镉对长江化溪蟹心脏组织器官的毒性作用及机制研究

镉对长江化溪蟹心脏组织器官的毒性作用及机制研究 镉对长江化溪蟹心脏组织器官的毒性作用及机制研究 【摘要】:本学位综合采用光镜、电镜、酶学、流式细胞术、基因克隆、实时荧光定量PCR等手段与方法,以长江华溪蟹(Sinopotamonyangtsekiense)作为研究对象,采用急性毒性实验方法,研究了不同浓度镉暴露对心脏组织器官的影响,旨在阐明镉对心脏的毒性效应和致毒机制。为了研究镉对心脏组织器官的细胞与生化毒理学效应,就心肌细胞显微与亚显微结构进行了观察,并且检测了镉的蓄积、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)三种抗氧化酶的活力和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量,探讨了心肌细胞结构改变和氧化应激之间的关系。在此基础上,为了求证镉对心脏造成氧化损伤后是否进一步诱导心肌细胞发生凋亡,分别采用Hoechst33258荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳法、AnnexinV-FITC/PI流式细胞技术和Caspase-3酶活力测定的方法,检测了镉对心肌细胞凋亡的影响。之后,为了探明心脏对镉的应答反应,采用RT-PCR技术克隆得到了长江华溪蟹一种热休克蛋白70(SyHSP70)基因的部分cDNA序列,并利用实时荧光定量PCR技术检测了镉诱导SyHSP70和MTmRNA达的变化特征。主要研究内容和结果如下:1、镉对长江华溪蟹主要组织器官细胞的影响采用石蜡切片和H.E.染色方法,研究了7.25、14.50、29.00、58.00、116.00mg?L-1镉暴露4d后,对长江华溪蟹肝胰腺、鳃、心脏和精巢四种主要组织器官组织细胞的影响,旨在为后续研究工作奠定基础,为镉对溪蟹生化、分子水平 的影响提供支持和依据。结果显示,四种组织器官均有不同程度的损伤,且随镉浓度的增大损伤不断加重。肝胰腺组织细胞的变化包括:R细胞数目持续增加、空泡化,坏死细胞脱落和腺管坏死等。鳃组织细胞:鳃叶间隙紊乱,pillar细胞系统被破坏,肾原细胞和血细胞数目增加,鳃叶变宽,多处鳃叶上皮断裂以及有毛细管扩张现象。心脏组织细胞:灶性区域变性和坏死,并伴随有炎细胞浸润现象。精巢组织细胞:生精细胞排列不规则,空泡样结构增多,初级精母细胞和次级精母细胞核固缩现象加剧,管腔内精细胞减少,生精细胞以及生精小管坏死。实验结果提示镉暴露后溪蟹主要组织器官结构的改变很可能影响了生物体的主要生理功能,例如肝胰腺的吸收、储存和分泌,鳃的呼吸、渗透和离子调节及精子发生。研究结果表明组织病理学的变化能够灵敏反映镉对甲克动物的胁迫程度及毒性大小,可作为水生态环境镉污染程度的生物评估指标。2、镉诱导长江华溪蟹心脏组织细胞结构的改变与氧化损伤作用采用急性体外镉暴露法,研究了7.25、14.50、29.00、58.00、116.00mg?L-1镉暴露1d、3d、5d、7d后长江华溪蟹心脏中镉蓄积情况和显微结构与亚显微结构、抗氧化酶活性和脂质过氧化的变化。结果显示,镉的积累具有浓度-效应关系,在镉浓度116.00mg?L-1暴露5d时积累量达到最大(14.0?1.67μg?g-1),是对照组的13.2倍。光镜观察发现,镉暴露时间较短时对心脏组织细胞的影响不明显。但是随浓度和时间的增加,出现心肌水肿、空泡变性、玻璃样变性、炎细胞浸润等病理现象。透射电镜观察显示,心肌细胞核变形、染色质浓缩边集、核固缩、核碎裂,线粒体空泡化、嵴断裂、嵴溶解,内质网膨胀, 肌原纤维水肿以及有炎细胞浸润现象。心脏抗氧化酶活性也发生了不同程度的改变,SOD活性在整个处理期间显著增高,CAT和GPx活性分别在暴露5d的14.50mg?L-1和7.25mg?L-1浓度组升高,之后活性降低。MDA含量在5d和7d时显著增加,脂质过氧化加剧。结论:镉的高浓度及长时间积累对心脏有明显的毒性作用,其作用机制与氧化胁迫和脂质过氧化有关。3、镉诱导长江华溪蟹心肌细胞凋亡的研究采用Hoechst33258荧光染色法、琼脂糖凝胶电泳法、AnnexinV-FITC/PI 流式细胞术、Caspase-3酶活力测定的方法,分别从细胞形态学和生物化学水平观察和检测了急性镉暴露(7.25、14.50、29.00、58.00、116.00mg?L-1)1d、3d、5d和7d诱导长江华溪蟹心肌细胞凋亡的情况。结果显示,荧光显微镜未观察到典型的凋亡细胞核形态学变化;琼脂糖凝胶电泳图谱未出现凋亡细胞所特有的梯状条带;流式细胞技术检测发现虽然细胞凋亡率增加,但与对照组相比无统计学意义(P0.05);Caspase-3活性也没有显著性变化(P0.05)。因此,在本实验所选取的浓度和时间范围内,镉未诱导长江华溪蟹心肌细胞发生细胞凋亡,这与本课组前期研究中观察到的肝胰腺、精巢组织在染毒2d、7d发生细胞凋亡的情况明显不同。原因可能与心脏组织的特殊功能有关。4、镉诱导长江华溪蟹心脏热休克蛋白70和金属硫蛋白基因表达的研究采用RT-PCR技术从长江华溪蟹心脏组织中克隆得到一种热休克蛋白70(SyHSP70)基因的部分cDNA序列,长度为1735bp。将获得的cDNA序列以及推导的氨基酸序列采用BLAST程序与GenBank数据库进行同源性搜索,结果发现,该cDNA序列和氨基酸序列与甲壳动物的 HSP70有极高的同源性,分别高达89%和97%。利用实时荧光定量PCR技术研究了7.25、14.50、29.00、58.00、116.00mg?L-1镉暴露1d、3d、5d、7d对心脏SyHSP70和MTmRNA表达的影响。结果表明,在镉浓度58.00mg?L-1、116.00mg?L-1处理1d和镉浓度7.25mg?L-1、14.50mg?L-1处理3d时SyHSP70mRNA的表达量(以(3-actinmRNA水平为内参)显著下降,但是,5d和7d的所有浓度组SyHSP70mRNA的表达无明显变化(P0.05)。镉暴露显著诱导了心脏MTmRNA的表达,且随镉浓度的增大和暴露时间的延长,MTmRNA的表达一直增加,浓度-效应和时间-效应关系明显。本研究结果显示长江华溪蟹心脏对镉的应激机制包括MTmRNA的增加。【关键词】:长江华溪蟹心脏组织组织细胞结构氧化损伤细胞凋亡热休克蛋白70镉 【学位授予单位】:山西大学 【学位级别】:博士 【学位授予年份】:2012 【分类号】:X174 【目录】:中文摘要13-16ABSTRACT16-20第一章综述20-411镉的污染现状20-231.1水环境镉的污染现状20-221.2甲壳动物镉的污染现状22-232镉对甲壳动物的毒性作用23-312.1镉在甲壳动物体内的吸收与积累及分布23-252.2镉对甲壳动物生物大分子的影响25-282.2.1镉对甲壳动物酶的影响26-272.2.2镉对甲壳动物蛋白质的影响272.2.3镉对甲壳动物DNA的影响27-282.2.4镉对甲壳动物脂质过氧化的影响282.3镉对甲壳动物组织器官及细胞的影响28-312.3.1 镉对甲壳动物鳃的影响28-292.3.2镉对甲壳动物肝胰腺的影响29-302.3.3镉对甲壳动物心脏的影响302.3.4镉对甲壳动物性腺的影响30-312.4镉对甲壳动物个体的影响313甲壳动物热休克蛋白研究进展31-383.1热休克蛋白概述31-363.1.1热休克蛋白的分类32-333.1.2热休克蛋白的生物学特性333.1.3热休克蛋白的表达调控33-343.1.4热休克蛋白的功能34-363.2甲壳动物热休克蛋白的研究意义和进展36-383.2.1甲壳动物热休克蛋白的研究意义363.2.2甲壳动物热休克蛋白的研究进展36-384本学位论文的研究目的和意义38-414.1研究背景38-394.2研究目的和意义39-41第二章镉对长江华溪蟹主要组织器官细胞的影响41-561材料与方法43-441.1实验材料431.2实验方法43-441.2.1实验设计431.2.2苏木素—伊红(H.E.)染色光镜观察43-442结果44-522.1镉对长江华溪蟹肝胰腺组织细胞的影响44-462.2镉对长江华溪蟹鳃组织细胞的影响46-482.3镉对长江华溪蟹心脏组织细胞的影响48-502.4镉对长江华溪蟹精巢组织细胞的影响50-523讨论52-543.1镉对长江华溪蟹肝胰腺组织细胞的影响分析52-533.2镉对长江华溪蟹鳃组织细胞的影响分析53-543.3镉对长江华溪蟹心脏组织细胞的影响分析543.4镉对长江华溪蟹精巢组织细胞的影响分析544结论54-56第三章镉诱导长江华溪蟹心脏组织细胞结构的改变与氧化损伤作用56-751材料与方法57-601.1实验材料57-581.2实验方法58-601.2.1实验设计581.2.2心脏镉含量测定581.2.3苏木素—伊红(H.E.)染色光镜观察58-591.2.4透射电镜标本的制备与观察591.2.5酶活性测定59-601.2.6MDA含量测定601.3数据处理602结果 60-692.1镉在长江华溪蟹心脏中的积累60-612.2镉对长江华溪蟹心肌显微结构的影响61-622.3镉对长江华溪蟹心肌亚显微结构的影响62-682.3.1细胞核62-632.3.2线粒体632.3.3内质网632.3.4肌原纤维632.3.5炎细胞63-682.4镉对长江华溪蟹心脏抗氧化酶活性和脂质过氧化的影响68-693讨论69-733.1镉在长江华溪蟹心脏中的积累69-703.2镉对长江华溪蟹心肌显微结构的影响分析70-713.3镉对长江华溪蟹心肌亚显微结构的影响分析713.4镉对长江华溪蟹心脏抗氧化酶活性和脂质过氧化的影响分析71-734结论73-75第四章镉诱导长江华溪蟹心肌细胞凋亡的研究75-861材料与方法76-781.1实验材料761.2实验方法76-781.2.1实验设计761.2.2凋亡细胞的核形态学观察76-771.2.3DNA提取与凝胶电泳分析771.2.4流式细胞仪检测细胞凋亡77-781.2.5Caspase-3酶活力测定781.3数据处理782结果78-832.1Hoechst33258荧光染色观察镉诱导长江华溪蟹心肌细胞凋亡78-792.2琼脂糖凝胶电泳法检测镉对长江华溪蟹心肌细胞凋亡的影响79-812.3镉对长江华溪蟹心肌细胞凋亡率的影响81-822.4镉对长江华溪蟹心脏Caspase-3活力的影响82-833讨论83-844结论84-86第五章镉诱导长江华溪蟹心脏热休克蛋白70和金属硫蛋白基因表达的研究86-1021材料与方法88-901.1实验材料881.2实验方法88-901.2.1实验设计881.2.2引物设计与合成88-891.2.3总RNA提取和第一链cDNA的合成891.2.4SyHSP70cDNA部分片段的PCR扩增891.2.5实时荧光定量PCR检测SyHSP70和MTmRNA的表达89-901.3数据处理902结果90-962.1长江华溪蟹心脏总RNA的提取 902.2SyHSP70基因cDNA部分片段的克隆90-932.3SyHSP70序列分析和同源性比较93-942.4镉对长江华溪蟹心脏SyHSP70mRNA表达的影响94-952.5镉对长江华溪蟹心脏MTmRNA表达的影响95-963讨论96-993.1长江华溪蟹SyHSP70cDNA的克隆及其序列分析97-983.2镉对长江华溪蟹心脏SyHSP70mRNA表达的影响分析983.3镉对长江华溪蟹心脏MTmRNA表达的影响分析98-994结论99-102参考文献102-123致谢123-125个人简况及联系方式125-126攻读学位期间取得的研究成果126-129 本论文购买请联系页眉网站。