卡波氏肉瘤相关病毒感染激活Jurkat细胞抗_HIV基因表达的研究

卡波氏肉瘤相关病毒感染激活Jurkat细胞抗_HIV基因表达的研究 Jurkat *-HIV 卡波氏肉瘤相关病毒感染激活 细胞抗 基因表达的研究 2 2 2 12,1?陈谭晓华 王小波 尹小菲 杨彬 磊 (1. 832002 ;石河子大学新疆地方与民族高发病省部共建教育部重点实验室,新疆石河子 2. 杭州师范大学医药卫生管理学院,浙江杭州 31003,6 Jurkat (Kaposis sarcoma-associated herpesv irus,KSHV) 摘要 目的,观察 细胞感染卡波氏肉瘤相关病毒 后细胞内几条主要’ 的抗 HIV 作用的基因,RANTES、APOBEC3G、APOBEC3F、MX1、MX2,表达情况。方法,首先用佛波酯,TPA,,20ng/ml,刺激 BCBL-1 72 KSHV KSHV RPMI-1640 Jurkat 24 35 细胞 小时,提取 病毒滤液。然后把含 滤液的 培养 细胞。小时后,分别在感染后第 、天收 RNAPCR KSHV -HIV: 集细胞,提取细胞总 ,通过实时定量 检测相关基因的表达情况。结果通过对 感染不同时期的细胞抗 Jurkat RANTES KSHV HIV-1 3 基因表达分析,结果显示,与未感染组相比,感染组的 细胞内的多条抗 基因表达上调。感染第 天, 上调 123 倍,APOBEC3G上调 3.12 倍,A POBEC3F上调 1.18 倍,MIX1 上调 2.75 倍,MIX2 上调 4.35 倍,感染第 5 天 RANTES11.91 2.72 2.22 KSHV Jurkat , MX1 , MIX2 : HIV 上调 倍上调 倍上调 倍。结论感染在一定程度上激活 细胞抗 相关基因的表达 。 HIV-1; BCBL-1; KSHV; HIV-1关键词,抗 中图分类号,Q75, Q786 文献标识码,A 文章编号:1673-6273(2010)05-828-04 Expressionof anti-HIV genein Jurkatcell with Kaposi's sarcoma-ssaociated herpes virusin fection* 12 2 2,1? CHENBi n, TAN Xiao-hua2ANG Xiao-Bo, YIN Xiao-fei, YANG LeiW, ( 1.Laboratoryof Xinjiang Endemic andE thnic Diseas,e Shihezi University832002, ShiheziChina; ,, 2.Medicine andH ealth ManagementIn stitute HangzhouN ormal University,310036,Hangzhou,China) Abstract Ojbective:To study thee xpression level of anti-HIV genesin KSHV (Kaposis sarcoma-associated herpesvirus) ’ infected Jurkat eclls. Methods: BCBL-1ce ll was beenst imulated by TPA (20ng/ml) 72 hours before havest KSHV vir ions solution. Jurkat eclls were culturedwit h PRMI-1640 contain KSHV virions. 24 hoursa fter infection, The mRNA quantity of somea nti-HIV genesin Jurkat cell infected with KSHV after 3 and 5 days werei nvestigated by using Real-Time PCR.R esults: After Jurkat ecll infected with ’ KSHV for 3 days, themRN A production of RANTES, APOBEC3G, APOBECMX3F,1, and MX2 increased 123, 3.12, 1.18, 2.75,4.36fol ds, respectively. In 5 daysa fter infection, RANTES,MX 1, and MX2 increased 11.91, 2.72 and 2.22time s, respectively. Conclusions: the expression of anti-HIV genes(RANTES,APOBEC3G,APOBEC3F,MX1,MX2) up-regulatedin KSHV infected Jurkat eclls. Key words: KSHVH; IV-1; BCBL-1; anti-HIV-1 Chinese Library Classification:Q75, Q786 Document code:A rticle ID:1673-6273(2010)05-828-04 AQRT-PCR KSHVHIV-1 检 测 上 述 抗 基因的表达情况来分析 前言 HIV AIDS 的对这些抗 表达的调控作用,研究结果有可能为 防 AIDS艾滋病,,的防治是医学界的难题之一,经过多年的 治提供新的思路。 -HIV 研究,科学工作者发现人体内有一系列的抗 基因的存在, 1 材料与方法 Rantesregulated uponactiv ationnormal T cell expressed主要有 ,, ands ecretedapobec3g(apolipoproetin B mRNA-editing catalytic 1.1 ,、材料 polypeptide-3G)apobec3f (a polipoproetin B mRNA-editing、 1.1.1 BCBL-1 Jurkat 细胞系 细胞,细胞由本实验室保存。catalytic polypeptide-3F) mx1 (myxovirus-resistant 1)mx2 1.1.2 RPMI-1640 HyClone 、、 试剂 培养液购自于 公司。胎牛血清 Gibco TPA (myxovirus-resistant 2)购自于 公司。购于碧云天生物技术研究所。逆转录 KSHV 。近年来科学家在研究 时,发现 KSHV ABGAB DNA 感染可以引起体内一些基因的表达的上调,而其中的一 试剂盒、实时定量试剂盒购于 生物科技公司。抽 HIV-1 BCBL-1 BIO BASIC ark DNA M些基因与 感染相关。本研究首先利用 细胞获取 提试剂盒,公司,,购于北京天根生物公 KSHV Jurkat PCR Appllied Biosystems )(BIO-RAD (病毒子,然后将病毒子直接感染 细 胞 , 通 过司。扩增仪公司,电泳仪 * : (2008C14G2150010)基金项目浙江省国际科技合作重点项目 作者简介,陈彬,1977-,,男,硕士研究生,研究方向,环境与基因E-m, ail: cb215209@sina.com ? 通讯作者,杨磊,E-ma: yange62@hznue.du.cnilli (收稿日期:2010-01-31接受日期 :2010-02-06) )PCR AB7300ddHO 至 25ul。反应条件,95?预变性 10s,95?变性 5s,60?Thermo 公 司 ,实 时 定 量 仪,,,高 速 离 心 机,公 2 - ??Ct 20s45 BIO-RAD 2 司,,紫外凝胶成像分析仪和图像分析软件,公司,, 退火延伸 ,共 循环。利用 法计算相对表达量。每个 3 Ct BIO-RAD 核酸蛋白测定仪,公司,。 样本同时做 个副孔,求平均 值。待测基因的引物如下 1 TAKARA 2ODPAGE 1.2 表 ,引物由 生物公司设计合成 ,,级,实验方法和步骤 1.2.1 BCBL-1 Jurkat 细胞培养 细胞、细胞均为悬浮细胞,用 2 结果 10% FBS PRMII-1640 375% CO 含 的 培 养 基 培 养 于 、温 箱 ,2 2.1 RNA 细胞总 提取与浓度测定 BCBL-1 3 细胞从液氮罐内取出复苏后连续培养 代,收集细胞 RNA RNA根据细胞总 提取试剂盒的方法,抽取细胞总 , 5TPA 3-510;Jurkat , ×用 刺激细胞浓度为 同样,细胞连续培养 PCR 1经检测浓度和纯度达到做实时定量 的,图 ,。 3 KSHV 代后收集细胞用于 感染。PCR 1 表 实时定量 的引物 1.2.2 KSHV (1) BCBL-1 病毒子提取 复苏液氮中保存的 细 Tab.1 QRT-PCRof prmers i 37?10ml 10%胞。水浴中迅速融化细胞保,并加入 含有 胎牛血 gene primer 基 因 引 物 RPMI-1640 37?,CO2 5 清的 培养基中轻轻吹打均匀,置 ,培 (2) 24 养 培 养 。 小 时 后更换新的培养基以去除二甲亚砜 F: 5- ACCAGTGGCAAGTGCTCCAAC- ’RANTES ,DMSO,,1000rp m, 离 心 5mn,弃上清,细胞沉 淀 用 新 的i3 ’ R: 5- CTCCCAAGCTAGGACAAGAGCAA-G ’RPMI-1640 培养基悬浮,置于新的培养瓶中培养。当细胞生长 3 ’APOBEC3F 12 (3) 3 3 密度较大时,按 ,半换液传代,继续培养 代。当第 代 F: 5-GTCGCCTTCTGCCTTGGT- AAAA’5210-3 ××时,进行细胞计数,当每培养瓶中细胞浓度达到 3R: 5-’ ’APOBEC3g 5 10ces/m 时,离心更换新的培养基并加入终浓度为20n g/mllllTCCGACCATAGGCTTTGCGTA- 3’ F: 5-CCGTGGCCTGTGCTCTTC- AAA’TPA72h 的 ,培养 。3 ’MX1 (4) TPA 24h 离心,更换新的不含 的培养基继续培养 后,收集 R: 5-TTGGCTGTGCTCTCTGTCCTC- AAA’10ml60?细胞 ,在液氮与 水浴中反复几次冷热交替刺激,使细 3 ’MX2 4?16000rpm2hKSHV 胞膜破碎。,,离心 ,取上清液,含有 病F: 5-TCCGCTCCGCCGGTTCC- AAAAAA’3[1] ’ 毒,,存于 -80?备用。R: 5-GATTTGCTGTTTCACGATTGTCTCA- ’GAPDH 1.2.3 KSHV Jurkat Jurkat 感 染 细 胞 当 传 至 第 四 代 时 , 3F: 5-’ ’1200rpm10min,离心 ,弃上清收集细胞。离心过程中,取出 GGTCTCCGGGCGCGC-3AAAAAAAAAA’ PCR 2.2 -HIV 测定抗 基因的表达 实时定量 -80?5ml60?1640 保存的病毒滤液 ,于 水浴迅速晃动融化。按 R: 5-TGGGTTCCGCCCCTTC- AAAA’ 3 ’ KSHV 感染使 Jurkat细 胞 RANTES表达显著增加 ,在第 3=15 1640 1ml 5ml 培养基,病毒滤液 ,的比例,取 培养基与 病 F: 5-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC- ’123 11.9 POBEC3G5 A天时上调了 倍,第 天时上调了 倍。、 Jurkat 6ml 毒滤液混合均匀。每瓶 细胞沉淀上述混合液 悬浮, 3’ APOBEC3FMX1MX2 KSHV、、基因的表达水平亦明显增加。 2ml 在放有灭菌盖玻片的六孔板中每孔加 病毒滤液,共可感染R: 5-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT- ’ 感染第三天时四条基因表达3都出现了不同程度的上调,其中 ’3 ?5,CO24h 37孔,、,培养 。2 APOBE3GMX1 3.12 MX2 、和 上调最为明显,分别上调了 倍、 1.2.4 KSHV Jurkat Jurkat 2 6 感染 后的 培养 设计 组 细胞于 2.75 4.35 KSHV MX1 MX2 倍和 倍。在 感染第五天时,和 基因 1.2.KSHV 3d5d 孔板中继续培养。正常组,感染组。经 ,后各收 2.72 2.22 表达仍然上调,分别为 倍和 倍,其它二条基因基本回 1 2 RNA取 批次 组细胞,收取的细胞分别提取细胞总 。 2)(落到正常水平,这可能与病毒的潜伏感染相关见图 。 1.2.5 Jurkat RNA RNA 细胞总 提取与浓度测定 按细胞总 抽 RNA -80?, 提试剂盒的操作说明进行,抽提得 保存于 并用核 RNA 酸蛋白仪测定 浓度。 1.2.6 PCR ABGAB 逆转录 根据 生物公司的反转录试剂盒说 Template RNA 2ul , 250uM randomhe xamer明操作,第一步为, primer 1ul 加 ddHO(DNase\RNase Free)10ul 13ul 使总体积为 2 RNA-Primer MixRNA-Primer Mix 13ul5×RT,,第二, 步 为 ,, Reaction Buffer 5ul, 25U/ul RNase Inh ibitor,25mM dNTP 1ul, M-MLV RTase(RNasHe- ) 1ul, ddHO (DNase\RNase Free)25ul 。 2 37?60min, 85? 5min-80?置 然后 。可长期保存。 1.2.7 PCR -HIV 实 时 定 量 测 定 抗 相 关 基 因 的 表 达 使 用 ABI7300 PCR cDNA仪,用适宜浓度的样本 ,作为实时定量 标 10 5 准品,依次稀释 倍,共 个梯度用于制作曲线以实验组 cDNA 和对照组总 为模版, 按照实时定量试剂盒说明书操 25: 2 SYBR Premx Ex Taq 12.5ulμl×i作 , 反 应 体 积 ,1 RNA 图 细胞胞总 电泳检测 cDNA Fig.1 Electrophoresis detection of RNA 2ul,10uM ForwarPdr imer 0.5ul, 10uM ReverseP rimer 0.5ul,加 RANTES RANTES HIV-1 为 与 感染有关。 通过两种机 制 来 HIV : 抑制 的复制一方面通过空间位阻效应阻断病毒包装蛋 CCR5(gp120)CCR5 白与 的结合,另一方面通过下调细胞表面 CCR5 的表达,即阻断 内吞之后的再循环。研究认为,后者可能 在抑制作用的发挥中占有更为重要的地位。 APOBEC3G ( apolipoproetin B mRNA-editing catalytic polypeptide-3G) B mRNA 3G, 即载脂蛋白 编辑酶催化样蛋白 A3GAPBEC3F (a polipoproetin B mRNA-editing catalytic 简称 , polypeptide-3F) B mRNA 3F, 即载脂蛋白 编辑酶催化样蛋白 简 A3F,APOBEC HIV 称 它们是 家族成员,在体内最重要的抗 感 HIV d C d U, ,染分子。它们在 负链合成过程中催化 脱氨基成 [7-9]G?A ,HIV 导致病毒基因组 超突变从而抑制 复制。 MX 基 因 由 于 能 抵 抗 黏 液 病 毒 而 命 名 为 [10]MX (myxovirus-resistant),基因即抗黏液病毒基因。 MX GTP dynamin), ( 蛋白属于大 酶的动态蛋白超家族在 ?( IFN); MX ,体内由型干扰素诱导具有广谱的抗病毒能力对 11, ,RNA ,DNA 许多 病毒甚至对 病毒都有一定的作用。人类细 ?IFN MX ,MX 胞用型 处理会产生两 蛋白研究表明 蛋白具有 [12, 13]重要的抗汉坦病毒作用。 Jurkat KSHV 本研究发现 细胞在 感染的初期可引起细胞 RANTESAAPOBEC3GAPOBEC3FCX1X22 BMDM图 ,,、,,、,,、,,、 RANTES 内抗病毒基因表达明显上调,特别是 基因表现最为 Jurkat KSHV3d5d Jurkat E,,基因在 细胞感染 、后及正常 细胞中的相 5 明显,天后由于感染的持续,病毒开始进入潜伏感染阶段,而 Fig.2 Relative expression levels of RANTESA, APOBEC3G对表达水平 ,,A3GA3FMX2 使得其表达明显的下调。同样的现象也发生在 、、B, APOBEC3FC, MX1and MX2Egene among Jurkat cell D,,,,,,,, 基因上,只是表达变化的幅度有所不同。由实验结果可以发现with KSHV 感染可以在一定条件下激活体内抗病毒基因的表达,然 KSHV infected after 3d, 5d and noraml Jurkat cell HIV 而这些抗 基因通过各自的作用途径发挥着内源的抗病毒 KSHV HIV 作用,这一结果提示了 有潜在的抗 活性。本研究发 3 讨论 3 5 现在感染的第 天这些基因的表达水平均高于第 天的表达 水平。在感染初期,多数病毒基因是处于活性表达阶段,随后随 KSHV HIV 很多的研究表明 可能抑制 感染。一些早期流 着潜伏感染的建立,仅保留少数病毒基因表达。这一结果提示, KS AIDS 行病学研究曾发现并发 的 患者比并发其他疾病的存 [2]KSHV HIV 病毒一些裂解期表 机体抗 基因表达可能更多的受 KSHV HIV 活时间更长。随后的研究发现 和 两种病毒感染的 KSHV 达基因的调控。提示后续的研究将主要集中探讨 裂解 先后顺序不同,对疾病的进展有 完全不同的影响 。先 感 染 HIV 期表达基因在激活抗 中的作用。 KSHV AIDS-KS HIV 者 发 生 的 时 间 比 先 感 染 者 发 生 [3] 根据流行病调查数据和现有的研究进展结合本研究可发 AIDS-KS 的时间晚 4 年多。2007 年,CherquiS [4]等研究发现 现 KSHV 感染确实可以上调一些抗 HIV 基因的表达,提示 KSHV vMIP-II HUVEC APOBEC3G 基因转染 细胞可以促进 , KSHV HIV 的基因组中存在有激活某些抗 基因表达的因素,或 RANTES以 及 OAS-1,-2,-3等 多 条 ARGs (AIDS Resistance HIV 存在抑制 基因表达的作用元件存在。总之,可以初步判断 Genes)KSHV 表达增加。这些研究结果提示 感染可能通过上调 KSHV HIV 出 感染可以激活一些抗 基因的表达上调,使机体HIV AIDS 机体抗 基因表达发挥抗 的作用,为此本项目研究了 发挥内源的抗病毒的作用,在复制、增殖、吸附、入侵等多环节 KSHV RANTESAPOBEC3GAPOBEC3FMX1MX2 感 染 对 、、,, 抑制病毒,其明确的作用机制还需要更一步的研究,本研究为 HIV 等重要抗 基因的表达水平的影响。 KSHV HIV 进一步的探讨 抗 的特性提供了实验依据。RANTESregulated uponact ivationnormal T cell expressed ,, 参考文献(References)and secretedCCT ,即正常 细胞表达分泌的调节活化蛋白,属 [1] Lagunoff M, Bechtel J, VenetsanakosE, et al. De novoi nfection and CCR5家族成员,主要受体为 ,具有强烈调节多种免疫细胞功 serial transmission of Kaposis sarcoma-associated herpesvirus ’RANTES HIV能,在病毒感染的免疫应答中也起关键作用。在 in culturede ndothelial cells[J]. J Virol, 2002,76(5 ):2440-2448. [5]+ Cocchi 1995 T ,CD8病毒复制过程中的多种效应 等在 年报道[2] Dawson D , Hardy A. AIDS knowledge and a ttitudes of Hispanic RANTES 1997 HIV 细胞释放的 在体外可抑制 病毒的复制。年 Americans. Provisional dataf rom the 1988N ational Health Interview [6]Scarlatti CCR5 ,RANTES 等又发现的趋化性细胞因子受体 是 Survey.A dv Data, 1989A pr 11;(166):1-22. HIV-1 , 初级病毒株感染细胞的主要协同受体因而受到广泛的JacobsonL , Jenkins, eatl . Interaction of human immunodfeiciency [3] 重视。RANTES 能够在一定程度上抑制 HIV 感染,目前一致认virus type 1 and human rhpeesvirus type8 infections on the incidence of Kaposi's sarcoma. IJ nfect Dis, 2000, 181(6):1940 -1949. Genomics, 2002, 79(3):285 -296. [9] [4] Cherqui S,K ingdon, et al. Lentiviral gene dlievery of vMIP-II to Reuben SH, B ishop KN, Sheehy AM , et al. 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