【doc】酶法水解酪朊酸钠工艺的研究

【doc】酶法水解酪朊酸钠工艺的研究 酶法水解酪朊酸钠工艺的研究 工艺技术 一工艺一 (华南理工大学食品与生物学院,广州510640) (浙江省宁波市鄞州自来水有限责任公司,宁波315192) 摘要:利用酪朊酸钠酶法水解制备营养性酪蛋白小分子肽,对其 酶制剂的筛选,酶水解工艺参数,小分子肽得率变化及酶 解液溶解性进行了系统的研究,得出结论:碱性蛋白酶水 解酪朊酸钠的效果较好,并通过正交实验确定了碱性蛋 白酶酶解酪朊酸钠的最适宜条件为温度60~C,pH7.5,酶 解时间24h,底物浓度10%,碱性蛋白酶和底物之比4.8X 103AU/g. 关键词:酪朊酸钠,酶法水解,工艺 Abstract:Thetechnologyofenzymatichydrolysisofcasein shortpeptideswasstudiedTheselectionof protease.theoptimumhydrolysisparametersof protease.theanalysisofshortpeptides percentageandthesolubilitychangesof hydrolysisproteinweresystematicallytested Conclusionwasasfollows:theeffectofalcalase wasbetter;theoptimalhydrolysistechnologyof alcalaseturnedtobe:hydrolysistemperature6O?. pH7.5,hydrolysistime24hourssubstrate concentration5%.『E1/『S1-4.8x10U/g Kevwords:sodiumcaseinate:enzymatichydrolysis;technology 中图分类号:TS201-2+5文献标识码:A 文章编号:10o2—0306(2004)03—0089—03 生物活性肽的生产主要有合成和蛋白质体外水 解两种方法.合成法虽然可按人们的意愿合成任意 的活性肽,但目前因为成本高,副反应多及残留化合 物等问题,没有很好的发展.体外水解蛋白制备肽有 酸水解,碱水解及酶法水解,前二者方法简单易操 作,但可能存在营养和毒理方面有害的效应,因此, 在食品加工中的应用受到了极大的限制.蛋白质的 酶法水解一般不会导致营养的损失,也不会产生毒 理上的问题.同时,酶作用可在温和条件下进行,能 耗低,所以应用l:l~ge广泛. 本研究是通过酶法水解酪朊酸钠来制备小分子肽, 通过筛选蛋白酶,优化酶解条件而提高小分子肽的得率. 1材料与方法 1.1材料与仪器 碱性蛋白酶,中性蛋白酶丹麦诺维信公司生 产;酪朊酸钠蛋白质含量为86.23%,新西兰;三氯 乙酸分析纯,上海试剂三厂;氢氧化钠汕头市光 收稿日期:2o03—07—28 作者简介:赵亚丽(1976一),女,硕士研究生,研究方向:食品科学. 赵亚丽赵谋明 刘颖栋 华化学厂;浓盐酸,浓硫酸分析纯,广州市东红化 学厂;硼酸分析纯,汕头市光华化学厂;甲醛分 析纯,广州化学试剂厂. PHS-25数显pH计上海精密科学仪器有限公司; CU600型电热恒温水箱上海福玛实验设备有限公司; JB200-D型强力搅拌机上海标本模型厂制造;KDN一 2C型定氮仪上海纤检仪器有限公司;JA10o3分析天平 上海天平仪器厂;ID4_2A离心机北京医用离心机厂; JYrr-5架盘药物天平北京医用激光仪器厂. 1_2实验方法 1.2.1酪朊酸钠的酶解酪朊酸钠溶液一加蛋白酶一搅 拌酶解一取样一灭酶一保存样品一待测 1.2.2参数的测定 1.2.2.1蛋白回收率(NR)的测定采用文献【1】中的 方法. 1.2.2.2氨基氮的测定参考ZBX66014—87.所得的 氨基酸含量再换算成酪朊酸钠中蛋白质的百分含 量,即为氨基氮含量,数据见图表. 1.2.2_3小分子肽的测定称取约10g酪朊酸钠水 解液,加20%的三氯乙酸(TCA)约10mL,静置 30min,然后离心,弃除沉淀,用凯氏定氮法测定上清 液中蛋白质含量,然后换算成酪朊酸钠中蛋白质的 百分含量,再减去氨基氮含量,即为小分子肽含量, 数据见图表. 2结果与分析 2.1碱性蛋白酶对酪朊酸钠的酶解 2.1.1温度对碱性蛋白酶酶解酪朊酸钠效果的影响 图1,图3是在加酶量【E】/【S】:4.8x10.AU/g,底物浓 度约为10%,pH为6.5(原始pH)时,参考碱性蛋白酶 的最适作用条件,分别在50,55,60?酶解时所得的数 据.可以看出,60?时,小分子肽的含量相对较高. 2.1.2加酶量对碱性蛋白酶酶解酪朊酸钠效果的影 响从图4,图6可以看出,随着加酶量的增加,小分 子肽含量也增加,即酶解效果越好,在加酶量为0.2% 时,fllI[E]/[S]=4.8x10AU/g时酶解效果最好.在本实 验中,为了考虑成本,我们选定【E】/『S】=4.8x10AU/g. 2.1_3底物浓度对碱性蛋白酶酶解酪朊酸钠效果的 时间(h) 图l不同温度时酶解时间与蛋白回收率的关系 一 一 皿皿I 抽 , ? 时间(h) 图2不同温度时酶解时间与小分子肽含量的关系 一8 7.5 7 m6.5 6 忸5.5 5 蒜5 时间(h) 图3不同温度时酶解时间与氨基氮含量的关系 时I司(h) 图460?时酶解时间与蛋白回收率的关系 影响表1是在其它条件相同,底物浓度不同时,碱 性蛋白酶酶解酪朊酸钠1lh所得的数据.可以看出, 随着底物浓度的增加,酶解效果变差,但参数变化不 是很大.底物浓度小时欠经济图7,图9是我们参考碱性蛋白酶的使用量,选 定中性蛋白酶与底物之比为300AU/g.可以看出,在 45?时,中性蛋白酶的酶解效果比较好.Shi-JunGe 等对木瓜蛋白酶,复合蛋白酶,碱性蛋白酶,中性蛋 白酶进行了筛选实验,它们酶法水解得到小分子肽 的能力依次为碱性蛋白酶>中性蛋白酶>复合蛋白 酶>木瓜蛋白酶.从上面的曲线可以看出,中性蛋 白酶酶解酪朊酸钠时,偶尔有小分子肽含量高于碱 性蛋白酶的时候,但从整体上,碱性蛋白酶酶解酪朊 酸钠比较容易,小分子肽含量相对较高.所以我们认 为,碱性蛋白酶的酶解效果比中性蛋白酶好. 2.3碱性蛋白酶的正交实验 我们以小分子肽含量为衡量,设计四因素 三水平k(33正交实验,这些实验结果是在[E]/[s]= 4.8×10AU/g的条件下得到的. 一80 75 70 65 60 5 . 5 时间(h) 图7不同温度时酶解时间与蛋白回收率的关系 鲫加?如? 一一褂叵皿嘲 鲫加?如? 一一斛回皿嘲 工艺技术 表2实验结果 一55 50 45 莲45030 25 20 15 时间(h) 图8不同温度时酶解时间与小分子肽含量的关系 8.5 8 7 6.5 6 时间(h) 图9不同温度时酶解时间与氨基氮含量的关系 表3实验分析 从表2,表3可以看出,实验9效果比较好;从计 算极差来看,B的极差最大,说明因素B对实验结果 影响比较大,因而是主要因素.C,D因素的极差较 小,是次要因素,它们对实验的影响大小顺序为B> A>C>D.通过比较可确定各因素的最优水平为 ABCD.,其中C,D为不显着因素,可根据实际情况 确定其水平,所以最优组合为A,B,C:D,. 3结论与分析 3.1分别采用碱性蛋白酶和中性蛋白酶酶解酪朊酸 钠,前者蛋白质回收率最高,为77.306%,小分子肽含量 最高,为60.446%;而后者分别为74.455%和43.223%. 说明碱性蛋白酶对底物的肽键选择性大,作用肽键多, 所以,选择碱性蛋白酶为酶解酪朊酸钠的作用酶. 3.2蛋白质回收率是指酶解产物的蛋白含量与酶解 前底物的总蛋白含量的比值.从前面的曲线可见,随 着酶解时间的增加,蛋白质回收率和小分子肽含量 也增加,这是因为随着水解的进行,酪蛋白的肽链逐 渐被切成大小不等的片段,小分子肽含量越高,说明 短肽段的含量越高.但随着时间的延长,其增加趋于 平缓,这可能是酶受抑制的原因[31.而未经水解的酪 朊酸钠的溶解度很低,只有5%左右,而水解后酪朊 酸钠的溶解度大大增加,而且在水解程度较高时,酪 朊酸钠的溶解度在相当宽的pH范围(6,10)实际上 不再受pH的影响. 3.3氨基氮含量反应蛋白水解物中游离氨基酸的相 对含量.从前面曲线可看出,随着水解时间的延长, 酶解液的氨基氮含量增加,在水解初期,蛋白酶对酪 蛋白有较多的切割位点,酶解液中氨基氮含量增加 较快,随着水解反应的进行,切割位点减少,氨基氮 含量增加趋势平缓. 3.4由正交实验我们得出主次因素,并确定最优水 平,所以碱性内切蛋白酶酶解酪朊酸钠的最适宜工 艺条件为温度60?,pH7.5,时间24h,底物浓度 10%,碱性蛋白酶与底物之比为4.8x10,AU/g. 3.5从实验来看,利用碱性蛋白酶酶解酪朊酸钠获 得理想的小分子肽混合物是可行的.在接下来的实验 中,我们将对制备的小分子肽的生理功能进行研究. 参考文献: 【1】MICHELL,JACQUESF,MICHELP,eta1.Proteinrecovel”y. fromvealbonesbyenzymatichydrolysis[J].FoodScience,1995, 60(5):949-958. 【2】Shi—JunGe.Continuousproductionofhighdegreecasein hydmlysatesbyimmobilizedproteasesincolumnreactor【J1. Bioteehnology,1996(50):161,170. 【3】GGbirch,KJParker.Enzymesandfoodprocessing 【M】.AppliedSciencePublishersLtd.,1981.