;然后 94 ?变性 30 s ,55 ?退火 30 s ,72 ? 30a 的相应位点 ,构建成重组表达质粒pL Y - 11 ,经酶 延伸 1 min 共 29 个循环 ;最后延伸 10 min 。PCR () 切验证正确 如图 1B 所示。 产物经琼脂糖凝胶电泳回收 ,将其克隆到 PMD - α18 T 载体上 ,然后转化大肠杆菌 D H5感受态细 胞 ,经蓝白斑筛选 ,得到了阳性克隆子 ,抽提其质 粒并命名为pL Y - aage 。通过电泳检测后 ,送大连 Ta Ka Ra 公司测序 。 212 重组 A GE 表达质粒的构建及异源表达 pL Y - aage 经 N de I 和 Hi n d I I I 双酶切后插 入到质粒p E T - 30a 的相应位点 ,构建成重组表达 质粒 pL Y - 11 。酶 切 鉴 定 后 , 转 化 大 肠 杆 菌 BL A : 1 —1 kb DNA L adder ; 2 —The p roduct of PCR ; 3 , Co n2 ( ) ( 21 D E3 感 受 态 细 胞 , 挑 单 个 阳 性 克 隆 E1 col it rol ;B : 1 —pL Y211 digested by N de I and Hi n d I I I ; 2 —The ) BL 21/ pL Y - 11到添加卡那霉素的 LB 培养基中reco mbinant plasmid ,pL Y211 ; 3 —p E T30a digested by Nde I and Hi n d I I I ;4 —1 kb DNA L adder 37 ?培养过夜 。取 1 mL 菌液加入到含卡那霉素 Fig. 1 Construction of the recombinant expression vector , 的 100 mL LB 中 ,培养到 OD为 016 , 018 后 , 600 pLY211 312 N - 乙酰 - D - 葡萄糖胺 2 - 差向异构酶在 - 1 ( ) 加入 IP T G 终 浓 度 为 1 mmol ?L 30?诱 导 大肠杆菌中的表达和纯化 4 h ,通过SDS - PA GE 电泳检测结果 。pL Y - 11 质 粒 的 大 肠 杆 菌 BL 21 接种 含 有 213 重组 A GE 活性测定() D E3,经 IP T G 诱导表达 4 h , 收集菌体 。菌体 利用转化 ManNAc 的酶促反应 ,测定该酶活 经 PB S 缓冲液洗涤后超声破碎 ,离心后获得上清 (μ) 性 。酶活性测定反应体系 400 L 包括 20 mmol 粗酶液 。SDS2PA GE 表明在诱导 4 h 时可溶性重 μTris - HCl p H 712 , 10 mmol ManNAc , 20 L 酶 组蛋白的表达量约占总可溶蛋白质量的 1818 % , 液 。37 ?水浴反应 4 h 后 ,沸水浴 3 min 终止反) ( 重组蛋白相对分子量约为 42 kDa 如图 2 所示。 3 应 。将反应混和物用 PM P 进行衍生化 , 衍生化 因为重组表达的蛋白带有 6 His Tag , 所以利用4 。 HPL C 检测产物通过 () Ni2N TA 亲和柱 德国 Novagen 公司纯化 。其方 ?R 214 双酶法转化反应法详见 Ni2N TA HisB?indResin 说明书 。最终以 将 E1 col i BL 21/ pL Y -3 和 E1 col i BL 21/ 200 mmol咪唑将蛋白洗脱 ,用含质量分数为 10 %pL Y - 11 两 株 菌 分 别 按 照“211 ”条 的 方 法 在 的甘油的 20 mmol p H 712 Tris - HCl 缓冲液透析 100 mL LB 培养基中诱导 4 h 后 ,离心收集菌体 ,24 h ,以除去可能影响蛋白活性的高浓度的咪唑 。 5 分别混悬于 5 mL 20 mmol p H712 Tris - HCl 中 以 B SA 为 标 准 , 利 用 Bradfo rd 法测 定 蛋 白 含 - 1 超声破碎 ,离心分离得到上清粗酶液 ,即 NAL 粗 量 ,计算所得蛋白产量为 116 gL? 。 第 12 期 王立军等 :鱼腥藻 N - 乙酰 - D - 葡萄糖胺 2 - 差向异构酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的高效表达 1009 定过 程 以 ManNAc 为 反 应 底 物 。由 于 ManNAc 与 GlcNAc 为一对手性对映体 ,用 HPL C C柱无 18 法直接检测 ,所以在测定酶活性时将转化得到混 合物进行 PM P 柱前衍生化 。衍生化反应在 p H8 左右进 行 , ManNAc 与 GlcNAc 的 衍 生 化 产 物 可 以 利 用 C18 柱 进 行 分 析 。取“312 ”条 所 述 含 - 1 μ 116 gL? A GE 的 酶 液 20 L , 转 化 10 mmol ManNAc 后 , 进 行 PM P 衍 生 化 后 利 用 HPL C 检 () μ测 如图 3 C,同时以 20 L 质量分数为 10 %的 ( ) 1 —Protein molecular weight mar ker low ; 2 —SDS2PA GE 甘油 20 mmol , p H 712 Tris - HCl 缓 冲 液 代 替 ( ) analysis of E1 col i BL 21 D E3 / p E T30a induced by () A GE 的反应体系为对照 如图 3 A。通过与 Glc2- 1 E1 col i BL 21 1 mmolL? IP T G;3 —SDS2PA GE analysis of ( ) NAc 标准品衍生化结果的比较 如图 3 B, 上述 ( ) D E3 / pL Y211 wit hout IP T G inducing ; 4 —Soluble f rac2 含有 A GE 的转化体系中生成了 GlcNAc ,进而证 ( ) tio ns of crude p rotein ext ract s of E1 col i BL 21 D E3/ pL Y2 - 1 11 induced by 1 mmol?L for 4 h ;5 —Insoluble f ractio ns of 明 A GE 具有异构化 ManNAc 生成 GlcNAc 的活 ( ) crude p rotein ext ract s of E1 col i BL 21 D E3 / pL Y211 in2 性 。 - 1 duced by 1 mmol?L IP T G for 4 h ;6 —Purified A GE f ro m 314 双酶法转化反应metal2chelate affinity chro matograp hy o n a Ni2N TA column 在 NAL 和 A GE 粗酶液转化体系中 ,A GE 先 Fig. 2 SDS2PAGE analysis of the recombinant product 将 GlcNAc 异构化生成 ManNAc ,ManNAc 和丙酮 N - 乙酰 - D - 葡萄糖胺 2 - 差向异构酶的313 酸钠经 NAL 催化最终生成 Neu5Ac 。转化反应产 活性测定 物经 80 ?热变性去除蛋白 , HPL C 检测结果表明 GlcNAc 异构化反应为可逆反应 ,并且反应平- 1 转化产物 Neu5Ac 的最终质量浓度为1418 gL? ,2 ,因此 A GE 的活性测 衡更倾向于生成 GlcNAc() 质量转化率 针对 GlcNAc为 913 %。 A —HPL C2U V chro matogram of t he PM P2derivatized 10 mM ManNAc ;B —PM P2derivatized 10 mM GlcNAc ; C —PM P2deriva2 μtized reactio n mixt ure of 10 mM ManNAc af ter catalyzed wit h 20L of p urified A GE Fig. 3 The N2acetyl2 D2glucosa mine 22epimerase activity detected by HPLC :参考文献 4 讨论 ( ) 在大 肠 杆 菌 BL 21 D E3 中 实 现 了 鱼 腥 藻 1 吴剑荣 ,詹晓北 ,郑志永 ,等 . 聚唾液酸与唾液酸的研 () 究进展 J . 生物加工过程 ,2007 ,5 1:20 - 26 .A GE 的 表 达 , 可 溶 性 产 物 占 总 蛋 白 质 量 的 2 MARU I , O HN ISHI J , O H TA Y , et al . Wh y is sialic 1818 % 。体 外 实 验 表 明 产 物 蛋 白 具 有 异 构 化acid at t racting interest now ? Co mplete enzymatic syn2 t hesis of sialic acid wit h N2acylglucosamine 22epimerase ManNAc 生成 GlcNAc 的 活 性 , 并 且 可 以 利 用 其 J . Journal of Bioscience and Bioen gineering , 2002 , 93 - 1 粗酶 与 NAL 粗 酶 联 合 转 化 生 成 1418 g ?L 的 () 3:258 - 265 . 3 SAMB ROO K J , FR I TSCH EF ,MAN IA T IS T. Molecu 2 Neu5Ac ,为利用鱼腥藻 7120 A GE 及 NAL 双 酶 lar clo ning : A laboratory manual : 2nd ed M . New 转化制备 Neu5Ac 做了初步的探索 。鱼腥藻属于 Yor k : Cold sp ring harbor laboratory p ress ,1989 . 念珠蓝细菌目 ,其中 7120 基因组序列 2001 年测 4 HONDA S , A KAO E , SU ZU KI S , et al . Hi gh2perfor2 6 mance liquid chro matograp hy of reducing carbo hydrates 序完成。其 A GE 氨基酸序列比对结果虽然与 as st ro ngly ult raviolet2absorbing and elect rochemically 猪 A GE 同源性仅为 3515 % ,但经作者和 Maru 等 sensitive 12p henyl232met hyl252p yrazolo ne derivatives 7() J . Anal Biochem ,1989 ,180 2:351 - 357 . 实验 表 明 两 基 因 表 达 产 物 都 具 有 A GE 活 人5 B EN SADOU N A , W EIN S T EIN D. Assa y of p roteins in 性 。而且 ,鱼腥藻与大肠杆菌同属原核微生物 ,蛋 t he p resence of interfering materialsJ . Anal Biochem , 白表达过程相似 。因此 ,推测在大肠杆中表达鱼 () 1976 ,70 1:241 - 250 . 6 KAN E KO T ,NA KAMU RA Y , WOL K CP ,et al . Co m 2 腥藻 7120 A GE 与猪肾 A GE 相比 ,获得可溶性蛋 plete geno mic sequence of t he filamentous nit rogen2fix2 白的比例可能较高 。实验结果证明了这种推测合ing cyanobacterium anabaena sp . St rain PCC 7120 J . () DNA Research ,2001 ,8 5:205 - 213 . 理 。另外 ,N CB I 数据库中与 7120A GE 序列相同 7 MARU I , O H TA Y , MU RA TA K , et al . Molecular 或相似的蛋白数目很多 ,有希望从中筛选出性能 clo ning and identificatio n of N2acyl2 D2glucosamine 22 更为优良的 A GE 酶 ,实验的结果为此开辟了新的 epimerase f ro m porcine kidney as a renin2binding p rotein J . Biochemist r y and Molecular Biology , 1996 , 271 渠道 。() 5:16 294 - 16 299 . N2acyl2 D2gl u2 Cl on ing and high expression of A n a baen a cosa mine 22epimera se gene f rom sp. in Esc he r ic hi a col i 1 2 1 2 WAN G Li2jun, ZHU Li, ZHAN G Yi2xuan, GE Mei (1 . S chool of Pha r m aceu t ical En gi nee ri n g , S heny a n g Pha r m aceu t ical U ni ve rsi t y , S hen y a n g 110016 , )Chi n a ; 2 . S ha n ghai Heal t h Creat ion Cen te r of B iop ha r m aceu t icals R & D , S ha n ghai 201203 , Chi n a () Abstract : Object ive To clo ne t he gene of N2acyl2 D2gluco samine 22epimerase A GEand exp ress it in E. col i . Methods The gene of A GE was clo ned f ro m t he geno me of A n abaen a sp . PCC7120 by PCR technique . An exp ressio n plasmid pL Y211 was co nst ructed t hro ugh genetic engineering met ho d and exp ressed in E. () coli BL 21 D E3. The soluble reco mbinant A GE was p urified by t he Ni2N TA column ,and t he activity of ( ) A GE was detected using PM P derivatizatio n met ho d and N2acyl2 D2manno samine ManNAcas subst rate . ( ) Subsequently ,a p reliminary test fo r dual2enzymatic synt hesis of N2acet ylneuraminic acid Neu5Acwas es2 tablished. Results The A GE gene was exp ressed resulting in 18 % of t he total soluble p rotein , and - 1 1 . 6 g?L p rotein was o btained af ter p urificatio n . In t he dual2enzymatic synt hesis system ,t he final co ncen2 - 1 t ratio n of t ransfo r matio n p ro duct ,Neu5Ac ,was 14 . 8 g?L . Concl usions A GE exp ressed in E. col i is ac2tive ,and t he dual2enzymatic synt hesis fo r Neu5Ac is co nducted fo r p reliminary explo ratio n . Key words : N2acet ylneuraminic acid ; N2acyl2 D2gluco samine 22epimerase ; N2acyl2 D2manno samine ; dual2 enzymatic synt hesis