八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导肺动脉内皮细胞凋亡的抑制作用

八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导肺动脉内皮细胞凋亡的抑制作用 八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导肺动脉内皮 细胞凋亡的抑制作用 ? 724?Chi…CriticalCareMedicine,December2001.Vo】i3.No】2 ? 论着? 八肽胆囊收缩素对脂多糖诱导肺动脉内皮细胞凋亡的抑制作用 谷振勇,凌亦凌,王杏云.丛斌,朱铁年 fI.河北压科大学病理生理教研室,河北石家庄050017i2.河北医科大学附属四院.河北石家庄050011) 摘要:目的:探讨八肤胆囊收缩素(CCK一8)对脂多糖(LPS)诱导培养的肺动脉内皮细咆(BPAEC)凋亡的 影啊方法:培养的BPAEC用LPS,CCK一8,CCK一8非特异性受体阻断剂丙答胺分别或共同处理后,继续培 养24小时用流式细胞术和核荧光染色方法检删细胞凋亡,用生物化学方法检测培养上清中乳酸脱氢酶 fIDH)活性和甫二醛(MDA)含量,用流式细胞术定量检测过氧亚硝基阴离子(ONO0)含量.结果:LPS可诱 导BPAEC堋亡和坏死明显增多,培养上清中MDA含量增高:CCK一8抑制BPAEC硝亡和MDA含量的增 高.此作用为CCK一8受体非特异性阻断剂丙答胺翻转;CCK一8 可抑制LPS诱导BPAEC生成ONO0增多{ CCK一8和阿各胺对LPS诱导的BPAEC坏死无明显影响.结论;CCK 一8可抑制LPS诱导的BPAEC凋亡,此 作用由其受体介导,并与CCK一8的抗氧化功能有关 关键词:八肽胆囊收缩素;内皮细咆;肺动脉;细胞凋亡 中图分类号;Q255iQ343.6文献标识码:A文章编 号;10O3—0603(2001)12—0724—04 Inhibitoryeffectofcholecystokininoetapeptideonlipopolysaccharide—ind ucedapoptos~ofpulmonaryartery endothelialcellsGUZhen—yong,LINGYi—ling,14?ANGXing—yun,CO NGBin,ZHUTie—ni? . „DepartmentofPatkophysiology—HebeiMedicalUm?versity,ShijiazhuangHebei050017 Abstract:Objective1Toinvestigatetheeffectchokyst0bninoctapepti(CCK一8)0nlipopolysae charide(LPS)inducedapoptosisofculturedpulmonaryarteryendothelialceils(BPAEC)Methods:BPAEC werechallengedwithLPS,CCK一 8.pro)glumideandvehicle.respectively.Thenthecellscontinuedtobecul turedfor24hours.Thecellularapoptosiswasanalyzedbyflowcytometerandf luorecentstain—andthecontent ofmalondizldehyde(MDA)andlactatedehydrogenase(LDH)activityweremeasuredbybiochemicalmethods. ThecellularnecrosiswasexpressedbyLDHactivityinsupernatant.Theendot derivedperoxynitrJte helial— (ONOO).astrongoxidantresultedfromthereactionofnitricoxideandsuperoxide—wasmeasuredbytheas- sayofONOOmarkermoleculenitrotyrosine(NT)withflowcy~ometer.Results:LPScouldsignificantlyin- duceincreasedapoptosisandnecrosisinBPAEC,andelevateMDAcontentsinsupernatant.CCK一8reversed LPS—inducedincreaseinapoptosisandMDAcontents,howevertheseeffectswereabolishedbyproglumide,a non—specificantagonistoiCCK一8receptors.Incontrast,CCK一 8andproglumidehadminimaleffectonLPS — inducedLDHactivity.indicatingthattherex&rasnosignificantchangeofnecrosisinBPAEC.CCK一8inhibited LPS—inducedONO0generationinBPAEC.Conclusions:LPS—induceda poptosisofBPAECcouldbeinhibit- edbyCCK8一 anditmightbemediatedbyitsreceptors,Anti—oxidationactivityoiCCK一 8mightalsoplaya role. Keywords:ch.lecystokininoctapeptide;endothelialcell;pulmonaryrtery; 日p.pt.sis 0603(20 CLCnumber:Q255{Q343,6DocumentLode:AArticalID}1003—01)12—0724—04 细胞凋亡是细胞在基因调控下发生的有序性生 理死亡,氧化应激可以诱导多种细胞凋亡.业已公 认,细胞凋亡失控是炎症,肿瘤等多种病理过程的重 要发病因素在急性肺损伤发病中,肺内皮细胞凋亡 增多..:.肺内一氧化氮(No)及其强氧化性衍生物过 基金珂目:国家自然科学基盘资助项目 (No398703】7.No.39570304) 怍者简舟:各振勇(1963一),男(汉族1,河北省巨鹿县凡.医学博 士,教授事呼吸生理和病理生理研究.藏得河北省科技进步一等 犍1项.垃50泉篇 氧亚硝基阴离子(ONOO)生成均明显增多.?”,提 示氧化应激引起的肺血管内皮细胞凋亡在急性肺损 伤的发生中可能起重要作用.我们的研究发现,脑肠 肽八肽胆囊收缩素(CCK一8)可提高血液超氧化物 歧化酶(SOD)活性,降低脂质过氧化产物丙二醛 (MDA)的含量,发挥抗氧化和抗内毒素休克的效 应,直接对抗内毒素或肿瘤坏死因子(TNF)对 离体肺动脉内皮功能的抑制作用”.CCK一8是否 通过减少内皮细胞凋亡而发挥保护作用迄今尚无报 道.本实验在培养的小牛肺动脉内皮细胞(BPAEC) 黛簸};i 崮危重痣急救医学2001年12月第13卷第12期 水平上观察了CCK一8对内毒素主要成分脂多糖 (LPS)诱导的肺动脉内皮细胞凋亡和ONOO一生成 的影响.探讨CCK一8的保护作用及其机制 1材料与方法 1.1试剂:脂多糖(LPS),CCK一8,丙各胺(Pro), 澳化乙啶(EB),胶原酶?型均为Sigma产品;RPMI 1640为Gibco产品;MDA试剂盒和乳酸脱氢酶 (IDH)试剂盒分别购自南京建成公司和北京中生 公司;羊抗小鼠FITC标记的多克隆抗体(Sigma产 品),小鼠抗硝基酪氨酸单克隆抗体(Cayman产 品),免抗人?因子相关抗原抗体(Zeyman产品), 羊抗免FITC标记抗体(JacksonImmunoReserch Lab产品). 1.2BPAEC的培养:新生牛放血处死,快速摘取 肺动脉.胶原酶消化法分离BPAEC,用RPMI1640 完全培养基(含1oH小牛血清,500kU/L青霉素, 500mg/L链霉素)培养细胞用免疫细胞化学法检 测细胞?因子相关抗原阳性和倒置显微镜下细胞呈 鹅卵石样排列鉴定细胞.第3,6代细胞用于实验. 随机分为4组:LPS组,LPS+CCK一8组,LPS+ CCK一8+Pro组和对照组,每组细胞分3份,分别加 入相应成分,其中LPS5mg/L,CCK一81mg/L, Pro2mg/L,对照组加等容积无热源生理盐水,继 续培养24小时,收集细胞和上清备检. l3BPAEC凋亡的检测: 1.3.1BPAEC凋亡的流式细胞:BPAEC用 预冷的7O乙醇固定,荧光染色前,用生理盐水洗 涤1次,将细胞调至10个,加入终浓度为1omg/L 的EB荧光分子染液,于4C孵育3o分钟,随即上 FACS一420型流式细胞仪(Becton—Dickinson)进 行检测仪器条件为2W氩离子激光源,输出功率 300mW,激发波长488nm,发射波长605nm,检测 数据输入HP一300Consort30型计算机,应用相应 软件进行处理,并打印DNA组方图和双参数二维 图.测定前以鸡血红细胞调整仪器的变异系数 ((),使之<j. 1.3.2BPAEC凋亡的核荧光形态学变化:BPAEC 荧光染色方法同前.将细胞悬液滴加于载玻片上,盖 玻片封片后,在UFX一?型荧光显微镜(Nikon)下 观察BPAEC凋亡情况. 1.4BPAEC坏死的检测:用细胞释放入培养上清 中的LDH活性表示细胞坏死量的变化.LDH活性 用TechniconRA—i000型自动生化分析仪(美国 Byer)零级速率法检测,LDH单位为U/L. ?725? 1.5培养上清MDA含量检测:用硫代巴比妥酸 (TBA)比色法橙测培养上清MDA含量,严格按照 说明书步骤操作,MDA单位为ffmol/I. 1.6内源性ONOO一生成的定量分析:我们曾用流 式细胞术定量分析ONO0一的标志物硝基酪氨酸 (NT)含量方法证实,oN()()一的生成量NT荧光 强度表示,IPS可剂量依赖性地诱导BPAEC生成 ONOO一增多.本实验观察CCK一8对LPS诱导 BPAEC生成ONOO的影响.具体方法见文献[8], ONO0一的生成量以NT荧光强度表示 1.7外源性ONOO一的紫外吸光度检测;0N()(J 的合成参照酸化过氧化氢与亚硝酸钠反应方法”进 行.合成的ONOO在波长302Plm有最大吸收峰. 而在偏碱性条件下在短时间内几乎不分解,其紫外 吸光度无明显变化为观察CCK一8对ONOO足 否有直接清除作用.实验用l,5和10~g,/LCCK一8 与一定浓度的外源性ONOO一分别孵育5分钟,然 后用uV一220l型紫外分光光度计(日本岛津)检测 ()No()一吸光度的变化. 1.8统计学方法:实验数据用均数?标准差(?s) 表示.差异的显着性用非配对t检验进行分析. P<0.05为差异有显着性 2结果 2.1CCK一8对LPS诱导BPAEC凋亡变化的影 响:LPS孵育BPAEC24小时后,细胞G./G峰前 出现亚二倍体峰(凋亡峰),与对照组比较凋亡百分 率明显增高(P<0.O1);CCK一8可抑制LPS诱导 的凋亡增多,并为Pro翻转;流式细胞术双参数二维 圈显示,BPAEc胞体缩小,DNA含量减少;细胞核 荧光形态学检查各组细胞均有胞体缩小及核染色质 浓集,核固缩或碎裂.见表1,图1(见封3) 表1CCK一8对LPS诱导BPAEC凋亡变化的影响Gins) 组剐细里(竹)钥亡宴1)调亡细里复(十DNA平均菱光强直 注?与对照组比较:一P<0-01}与LPS组比较:P<0Ol{与 LPS+CCK一8组比较:4p<o.05 2.2CCK一8对LPS诱导BPAEC坏死变化的影 响:与对照组相比,LPS可引起BPAEC释放的 LDH活性明显增高(P<o.05),说明BPAEC坏死 数量明显增多;加用CCK一8后,LPS导致的细胞坏 死数量减少,Pro可部分抑制CCK一8的作用,但均 无明显差异(P均>0.05).见表2. l ?726? Z? 誓Z0o , 季. 刍 4OO 0 牛 掘 捌 募 《 8l0 540 270 10O200 DNA古量(道姑) 100200 DNA古量(道姑) ChlneseCridca】CareMedlcine,December2001,Vo__13,No.12 100200 DNA古量(道歙) 080” — j-IIri一————] 0100200 DNA音量(道数) A:对照组IB:LPS组;c:LPS+CCK一8组ID:LPS+CCK一8+Pro组 圉lCCK一8对LPS诱导BPAEC凋亡的DNA漶式细胞分斩直方圉 表2CCK一8对LPS孵育BPAEC培养上清液中育后,ONOO一的紫外吸光度均无明显变化,说明 MDA含量和LDH活性的影响(土)CCK一8对ONOO无直接清除作用. 注:与对照组比较:P<o.05一…P<o.OOl;与LPS组比 敕…P<0001}与LPS+CCK一8组比较;Ap<o.05 2.3CCK一8对LPS诱导BPAEC脂质过氧化变 化的影响:LPS孵育BPAEC的上清中MDA含量 明显高于对照组(P<O.001);加CCK,8后MDA 含量降低至对照组水平(尸<0.00]),Pro能翻转 CCK一8的保护作用(尸<o.05).见表2. 2.4CCK一8对LPS诱导BPAEC产生ONOO 的影响:与对照组相比,LPS可使BPAEC内NT含 量明显增高,说明ONOO一的生成增多,CCK一8对 IPs诱导BPAEC产生ONOO一具有抑制作用.见 表3. 2.5CCK一8对外源性ONOO的紫外吸光度的 影响:1,5和10vg/LCCK一8与外源性ONOO一孵 表3CCK一8对LPS诱导BPAEC产生ONOO 变化的影响(j土) 注与对照组比较:P<o05,…P<o.OOlI与LPS组比 较:P<0.05,P<O.01 3讨论 CCK是1976年确认的脑肠肽,对消化系统,中 枢神经系统和内分泌功能具有调控作用.CCK一8 是CCK羧基末端8个氨基酸残基,为内源性CCK 的主要功能片段.新近发现,CCK一8在肺脏也有分 布.,并在大鼠整体或离体肺动脉水平发挥细胞保 护作用,减轻LPS引起的肺脏炎症性病理变化和肺 动脉内皮功能抑制”,但其作用机制尚不明了.由 于肺血管内皮细胞功能障碍是急性肺损伤的主要发 病学环节,本实验中首次观察了CCK一8对LPS诱 叫—?叫_+ 中国危重病急救医学20,01年12月第13卷第12茸 导BPAEC损伤的影响结果显示,LPS孵育后的 BPAEC凋亡和坏死均明显增加,表明LPS诱导 BPAEC的损伤有凋亡和坏死两种形式.一般认为, 细胞坏死后释放多种物质.可诱导炎症细胞趋化,浸 润,加剧局部组织的损伤;而细胞捐亡为生理性死 亡.但是BPAEC凋亡与坏死一样都必然导致肺动 脉内皮细胞的功能障碍,这可能是LPS引起肺动脉 内皮依赖性舒张反应降低的重要原囤.CCK一8可 明显抑制LPS孵育后的BPAEC凋亡增加,并为其 受体非特异性阻断剂Pro所逆转;而对LPS引起的 BPAEC坏死影响不大表明CCK一8减轻LPS诱 导BPAEC损伤的重要途径是抑制细胞凋亡,此作 用可能由细胞CCK一8受体所介导CCK8受体 主要有A,B2种亚型,具体哪种亚型介导CCK,8 的抗凋亡作用有待进一步研究. 已知氧化应激是LPS引起细胞凋亡的重要原 因.ONOO一是NO和超氧阴离子(superoxide,o) 的快速非酶促化学反应产物,具有极强的氧化性,并 能衍生多种其它氧化剂...已有实验发现,外源性 ONOO一能损伤肺血管内皮功能,导致离体肺动脉 反应性异常变化”“;引起肺组织脂质过氧化和大鼠 肺微血管壁的通透性增高以及诱导BPAEC凋 亡”.在本实验中,CCK一8对IPS诱导培养的 BPAEC生成ONOO一有抑制作用,Pro并可翻转 LPS引起的BPAEc培养上清中MDA含量增高, 提示CCK一8抑制BPAEC凋亡作用可能与其减少 ONO0一生成和发挥抗氧化作用有关.我们以往的 研究发现,CCK8可提高内毒素血症时的血液中 特异性清除O的酶SOD活性.CCK一8抑制 ONOO一大量生成,而对ONOo一无直接清除作用, 提示CCK一8对LPS诱导肺动脉内皮细胞产生NO 或07有一定影响,间接说明CCK一8对一氧化氮 台酶(NOS)或SOD的基因表达可能具有调控作 ?727? 用,这是应当进一步研究的课题. 综上所述,本实验首次揭示,ccK一8对LPS诱 导的BPAEC凋亡有抑制作用,此作用由ccK一8 受体介导,并与其抑制ONOO一诱生,发挥抗氧化作 用有关. 参考文献: :1]宋勇.毛宝龄,钱桂生,等急性呻损伤大鼠肺组织细胞凋亡和 Fas/EasL表达的改变和意义.中华医学杂志.1999,79(3):230 222 [2]万拇,凌亦凌,菩振勇,等.内源性一氧化氮在内毒索引起肺动脉 高压和肺损伤中的作用生理.1999,51(1):80—86 [3:备振勇,凌亦凌,尤红煜,等.内毒素诱导肺内过氧亚硝基阴离子 生成的免疫组织化学研究.中国学术文摘(科技快报),2000, B(1):101—103 [4]凌亦凌.黄善生,张君岚,等,胆囊收缩索对内毒素休克大鼠 SOD,MDA厦吞噬细胞发光的影响.中国病理生理杂志.1997. 13(5):483—486. :I]凌亦凌.黄善生,王乐丰-等八肽瞻囊收缩素抗内毒索休克的实 验研究.生理,1990,48(4):390—394 [6]各振勇,凌亦凌孟爱壹,等.八肢胆囊收缩素对脂多糖诱导离体 免肺动脉反应性变化的影响.中国病理生理杂志,1999,15(6): 484—487. 卵]孟爱宏,王殿华,凌亦凌,等.CCK一8抗抑制TNF—离体兔肺 动脉舒张反应性噩其机制.河北压科大学,1999,20(3): 168—169. :8]备振勇,凌亦磕.内毒索诱导肺动脉内皮细帕生成ONOO一的意 义.中国应用生理学杂志.2001,17(4):379—382 [9:丛斌,馥亦馥.左被,等.SD大鼠肺组织中CCK一8的免疫组织化 学检测(摘要).中国病理生理杂志,1998.14(31:317. [103各振勇,凌亦凌,黄善生.NO:ONOO一……,氧化应激的新通 路.国外医学剖伤与外科基本同题分册,1999,200):83—87 [11]各振勇.过氧亚硝基朋离子弁导内毒索致肺血管损伤厦胆囊收 缩案的保护作用.生理科学进展,2001,32(2):135—137. :12]各振勇,凌亦睫,丛斌,等.过氧亚硝基阴离子I起大鼠肺微血管 壁通透性增高的研究.中国病理生理杂志,2000.10(7);043 645. [13]GrowAJ,ThomSR,I~chiropou[osH.Nitrkoxideandperox- ynitrite.mediatedpolmonarycelldeath.AmJPhysio1.1998, 274:L112一L118. (收稿日期2001—00—08修回日期{2001—11—12) (本文编辑;孙风嫔) ? 启事? 第7次全国危重病急救医学学术会议征文通知 中国中西医结合学台急救医学专业委贡台扭于2002年9月在乌鲁未齐召开第7次全国危重病惠救压学学术会议.末届 学术台议导向性议遛有4个方面:?多脏器功能失常埭合征(M0Ds)有关问题研究的新进展(包括发病机制,诊断及治疗); 消化系统惠症诊台的新进展}?感染的有关问题:脓毒症治疗的新对策,感染与免疫学,国家1类新药抗生素悉能的研制与 应用;临床常用的急救技术以上各项特邀请有关专车作专题报告征文内容包括:西医,中医,中西医结合,内,外,妇,儿, 脑神控,麻醉,放射,消化,窥镜,各学科基础与临床研究.主要病种包括;MODS与仝身曼性反应综合征(SIRS),一血詈,呼吸, 肾脏,营养代谢,胃肠与肝,胆,胰,介入治疗,内分泌,创伤,晓伤,惠腹症,护理技术,急救复苏,临床监洲新技术及惠救药物等. 征文要求:论文全文及摘要(500~600字)各1份,摘要应包括目的,方法,结果,结论.用稿纸正楷书定,标点井号要准确,着者 要顺序排列论文的全文字敷不艮,不载凡话文桌,仅供审稿时参考.来稿不论录取与否概不退还.文稿时请同时吏用纯文末文件排 版的软/t.,并每篇稿件邮寄审稿费10元截止日期:2002年6月19El.稿件寄吏地址:300050天津市和平区睦南道122号《中国 中西医结台急救杂志编辑部李银平收.联系电话/传真:022—23306917中国中西医结台学会惠救医学专业委员会 ? 728? ? 论着? ChinesCriticslCareMedicine,December2001.Vo】.13,No.12 小牛血清和血小板源性生长因子对肺动脉平滑肌细胞 Na+/H一交换器活性和细胞增殖的影?向 姚伟,钱桂生,杨晓静,陆傻羽 (第三军医大学新桥医院全军呼吸内科研究所,重庆400037) 摘要:目的:探讨小牛血清和血小板源性生长因子(PDGF)对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na/?H交换器一l (NHE—i)表达和活眭的影响,及其与细胞增殖的关系.方法:体外培养肺动脉平滑肌细胞,iD小牛血清, PDGFBB作用24小时后检测细胞NHE1mRNA表达,Na摄取量,细胞内pH(pHi)和HTdR掺入量, 观察不同浓度NHE—l抑制剂——乙基,异丙基氯氯吡眯(EIPA)对细胞凋亡率的影啊结果:10小牛血清, PDGF作用后24小时,肺动脉平滑肌细胞中NHE一1mRNA表达,Na摄取量明显增加,同时伴有pHi增高 和H—TdR掺八量增加.以lo小牛血清作用更为显着;随着E1PA浓度增加和作用时间延长,细咆凋亡率明 显增高.结论l,?,牛血清,PDGF等生长因子参与调节肺动脉平滑肌细胞NHE一1表达和檄活,使细胞内碱化, 可能在细胞增殖中起重要作用 关键词Na一./H交换器}血管平精肌}血清牛;血小板源性生长因子 中图分类号:Q253;Q256文献标识码:A文章编 号:l003—0603(2001)12—0728—04 derivedgrowthfactoronsodiumhydrogen Effectsofcalfserumandplatelet— - antiporteractivityandcellpro IlferationofpulmonaryarterysmoothmusclecellsYAOWei,Q,? Gui—sheng,YANGXiao—ring,LUJun —yu.InstituteofRespiratoryDisease,XinqiaoHospital,ThtrdMilitaryMPdzcdiUm?versity?Chongqing400037 Abstract:0bjecfive:T0exploretheeffectsofcalfserumandptateletderivedgrowthfactor(PDGF)on theexpressionandactivityofsodiumhydrogenantiporter一1(NHE一 1)ofpulmonaryarterysmoothmuscle cells(PASMCs)inrats,andtheirroleinPASMCsproliferation.MethodsPASMCswereculturedinvitro.Af- tertheexposureofPAsMCsto10calfserumandPDGFfor24hours,theexpressionofNHE—lmRNAwas determinedwithreversetranscription—polymerasechainreaction(RT—P CR),intracellularpH(pHi)wasmea suredwithfluorescentprobe—BCECF.NaandH—TdRincorporationwere determinedrespectively.Theef fectofNHE一 1specificinhibitor——EIPAontheapoptoticratesofPASMCswasstudiedwithreversetran— scriprion—polymerasechainreaction(TUNEL)insitucellapoptosiskit.ResMts:Comparedwiththegrowth TdRandNaincorporationsign arrestedcells.NHE—lmRNA,pHivalue,H— ificantlyincreasedinPASMCs exposedto10serumandPDGF.10calfserum—treatedcellshadhigherNHE 一1mRNAlevel,andNa andHincorporationthanPDGF—treatedcells.EIPAsignificanrlyelevatedtheapoptoticratioinPASMCs. Theeffect,vasenhancedwhenEIPAconcentrationincreasedandtheexposuretimeprolonged.Concluslons: SerumandPDGFregulatetheexpressionandactivationofNHE一1L? PASMCs,andinduceintracellularalka lizationconsequently.TheseeffectsmaybeimportantinPASMCsproliferation. Keywords:sodiumhydrogenantiportercvascularsmoothmuscle;calf;serumplatelet—derivedgrowthfac tor CLCnumber:Q253;Q256Documentcode:AArtiealID:1003—0603(2001) 12—0728—04 Na一/H交换器(NHE)是一种离子交换蛋白, 迄今共发现6种NHE亚型,分别为NHE—l,2,3,4, 5和6..其中NHE一1被认为是一种”看家基因”, 几乎在所有哺乳动物细胞的细胞膜均有分布,在调 节细胞内pH(pHi),细胞容积,细胞增殖等方面起 基金项目;国家自然科学基金资助项目(No.39870352) 作者简彳r;姚伟(1973一),男(汉族),河南省长垣人,博士,讲 师.主治匡师主要从事缺氧性肺动脉方面的研究,已发表论文5篇. 重要作用0.血管平滑肌细胞亦有NHE—l存在.正 常生理情况下,NHE—l处于非活化状态,当细胞受 到血清,生长因子等作用时,NHE一1被激活,在细 胞增殖的早期阶段即出现Na/H交换增强致使细 胞内碱化,这种变化在血管平滑肌细胞增殖中起”容 许性(permissive)”作用.但以往的研究仅限于主 动脉平滑肌细胞,由于细胞异质性的存在,NHE—l 对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响知之甚少.我们曾 甲国危重病急救医学2,2,01年l2月第13卷第12期 发现低氧性肺动脉高压大鼠的肺动脉平滑肌NHE 一 1mRNA表达增加.同时伴有pHi增高,这表明 NHE一1有可能参与了调节肺动脉平滑肌细胞增 殖本实验中检测了血清和血小板源性生长因子 (PDGF)作用后的肺动脉平滑肌细胞,以期发现 NHE一1活性改变与细胞增殖的直接关系. l材料与方法 1.1主要试剂及仪器:BCECF—AM,Nigericin (尼日利亚菌素).Ouabain(Na—K一ATP酶抑制 剂),乙基,异丙基氨氯吡咪(EIPA,均为美国Sigma 产品),M—MIV反转录酶,Taq酶(美国Promega 公司产品),Na[英国AmershamPharmacia公司 产品.462.5Ggq(1GBq一0.027Ci),比活度> 3.7Tgq/g],H—TdR(中国科学院上海原子能研 究所,37GBq/L,比活度1.11GBq/g),PDGF—BB, TripureRNA提取试剂,原位细胞凋亡检测试剂盒 (TUNEL法,德国Roche公司产品),PTC一200 DNA扩增仪(美国MJ公司品),LS一50B荧光分光 光度计(美国PerkinElmer公司产品),SX一100凝 胶成像分析系统(上海四星公司产品). 1.2方法: 1.2.1肺动脉平滑肌细胞原代培养及分组:组织块 种植法培养细胞.免疫细胞化学S—P法检测血管 平滑肌细胞n—actin表达.细胞纯度要求?95.取 第4,7代细胞进行pHi测定,反转录一聚合酶链反 应(RT—PCR),.H—TdR掺入和Na摄取实验.细 胞以1×10个几分别接种于24孔,96孔培养板及 75ml培养瓶中,待细胞铺满约80,90后,将含 10小牛血清的DMEM培养液换为0.1小牛血 清的DMEM培养液,静息48小时后分组,每组重 复6次:?对照组,即未处理组;?10血清组, 0.1小牛血清替换为1o小牛血清,24小时后进 行测定;?PDGF组,在含0.1小牛血清的培养液 中加入10lag/L的PDGF—BB,24小时后测定. 1.2.2肺动脉平滑肌细胞pHi测定:采用荧光探 针BCECF—AM检测,参照本实验室建立的方法. 将24孔培养板中表面长有细胞的盖玻片(o.5cin× 0.5cm,已灭菌)取出,PSS溶液(KC14mmol/L, NaCI140mmol/L,CaClz1.8mmol/L,MgC12 1.0mmol/L,HEPES20mmol/L,葡萄糖 10mmol/L,37?,pH7.4)中漂洗5分钟;放入含 有BCECF—AM(1.5,2.0mg/L)的PSS溶液中, 37?避光孵育3o分钟;PSS溶液中漂洗2,3分钟, 将未进入细胞内(即表面黏附)的BCECF—AM洗 ?729? 脱;玻片固定至LS一50B型荧光分光光度计附带的 固定支架上,石英比色杯内加入2ml37CPSS溶 液.固定架放入比色杯;应用LS一50B配套的 FIWINLAB程序的快速滤光片程序测定荧光强 度.激发波长为495nnl和440nm,发射波长为 530nm,激发波和发射波狭缝为10rim,每张玻片测 定时间为30秒.Nigericin法制作pHi标准曲线. Nigericin浓度为6.7~mol/I l2.3RT—PCR:按试剂盒说明书进行.Tripure 试剂提取75ml培养瓶中的肺动脉平滑肌细胞总 RNA,NHE一1引物序列:上游引物:5_TTCCCC ATGTGTGATCTGTTCC一3,下游引物:5L TCTCCATCTTGTGGTAGAAGC一3;PCR 扩增产物为325bp;以S—aetin为内参照,引物序 列j5端引物:5LCCAAGGCCAACCGCGAGA AGATGAC一3,3端引物:5._AGGGTACAT GGTGGTGcCGCCAGAC一3;PCR扩增产物 为587bp反转录参照试剂说明.PCR变性,退火和 延伸条件为:94C40秒,62?50秒,72?90秒, 共30个循环;末次延伸时间为10分钟.取10l反 应产物在2琼脂糖凝胶电泳,凝胶分析系统进行 摄像,条带吸光度(A)分析,以NHE一1和口一actin 电泳条带吸光度之比(AHE一.)作数据分析,以其比 值反映NHE一1mRNA的表达程度. 1.2.4肺动脉平滑肌细胞的Na摄取:采用”铵冲 击”法诱导细胞酸化.96孔培养板细胞中加入 50mmol/L氯化铵溶液(NHC150mmol/L,氯化胆 碱90mmol/L,KCl4mmol/L,CaCl21.8mmol/L, MgC121.0mmol/I,葡萄糖10mmol/L,HEPES 20mmol/L,pH7.4)作用10分钟后,吸出溶液,加 入氯化胆碱溶液(含氯化胆碱140mmo|/L,KC1 4mmol/L,CaCI21.8mmol/L,MgC121.0mmol/L, 葡萄糖10mmol/L,HEPES20mmol/L,Ouabain 1mmol/L,pH7.4),3,5分钟后吸出,每孔中加入 Na37kBq,5分钟后吸出,0.1mol/L冰冷MgCI2 溶液漂洗3次,细胞经胰蛋白酶消化后行7计数. 1.2.5H—TdR掺人实验:96孔培养板的相应组 细胞培养基内每孔加入.H—TdR37kBq,16小时后 终止,多头细胞收集器采集细胞于玻璃纤维素膜上, 生理盐水冲洗3次,10三氯乙酸固定后进行液 体闪烁计数. 1.2.6EIPA对细胞凋亡的作用:取第4,7代细 胞以1x10/L密度接种于24孔培养板中,待细胞 铺满约8o,90后,细胞在0.1血清的培养基 i ? 30? 中静48小时,用”铵冲击”法诱导细胞酸化后,分 为11组,分别为:正常对照组(未诱导酸化且并未加 EIPA);无EIPA组(酸化后未加EIPA);50~mol/L EIPAl2,24及48小时组;l00/~rno1./LEIPAl2,24 及48小时组;l50mo1/LEIPAl2,24及48小时 组;每组重复3次在相应时间点,进行原位细胞凋 亡检测,具体方法参照试剂盒说明苏木素轻度复 染,常规系列乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片. 高倍光镜下观察,至少观察5个视野,计数200个细 胞以上,计算阳性细胞的百分率. 1.3统计学方法:数据以均数?标准差(?)表 示,采用MicrosoftExcel97软件进行F检验和t检 验,P<O.05为差异有显着性. 2结果 2.1phi测定:l0血清组,PDGF组肺动脉平滑 肌细胞pHi明显高于对照组,1O血清组和PDGF 组间无显着差异,见表1. 2.2RT—PCR:10血清组,PDGF组肺动脉平滑 肌细胞中NHE—lmRNA表达明显高于对照组, 1O血清组高于PDGF组,见表1. 表1lo%fl~牛血清,PDGF对肺动脉平滑肌细胞pItl, NHE一1mRNA表选的影响(;士) 注:与对照组比较P<0.05,…P<0.o0i:与PDGF组 比较:Ap<005 2.3.H—TdR掺入实验:lo血清组,PDGF组肺 动脉平滑肌细胞H—TdR掺入量表达明显高于对 照组,l0血清组高于PDGF组,见表2. 表21O小牛血清,pDGF对肺动脉平滑肌细胞 NHE一1活性和细胞增殖的影响(;土)cpm 洼:与对照组比较:.P<0.05,一P<001t…P<0.00i; 与pDGF组比较:Ap<005 2.4”Na摄取量:l0血清组,PD3F组肺动脉平 滑肌细胞Na摄取量表达明显高于对照组,l0血 清组高于PDGF组,见表2 2.5原位细胞凋亡检测结果对照组凋亡率为(6.8 ?1.2),无EIPA组凋亡率为(7.0士1.9),2组 之间无显着差异,药物作用各组凋亡率较对照组均 显着增高(P均<0.001),凋亡率随药物浓度和作用 ChineseCritica【CKreMedicine,Decen~her2001,Vo】13.No12 时间的增加而增高,见图l. EIPA用时同(h) 囝1EIPA对肺动辟平滑啊L细胞凋亡率的影响 3讨论 研究表明,低氧性肺血管收缩,肺血管重构及继 发性红细胞增多等在低氧性肺动脉高压的形成和发 展过程中起着非常重要的作用,其中肺血管重构越 来越受到人们的重视,其主要特征为血管平滑肌细 胞表型由收缩型向合成型转变,并大量增殖引起血 管壁中层肥厚,同时伴有远端非肌性血管肌化.肺动 脉平滑肌细胞过度增殖的机制尚不完全明确,人们 发现生长因子,血管活性物质等作用时,主动脉平滑 肌细胞会出现NIlE一1表达及活性增高,同时伴有 细胞内碱化.因此推测NHE一1在平滑肌细胞增殖 中可能起”容许性”作用.NHE一1与Cl一/HCO7等 共同参与pHi的调节,其中NHE一1起主要的作 用,约占70.Quinn等0研究发现PDGF,表皮 生长因子(EGF)等生长因子能使肺动脉平滑肌细胞 pHi增高,同时伴有H—TdR掺入量增加;NHE一1 的特异性抑制剂二甲基氨氯吡眯(DMA)可以抑制 诱导酸化后细胞pHi的恢复,同时可以抑制细胞生 长,从而间接地证实了肺动脉平滑肌细胞中存在 NHE一1.我们既往的实验证实:低氧性肺动脉高压 大鼠的肺动脉平滑肌细胞pHi明显增高,同时发现 其NHE—lmRNA表达亦明显增加.说明在低氧性 肺动脉平滑肌细胞增殖中,pHi可能也具有重要的 调节作用.NIlE一1参与调节肺动脉平滑肌pHi,使 细胞内碱化,与其它囡素共同作用,诱导细胞增殖, 最终导致肺血管重构和肺动脉高压的发生. 血清等有丝分裂原促使细胞增殖的机制主要包 括蛋白激酶C激活,钙离子动员,磷脂酶C激活, NHE—l激活和c—los等原癌基因表?