牛奶酪蛋白各组分与大豆蛋白交叉过敏反应研究

牛奶酪蛋白各组分与大豆蛋白交叉过敏反应研究 分类号 密绷, , , 编号 十(初大学 ,,,,,,, ,,,,, ,,，,,,,，,, 硕士学位 沦文题目 生塑酸蛋臼釜塑筮量盍亘 蛋白窑翌过熟厘堕盟宣 学科、二;、，, 药塑尴堂 研究生姓名 匦田堡丛 指导教师 筮,幽 麴攫 ,南人学 零„贰年六分类弓,,, 密级 硕士学位论文 牛奶酪蛋白各组分与大豆蛋白 交叉过敏反应研究,,,,, ,, ,,, ;,,,,,,,,;,,,, ,,,,,,, ;,,,,,,,,, ,, ;,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,, 作者姓名: 欧阳逸斌 学科专业: 药物化学 学院(系、所) 分子药物与治疗研究所 指导教师: 徐,,〕教授 论文答辩【,,,划,,,,二,鱼二,, 答辩委员会,席 ,,,,南人学 ,,,,年,月 原创性声明 本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的科研成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发或撰写过的科研成果，也不包含为获得巾南大学或其他单位的学位或证而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。 作者签名跨,旦,笼勘,日捌:,盟旦年互川(,闩 关于学位论文使用授权说明 本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即:学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阕;学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。，刊时授权中国科学技术信息研究所将本学位沦文收录到《,,,,，国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作揣彰:谧鬯碜。獬硕士学位论文 摘要 摘要 目的;牛乳和大豆都是联合国公布的八犬类常见过敏食物之一。有研究报道，在牛奶过敏的患者，有一部分患者对大豆存在着交叉过敏反应，但是具体的交叉过敏组分尚未确定，因此，开展交叉过敏反应的组分研究对于合理有效的避免交叉反应的发生、临床用药指导及临床药物筛选模型的建立具有重要的意义。 方法:采,,阴离子交换树脂对酪蛋白的各组分进行分离纯化，并对所得的各组分进行纯度以及浓度浆定，使用在线数据库氨基酸序列比对，以及,,，,,、,,,,,,,(,,,,技术测定酪蛋白各组分对大豆抗血清的结合率情况，并进行分析。 结果:通过阴离子柱分离纯化得到酪蛋白各组分纯品，,,,，,,,,电泳显示达到电泳纯，并分别得到,,;,,,,,、,,,,,;,,,,,和,,,;,,,,,和纯品,(,,,,、,,(,,,,、,, ,,,,;通过在线序列比埘以及,,，,,和,,,,,,,(,,,,,,,,技术检测得到:，,,,,;,,,,,与大豆蛋白存在交叉过敏现象，其概率为,,,:,,;,,,,,与大豆蛋白同样存在交叉过敏现象，其概率约为,,,:,(;,,,,,与大豆蛋白并无交叉过敏现象存在。 结论:牛奶酪蛋白组分巾,,,,,;,,,,,与,,;,,,,,与大豆过敏蛋白存在交义过敏反应的可能，概率分别是,,,,？？ ,,,。关键词交义过敏，分离纯化，牛奶酪蛋白，大豆抗血清 ，,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,，,,:,,,, ,,, ,,,(,,,, ,,, ,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,, ,,;,,,,, ,,,,,,, ,,,,(,,,;, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,, ,,, ,,,, ,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,;,,,,,,,,;,,,, ,,,,, ,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,;,,,; ;,,,,—,,,,,,, ;,,,,,,,,,(,,,,,,,,,,,，,,,,,,,,,;, ,, ,,, ;,,,,—,,,,,,, ;,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,;,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,,,(,,,;,,,, ,,, ,,,,, ,,, ;,,,,;,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,;,, ,,,, ,;,,,,,,, ,,,,, ,,,,,,,:,, ,,,, ,,, ,, ,,, ,,,,, ,,;,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,, ,,, ;,,,,,,,,, ,, ,,,,,,，,,, ,,,, ,,,,,, ,,, ;,,;,,,,,,,,, ,,,,, ;,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,, ,,,, ,,,, ,,, ,,,, ,, ,,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,，,, ,,,,;, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,— ,;,,,, ,,,,,,, ,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,:,,,, ,,, ,,,, ,, ,,,,, ,,;,,,,, ,,,,,(,, ,,,,,, ,,,,,,, ;,,,,,,,,, ,, ,,,,,,(,,, ,,, ,,,,,, —,,,, ,,,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, , ,, ,,,;,,,,,,,,,,; ,,,,,, ,, ,,,,,, ,(,, ,, ,, ,(,;,,,,,，,, ,, ,, ,,,,,,一;,,,,,(,, ,, ,, ,,,,,;,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,(,,，,,,,, ,,,,,,,—,,,,,,,, ,,,,,,,(,, ,,,, ,,,, ,,,,, ,, ,,,,,;,,,,;, ,,;,,,,(,,,;,,,, ,,,,,,, ,,,, ,，一;,,,,, ,,, ,,,, ,,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,;,,,,;, ,,;,,,,。,,,;,,,, ,澹簦鳎澹澹?,,, ,,,;,,,,, ,,, ,,, ,,, ,,,,,,, ,,,,,,,，,,:,,, ,,,,,;,,,,, ,,, ,,,;,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,;,,,,—,,,;,,,, ,,,, ,,, ,,,,,,,(,,, ,,,,, ,,, ,,,,,, ,,,,,;,,,,;,,,, ,,,,, ,,,,,—,,,;,,,,，,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,;,,,,,，,,,, ;,,,,,(,,,,,,, ,,,,,,,,,硕士学位论文 目录 目 录摘要 … ，,,,,,,,, ( ,, 目 录 ，，，第一章引言 ,, ,食物过敏 ，, , ,食物过敏概述 … ,, , ,食物过敏原的检测方法 ,, ,牛奶过敏 … ,, ,,牛奶中的主要过敏原 ,, , ,牛奶中的酪蛋，白(,,,,,,,…………… …………………一………(,, , ,牛奶中的乳清蛋白… ,, ,大豆过敏 ,, , ,大豆中的主要过敏原 ,, ,食物交叉过敏………(((………… … ,, ,研宄内容及意义 … … … ,第二章牛奶中酪蛋白的分离纯化 ,, ,材料与方法 … ,, , ,实验材料 … ,, , ,实验方法 … ,,, ,实验结果 ,,, , ,酪蛋白的分离纯化… , ,, , ,酪 蛋白备组分的纯度攫定 ,,, , ,浓度测定 … ,,, ,讨论 ,,, , ,酪蛋白的分离、纯化 … , , , , ,蛋白质鉴定以及浓度的鉴定 ,, , ,术章 ,, 第二三章大豆过敏原与牛奶酪蛋白的交叉反应研究 , ,, ,材料与方法 , , , , ,实验材料 , ,硕士学位论文 目录, , ,实验方法 ,,, ,实验结果 ,,, , ,蛋白质的在线比对结果 ,,, , ,间接,,，,,检测 ,,, , , ,,,,,,,—,,,,,, ,,验汪结果 ,,, ,讨论 ,,第四章研究结论 ,,参考文献 ,,综述 ,,, ,牛奶中的酪蛋,(;,,,,,, ,,, ,牛奶中的乳清蛋白 ,,致谢 ,,硕士学位论文 第一章引言 第一章引言 过敏反应是由法国生理学家;,,,,,, ,,,,,, ,,,;,,首先发现并且研究的，他也因此获得了,,,,年的诺贝尔生理学和医学奖…。过敏反应是一种免疫反应异常的表现，也称之为变态反应。这种反应能够引起人体组织的损害，导致多种疾病。按照产生机制的不同，大多数的学者习惯上把过敏反应分为四娄:，型(速发型过敏反应)、，，型(细胞毒性过敏反应)、，，，型(免疫复合物型过敏反应)、?型(迟发型过敏反应)。 ，型过敏反应是由,,,和嗜碱性粒细胞以及肥大细胞所介导的一类血管以及平滑肌反应，主要表现为过敏性的鼻炎和支气管哮喘以及荨麻疹，严重的甚至出现休克等症状:，，型过敏反应主要是一类由补体(,,,或,,,)所介导的细胞毒性反应或者由抗体所介导的不破坏靶细胞的细胞功能异常，主要表现为由溶血以及血小扳减少产生的一些症状:，，，型(免疫复合物型过敏反应)主要由补,,(，,,或，,,)或免疫复台物介导的组织的炎症反应(可咀产生类风湿性关节炎、血管炎以及红斑狼疮等症状:?型(迟发型过敏反应)则是由具有致敏性,细胞所介导的炎症和组织坏死(主要症状为接触性皮炎、以及结核病等口,。 ,食物过敏 ,食物过敏概述 食物过敏是一类具有复杂产生过程的变态反应性疾病，在临床上，食物过敏大多表现为,型变态反应，其最常见的临床症状为荨麻疹。食物过敏的发生的几率主要受年龄和饮食习惯的影响，例如，在成年人中食物过敏发生率约为, ,,，而在婴幼儿中其发生牢上升为,,,,。有研究显示，在英国和北美，受调查学龄儿奄中有超过,,的人对花生过敏口】。在美国，在,,,,到,,,,年的时问内，未成年人群巾，食物过敏的发，,率大约增长了,,,，而其中花生过敏的发生率从, ,,增至， ,,””。 一直以柬，牛奶过敏是【吐界各国研究者所关注的热点。有研究显示牛奶过敏人群，心过敏人群比例最高(如表，(,)。在丹麦，一项,,,岁的追踪调肖疆示，矗,,,,名婴幼儿,,，(订, ,,的罂幼,,,，，牛乳存在过敏反应(菇，,，，有,,,的患者表现为,,,介导的俩删“;任挪戚，一项类似的调查,，～示，赴,,,,名罂幼儿巾(,】,,，,,„,罂幼儿对卟乳存,二过艟现蒙，但是，大,;,,,分的过敏患者表现为非〔,,硕十学位论文 第一章引言介导的症状，”。 目前为止，中国还没有全国范围内的针对食物过敏的流行病学研究(只有部分数据显示，北京、广州等地居民存在食物过敏的比例大约为,(,—, ,,，并且表现出明显的地域性的饮食习惯影响。 鸡蛋 花生 坚果 ，，, , 甲壳粪水产动物 , 小麦和大豆 , 芝麻 , 总计 , 雌???如吣九” , ,食物过敏原的检测方法 , ,皮肤试验 皮肽试验是一种比较简便的检测方法，也是撮为常用的一种检测方法。但是其检测的结果受药物、测定时间、测定区域等因素的影响比较大，因而所得结果需要结合临床等因素判断患者对某种食物是 否存在过敏反应。此种方法较多的应用于婴幼儿巾，将待测定的物质注入到受试者的真皮层中，过敏原就会与肥火细胞表面的,,,发生特异性结合反应，进而使肥大细胞释放出组胺等活性物质，导致局部血管通透性增加，在皮肤表面出现,川等症状，风团的直径超过了阴性对照物,,,以,二则为阳性(风团的直径越火，表示对此种过敏原过敏的可能性越大。 , ,血液检测 酶标,,吸附实验平?酶联免疫吸附试验都可以用柬榆测忠肯,清,,,水、,酶标记吸,;付实验是川变联在阎相载体〔:的过域原与禽有特异性〔,,的样本作川(,】,】硕士学位论文 第一章引言 八用同位素标记过的抗人，,,，再使之与结合后的,,,作用，测定被结合的同位索的活性，待测样本中，,,的浓度与同位素的活性成正比，这种方法具有灵敏以及准确的优点，其应用范围也仅次于皮肤试验，其不足主要在于需要专门的仪器设备，并且同位素价格昂贵(极大的限制了其应用范围。 , ,食物激发试验 食物激发试验经过了几十年的不断发展(形成的对照激发试验成为了国际上诊断食物过敏的金，但是，出于这种方法存在一定的安全隐患，在临床实践中(许多医生以及研究者都不优先采用这种方法。除此之外(还包括简单的食物激发试验、排,;枭性试验等食物激发方法。, ,牛奶过敏 人类饮用牛奶存在几千年的历史了。世界各国对牛奶的消费量十分巨大(因此，牛奶也是,，起过敏的最常见的八大食物之一。牛奶是母乳最重要的替代品之一，因此它是人类最早接触到的过敏原之一，因而牛奶过敏是,岁内儿童食物过敏中塌为常见的一种，并起广泛的不良反应。研究显示,岁以下婴幼儿的牛奶过敏发生率约为,,,,,,】，一般患者中大部分会伴随着年龄增长而产生免疫耐受性，,岁及以上儿奄中其发生率仪为, ,,左右【,…。另一项研究显示，在德国，母乳喂养的婴幼儿中，牛奶过被的发生率仅为, ,,左右…,,”。 , ,牛奶中的王要过敏原 日,,,,已经发现，仃,,多种蛋白质与,二奶过敏相关，主要是酪蛋白(;,,,,,)和乳消蛋白(,,,, ,,,,,,,)，,,,;中醅蛋白包括,,,,—;,,,,,、，,,,,;,,,,,、,,,;,,,,,和,;,,,,,凹种，乳浦蛋白包括?一,,、,—,和,,,等。主要过敏原组分见表,—,，其„,?;,,,,,与,,,,是牛奶。,丰要的过域原，,,,,,,,，,,,,,,与其同事认为牛奶中船蛋〔,弓乳浦蛋白的比例关系叫能影,，，自牛奶的致敏性大小。 袁，(,牛奶中过敏原组分…,硕士学位论文 第一章引言, , ,牛奶中的酪蛋，;,(,,,,,,) 酪蛋白是牛奶中重要的过敏原，其过敏反应由，,,所介导。牛乳总蛋白中,,,,,,的含量占,,,，分为;,,,;,,,,,、,,,;,,,,,、和,—;,,,,,等类型。 , , ,?,,酪蛋，;,(;,,,,,, ,,,璐蛋白是动物奶中主要的酪蛋白之一，包括啦,(;,,,,,和魂,(;,,,,,两种，但是(在牛奶中没有发现,,,(;,,,,,的存在,,”。;,,,,;,,,,,是一类钙敏感蛋白，约占牛奶总酪蛋白的,,,。,,，,;,,,,,全,毛共由,,,个氨基酸残基组成，共有,个，,,抗原识别表位和,个，,,抗原识别袁位【,,,日前，己经通过圆二色谱以及拉曼光谱等方法对,,,,,;,,,,,的二级结构进行了研究，但是由于其在牛奶中以胶束的形式存在，无法形成晶体(使得,;,一;,,,,,的三级结构难以通过结晶或者核磁共振等方法获得。因此，目前其三级结构只是通过能量最低等原则推测得到的。 , , , ,,酪蛋，自(;,,,,,) ,一酪蛋白占牛奶 中总酪蛋白的,,,左右由一条全长,,,个残基的氨基酸单链栅成，,—;,,,,,单链上共有,个，,,特异陛抗原识别表位，,个，,,特异性抗原识别表位”“。,,,;,,,,,的疏水性较强，,一端具有带负电荷的氨基酸和磷酸化的丝氩睃嫂基(然而，其,,端的氩摧酸却没有带净电荷，这样就导致,,,;,,,,,在较低的温度下从酪蛋白胶束中释放出束,，。目前尚没有关于,,,;,,,,,的三维结构的报道，其,三维结构只是利用计算机技术模拟获得的, ,。 , , , ,一酪蛋,;,(;,,,,,, ,一酪蛋自足,:,,,蛋白中唯 个俞有精蛙却对凝乳酶被感，对钙不敏感的酪蛋，?，。”含艟,,，?,二奶中总融蛋白,,,左右，全长山,,,个氨基酸残肇构成。,链，(食竹,个，,,特异性抗原诎别表位和,个，,,特异性抗沮别表位四浦;,,,,,常,“会以通过:硫键结合而成,一二(聚体、四聚体、八聚体甚至是更高的形态存在。硕士学位论文 第一章引言,—;,,,,,比较容易在凝乳酶的作用下发生水解反应，其主要的断裂位置为,,,位,,,位的苯丙氨酸和甲硫氨酸之间。 , ,牛奶中 ,,、的乳清蛋白 乳清蛋白大约占牛奶中总蛋白含量的,,,左右，主要包括,—,—,,和,,,、免疫球蛋白以及乳铁蛋白等种类。小,,和,,,是乳清蛋白中比较重要的过敏原。乳清蛋白中含有人体所需的全部的必需氨基酸，并且其吸收性好，被广泛应用于食品的各个领域。 , , ,小乳白蛋白,小,,, ,乳自蛋自是溶菌酶家族成员(全长共有,,,个氨基酸残基(分子量为,, ,,,。?一】 ,,, ,克,大约占牛奶中总蛋白质的, ,,左右，每一升牛奶中大约含有,—; ？—,,对,,值或者盐的依赖小，一般不会发生交联，其等电点是,,,, ,四。在,—,,分子中，,个半胱氧酸形成了,个二硫键。?(,,不耐高温，高温能够使其致敏性有较大程度的减弱，但仍然可以诱发严重的过敏反应四。 , , , ,一乳球蛋白(,—,,) ,哥,球蛋白是乳清蛋白巾含量较高的一种蛋白成分。约占乳清总蛋白的,,,庄右，在乳清蛋白中具有重要的地位。研究发现，人奶中并不含有,—,,，因此把它认为是牛奶中堤主要的过敏蛋白，其全鹾共出,,,个氨基酸残基组成，其分予,,，存桃若,个一硫键，通常情况下，,(,以?硫键形成的二聚体的形式存在川。,—,卜要存在,个,,,特异性抗原表位雨， ,个,,,特异性抗原表位,”,。研究表,蚂，,一,,十,刈其它牛奶蛋白来说比较耐热，并且，这种过被蛋白司以通过母乳传递给婴儿，导致婴儿发生过敏反应口…。,—,蟹具有很好的起池以及乳化特性，咀及能够较好的与风,睐物质结合的特性，使其具有广泛的应用。 ,大豆过敏 大程;”寓古蛋白质、糖类以驶脂肪类化台物(祚食品工业的各个领域都有广泛的心川，,，,,,,，人,，成为了联合国公,,,,, ,火壬坚的敛敏食品之,,,。大豆过敞;叮以,,发过被性应炎和肖肠,酋功能的囊乱，严重的忠肯甚至可能导致过敏悱硕十学位论文 第一章引言休克和死亡【,,,。有研究显示，在婴幼儿中，大约存在, ,,,, ,,的受调查者对大豆过敏:并且随着大豆制品的应用越来越广泛，在成年人中，对大豆过敏的人群也越来越,,,,，。, , ,大豆中的主要过敏原 目前。通过过敏原在线数据库(,、,,(,,,,,,,,,,,,,, ,增)共查询到,,种大豆过敏原。其中有,,种过敏原来自于人工栽培的大豆品种(有,种过敏原来自于自然生长的大豆品种四。根据蛋白质的保守结构与其过敏活性相关等特点，将大豆过敏原蛋,,划分为五类:,,伴大豆球蛋白(,,,, ,)、,,,,,, , ,,、,,,, ,, ,,,、大豆球蛋白(,,,, ,)、胰蛋白酶抑制剂(,，),,,,)。 虽然在大豆中存在众多的过敏原蛋白，但是根据它们含量的多少以及致敏能 力的大小，,般认为,,, ,, ,,,、,,,,,, ,,,和,,,,,,,,,是大豆过敏原蛋白中晟主要的过敏原。 , , , ,，, , ,, ,,, ,,, , ,, ,,,是大豆中种承要的过敏原组分，是一种天冬酰胺糖蛋白。在大豆中，,,, , ,, ,,,以寡聚体的形式存在，单体全长共由,,,个氨基酸残挂构成，其等电点为,，,,,,,,, , ,,,,,,,等研究发现(,,,, ,, ,,,链上的糖基化位点是，,,特异性抗体结合的重要表位，他们发现去糖接化后(,,,, ,, ,,,蛋白的，,,特异性结.