药理学(微生物与生化药学)专业毕业论文 [精品论文] n-乙酰-d-葡萄糖胺-2-差向异构酶(gne)基因的克隆、表达及抗体制备

药理学(微生物与生化药学)专业毕业论文 [精品论文] n-乙酰-d-葡萄糖胺-2-差向异构酶(gne)基因的克隆、表达及抗体制备 药理学(微生物与生化药学)专业毕业论文 [精品论文] N-乙酰-D- 葡萄糖胺-2-差向异构酶(GNE)基因的克隆、表达及抗体制备 关键词:基因克隆 基因表达 抗体制备 GNE 摘要:目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到合成神经氨酸的原料N-乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、His-tag亲和纯化。 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR -乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a克隆出N 感受态转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c小鼠 2)、佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理盐水对照 2、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样组:3只雄性BALB/c小鼠 品与弗氏完全佐剂等体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100μl，每只小鼠约注入10μg蛋白。 2)、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂用不完全佐剂，用量同上。 量为初次免疫剂量的一半。 4)、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血 保存备用。 结果: 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测清，-20? OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和RNA污染。 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋白。 3、质粒构建、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达，SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因序列推测值一致。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp，测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一致。 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量为45KD。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫，因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90,以上。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 正文内容 目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到合成神经氨酸的原料N-乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、His-tag亲和纯化。 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a感受态转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c 、佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理盐水对照组:3只雄小鼠 2) 性BALB/c小鼠 2、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样品与弗氏完全佐剂等体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100μl，每只小鼠约注入10μg蛋白。 2)、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使用不完全佐剂，用量同上。 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂量为初次 、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20?免疫剂量的一半。 4) 保存备用。 结果: 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为RNA污染。 1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋白。 3、质粒构建、大肠杆菌 -PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因E.coliBL21(DE3)表达，SDS 序列推测值一致。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp，测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一致。 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量为45KD。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫，因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90,以上。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)- 抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到合成神经氨酸的原料N-乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、His-tag亲和纯化。 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a感受态转化，质粒抽提， 鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c小鼠 2)、佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理盐水对照组:3只雄性BALB/c小鼠 2、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样品与弗氏完全佐剂等体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100μl，每只小鼠约注入10μg蛋白。 2)、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使用不完全佐剂，用量同上。 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂量为初次免疫剂量的一半。 4)、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20?保存备用。 结果: 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和RNA污染。 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402 3、质粒构建、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达，个氨基酸组成的酶蛋白。 SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因序列推测值一致。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA1 定量检测。 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp，测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示致。 目的蛋白分子量为45KD。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫， ,以上。 4、因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到合成神经氨酸的原料N-乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、His-tag亲和纯化。 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a感受态转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c小鼠 2)、佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理盐水对照组:3只雄性BALB/c小鼠 2、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样品与弗氏完全佐剂等体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100μl，每只小鼠约注入10μg蛋白。 2)、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使用不完全佐剂，用量同上。 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂量为初次免疫剂量的一半。 4)、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20?保存备用。 结 果: 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和RNA污染。 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋白。 3、质粒构建、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达，SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因序列推测值一致。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp，测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一致。 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示 。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫，目的蛋白分子量为45KD 因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90,以上。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA1 定量检测。 目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄 -差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到糖胺-2 合成神经氨酸的原料N-乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、N His-tag亲和纯化。 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a感受态转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c小鼠 2)、佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理盐水对照组:3只雄性BALB/c小鼠 2、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样品与弗氏完全佐剂等体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100μl，每只小鼠约注入10μg蛋白。 2)、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使用不完全佐剂，用量同上。 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂量为初次免疫剂量的一半。 4)、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20?保存备用。 结果: 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和RNA污染。 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋白。 3、质粒构建、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达，SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因序列推测值一致。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA 定量检测。 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp，测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一致。 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量为45KD。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫，因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90,以上。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到 -乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出合成神经氨酸的原料N N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、His-tag亲和纯化。 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a感受态转化，质粒抽提， 转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3) Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c小鼠 2)、 3)、生理盐水对照组:3只雄性BALB/c佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 小鼠 2、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样品与弗氏完全佐剂等 μl，每只小鼠约注入10μg体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100 蛋白。 2)、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使用不完全佐剂，用量同上。 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂量为初次免疫剂量的一半。 4)、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20?保存备用。 结果: 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和RNA污染。 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋白。 3、质粒构建、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达，SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因序列推测值一致。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp，测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一致。 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量为45KD。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫，因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90,以上。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA 定量检测。 目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到合成神经氨酸的原料N-乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、His-tag亲和纯化。 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a感受态转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c小鼠 2)、佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理盐水对照组:3只雄性BALB/c 、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样品与弗氏完全佐剂等小鼠 2 体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100μl，每只小鼠约注入10μg蛋白。 2)、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使用不完全佐剂，用量同上。 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂量为初次免疫剂量的一半。 4)、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20?保存备用。 结 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测OD260=0.0346，OD280=0.0195，果: OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和RNA污染。 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402 3、质粒构建、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达，个氨基酸组成的酶蛋白。 SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因序列推测值一致。 4、 抗原分析:经过双向免疫扩散实验分双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp，测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一致。 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量为45KD。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫，因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90,以上。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到合成神经氨酸的原料N-乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、His-tag亲和纯化。 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a感受态转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c小鼠 2)、佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理盐水对照组:3只雄性BALB/c小鼠 2、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样品与弗氏完全佐剂等体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100μl，每只小鼠约注入10μg蛋白。 2)、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使用不完全佐剂，用量同上。 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂量为初次免疫剂量的一半。 4)、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20?保存备用。 结果: 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和RNA污染。 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋白。 3、质粒构建、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达， 4、SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因序列推测值一致。 双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp，定量检测。 测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一致。 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示 。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫，目的蛋白分子量为45KD 因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90,以上。 4、 抗原分析:经过双向免疫扩散实验分双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到合成神经氨酸的原料N-乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、His-tag亲和纯化。 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a感受态转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c小鼠 2)、佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理盐水对照组:3只雄性BALB/c小鼠 2、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样品与弗氏完全佐剂等体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100μl，每只小鼠约注入10μg蛋白。 2)、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使用不完全佐剂，用量同上。 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂量为初次免疫剂量的一半。 4)、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20?保存备用。 结果: 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测OD260=0.0346，OD280=0.0195， OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和RNA污染。 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋白。 3、质粒构建、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达，SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因序列推测值一致。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp，测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一致。 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量为45KD。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫， ,以上。 4、因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到 -乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出合成神经氨酸的原料N N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方His-tag亲和纯化。 法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a感受态转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 Fast Flow)，G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c小鼠 2)、佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理盐水对照组:3只雄性BALB/c小鼠 2、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样品与弗氏完全佐剂等体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100μl，每只小鼠约注入10μg蛋白。 2)、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使用不完全佐剂，用量同上。 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂量为初次免疫剂量的一半。 4)、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20?保存备用。 结果: 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和RNA污染。 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋白。 3、质粒构建、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达，SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因序列推测值一致。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp， 测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一致。 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量为45KD。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫，因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90,以上。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 目的: 1、由于酶法合成神经氨酸具有很大的优势，我们利用N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶(EC5.1.3.8)可以差向异构化N-乙酰-D-葡萄糖胺，从而得到合成神经氨酸的原料N-乙酰-D-甘露糖胺，故我们从猪肾中提取RNA从而克隆出-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，并在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达、N His-tag亲和纯化。 2、将纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。 方法: 1、我们首先从猪肾中提取总RNA，通过RT-PCR克隆出N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶基因，经测序，大肠杆菌E.coli DH5a感受态转化，质粒抽提，鉴定以及大肠杆菌BL21(DE3)转化表达，通过His-tag亲和纯化(Ni Sepharose6 G-25柱脱盐，SDS-PAGE电泳检测。 2、BALB/c小鼠多克隆抗体Fast Flow)， 的制备。 1、实验分组情况: 1)、实验组:3只雄性BALB/c小鼠 2)、佐剂对照组:3只雄性BALB/c小鼠 3)、生理盐水对照组:3只雄性BALB/c 、小鼠免疫方法: 1)、第一次免疫:将蛋白样品与弗氏完全佐剂等小鼠 2 体积混匀，分4点注射BALB/c小鼠背部皮下，总共100μl，每只小鼠约注入10μg 、第二次免疫:间隔2周进行二次免疫，使用不完全佐剂，用量同蛋白。 2) 上。 3)、第二次免疫后2周进行尾静脉加强免疫，剂量为初次免疫剂量的一半。 4)、加强免疫7d后，小鼠摘除眼球取血，析出血清，-20?保存备用。 结果: 1、抽提猪肾总RNA，紫外分光光度计检测OD260=0.0346，OD280=0.0195，OD260/OD280=1.77(介于1.7-2.2之间)，说明无明显的蛋白质和RNA污染。 2、设计引物，RT-PCR扩增目的片段，测序证明该基因的ORF为1206bp，编码402个氨基酸组成的酶蛋白。 3、质粒构建、大肠杆菌E.coliBL21(DE3)表达，SDS-PAGE显示，纯化蛋白为45KD的单一条带，与基因序列推测值一致。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 结论: 1、RT-PCR扩增目的基因，琼脂糖电泳检测大约为1206bp，测序与gene bank中的N-乙酰-D-葡萄糖胺-2-差向异构酶编码基因(D83766)一致。 2、质粒构建，大肠杆菌转化、表达，His-tag纯化，SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量为45KD。 3、BALB/c小鼠抗体制备:第三次尾静脉加强免疫，因为小鼠尾静脉非常细小，练习2个月后，尾静脉注射成功率达90,以上。 4、双向免疫扩散(Double immunodiffusion)-抗原分析:经过双向免疫扩散实验分析，抗体抗原同时稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16; Ag1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64)(未出现抗原抗体白色沉淀线)以及抗体稀释(Ab1:1、1:2、1:4、1:8、1:16)(出现抗原抗体白色沉淀线)，需进一步做ELISA定量检测。 《《《特别提醒》》》:正文内容由PDF文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 。如还不能显示，可以联系我q q 1627550258 ，提供原格式文档。 " 垐垯櫃 换烫梯葺铑? endstream endobj 2 x滌?`U '閩AZ 箾FTP 鈦 X飼?狛]P ?燚 \? 琯嫼b?袍*，甒?]颙嫯'??4)=r宵 ?i?]j彺帖B3锝檡骹>笪yLrQ#?0鯖l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛枒l壛>渓?@擗#?"? #?綫G刿# K芿${` ? ?7.耟? ~??Wa癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb皗E|?pDb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳$[Fb癳 $[Fb癳$[F?責鯻0橔C,f薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵 秾腵薍 秾腵% ? 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍 秾腵薍G??螪t俐猻覎? 烰:X=[勢} ) [趯飥 ? 媂^s劂 / x?矓w豒庘q?唙?鄰爖媧 \ㄤA|Q趗擓 蒚?緱^ ~鳝嗷P?笄nf( 鱂匧-叺9就菹$