[doc] 阿霉素对大鼠膈肌的毒性损伤作用研究

[doc] 阿霉素对大鼠膈肌的毒性损伤作用研究 阿霉素对大鼠膈肌的毒性损伤作用研究 ? 382-隹海医药》2008年9月第26卷第5期JHuaihaiMed.Scot.2008.Vo1.26.No.5 阿霉素对大鼠膈肌的毒性损伤作用研究 罗晓斌,关宿东 【摘要】目的研究阿霉素对大鼠膈肌的毒性损伤作用,探讨其可能机制.方法Sprague—Dawley大鼠20只,随 机分为2组,对照组及阿霉素组各10只.应用体外灌流大鼠膈肌肌奈方法,分别测量其单收缩张力(Pt),最大强直张 力(Po),张力一频率曲张(Force—frequency),峰值收缩时间(CT),半舒张时间(1/2RT),张力最大上升速度(+dT/dt…) 及张力最大下降速度(一dT/dt…),同时检测膈肌中超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA),琥珀酸脱氢酶(SDH)活 性,应用电子显微镜观察膈肌组织的超微结构形态变化.结果(1)阿霉素组大鼠膈肌Pt,Po,+dT/dt及一dT/dt 明显低于对照组(P<0.01),(2)予10,20,40,60,100Hz频率刺激膈肌时,阿霉素组大鼠膈肌张力明显低于对照组(P <0,01).(3)阿霉素组大鼠膈肌组织的SOD含量明显低于对照组(P<0.01),MDA含量明显高于对照组(P< 0.01);阿霉素组大鼠膈肌组织的SDH含量低于对照组(P<0.01).(6) 电子显微镜观察可见阿霉素大鼠膈肌肌纤维 断裂,z线结构模式不清晰,线粒体肿胀变性,部分有空泡变和髓样小 体形成.结论阿霉素能使大鼠膈肌产生脂质 过氧化,自由基生成增多,SDH活性下降,超微结构受到破坏,损伤膈 肌收缩功能. 【关键词】阿霉素;大鼠;膈肌;收缩性;自由基;毒性试验 【中图分类号】R965.3【文献标识码】A_【文章编号】 -7044(2008)05-0382-03 1008 Protectiveeffectofligustrazineonrat?diaphragmiajuredbydoxorubicinLUOXiao—bin,GUANSu—a6Dng.(Department ofRespiration,SuiningHospital,Sichuan629000,China) 【Abstract】 ObjectiveTostudytheimpairmentofdoxorubicinonrat,sdiaphragmandthemechanismofimpair— ment.MethodsTwentySDratsweredividedintocontrolgroup(n=10)anddoxorubicingroup(n=10).Peaktwitchtension (Pt),maximumtetanictension(Po),force—frequencycurve,timetopeakcon traction(CT),halfrelaxationtime(1/2RT),max? imalratesofcontraction(+dT/dtax),maximalratesofrelaxation(一 dT/dt.~x),superoxidedismutase(SOD),malondialdenyde (MDA)andsuccinatedehydrogenase(SDH)weremeasured;andvarietyoful trastructuresofratesdiaphragmwereobserved. Results(1)Po,Pt,一 dT/dtand+dT/dtinthedoxorubicingroupwerelowerthanthoseinthecontrolgroup(P< 0.01);(2)Comparedwiththecontrolgroup,tetanicforceunderthestimulusfrequencyof10,20,40,60andlOOHzinthe doxorubicingroupdecreasedsignificandy(P<0.O1).(3)SODinthedoxorubicingroupwaslowerthanthatinthecontrol group(P<0.01),andMDAinthedoxorubicingroupincreasessignificantly(P<0.01).SDHinthedoxorubicingroupwas lowerthanthatinthecontrolgroup(P<0.01).(6)Theultrastructuresunderelectronmicroscopeindicatethatdiaphragmfi— bresinthedoxorubicingroupfracturedIZlinesflurred,mistochondrionssweHedanddegenerated.ConclusionDoxorubicin canpromotediaphragmtoproducemorefreeradicals,reduceSDH,destroythediaphragmaticultrastructureanddepresscon— tractionfunction. 【Keywords】 Doxorubicin:Rats;Diaphragm:Contraction:Freeradical;Toxicitytests 阿霉素(doxorubicin)属蒽醌类抗生素,是临床常 用的广谱,高效的抗肿瘤药物,对肺癌,肝癌,乳癌等 实体肿瘤以及急性白血病,恶性淋巴瘤有明确的疗 效,但其对正常机体组织亦有一定的损伤作用.有研 究表明,阿霉素能损害膈肌的收缩功能,使膈肌易发 生疲劳?J,而膈肌疲劳可导致呼吸衰竭2J.本实验 旨在研究阿霉素对大鼠膈肌收缩功能和超微结构的 损伤及其可能机制. 1材料与方法 1.1材料主要药品与试剂:(1)注射用盐酸阿霉 素(规格10mg/支,深圳万乐药业有限公司,批号: 922001);(2)无水碳酸氢钠,硫酸镁,氯化钠,氯经 【作者单位】 【作者简介】 1.四川省遂宁市人民医院呼吸科,629000;2.蚌埠医学 院,安徽蚌埠233003 罗晓斌(1972一),男,安徽铜陵市人,主治医师,研究生. 钾,氯化钙,磷酸二氢钠与葡萄糖均为国产普通分析 纯试剂;(3)SOD,MDA测定试剂盒购于南京建成生 物工程研究所;(4)特种气体:95%O和5%CO2混 合气体由合肥特种气体厂提供;(5)主要仪器与设 备:?张力换能器(型号JZ100,高碑店市新航机电设 备有限公司);?智能八道生理记录及分析系统(型 号RM-6280,中国成都仪器厂);?透射式电子显微 镜(JZOL一1230型,Et本). 1.2方法 1.2.1动物模型建立及分组实验选用Spragur. Dawley大鼠2O只(由蚌埠医学院动物中心提供),雌 雄不拘,体重(204?35)g.适应性饲养7d,随机分 为2组.对照组lO只,每日腹腔注射生理盐水约 1.5ml,共8次;阿霉素组lO只,隔Et腹腔注射阿霉 素3mg/kg(用生理盐水稀释至lrn1),共4次,并每 Et腹腔注射生理盐水0.5ml,共8次.所有大鼠均自 淮海医药》2008年9月第26卷第5期JHuaihaiMed,Sept.2008,Vol26. 由饮水和进食. 1.2.2取材将对照组和阿霉素组大鼠各l0只以 20%氨基甲酸乙脂5ml/kg麻醉后去头,在5min内 将膈肌,包括中心腱及其附着的部分肋骨取出,置人 充满Krebs液[(组成mmol/L):135NaC1,5KC1, 2.5CaC12,1MgSO4,1NaH2PO4,15NaHCO3和1C6H12 0,pH7,3,7.4]的玻璃皿中,持续通人95%02和 5%CO的混合气.每块膈肌沿着其中央腱被分成两 半,依肌纤维走行方向取右半侧膈肌中央长方形部分 肌条(保留肋骨及中心腱部分)作力学检测. 1.2.3离体膈肌张力测定参照PrezantDJ和 CoombesJS4等方法检测.将制备好的膈肌肌条垂 直悬挂于装满Krebg液的麦氏浴槽中,麦氏浴槽中持 续通人95%0:和5%CO:的混合气.麦氏浴槽置于 超级恒温浴槽中并维持37~C.膈肌条的肋骨端用蛙 心夹固定在浴槽底部.肌条的中央腱端用缝线结扎 并连接于张力换能器.张力换能器固定在一微调节 固定器上,以便调节膈肌肌条的初长度.调节肌肉长 度至产生单收缩张力最大时,即肌条处于最适初长度 ()时,将所有肌条皆静置稳定20min.各项力学 指标检测均在下进行,电子刺激器输出电脉冲通 过2根放置在肌条两侧的铂金丝电极(电极间距约 0.4em)以超最大电压直接刺激膈肌[刺激强度逐步 增加至单收缩张力最大时,然后再增加至其数值的 130%,即超最大电压(约20V)]_3.张力传感器的 输出信号由智能八道生理记录及分析系统记录分析. 测定下列参数. 1.2.3.1收缩特性每根肌条测定两次在时 的单收缩张力(Pt),峰值收缩时间(crr),半舒张时间 (1/2RT),张力最大上升速率(+dT/dt)及张力最 大下降速度(一dT/dt).每次刺激(刺激参数:超 最大电压20V,波宽2ms)间隔2min,以两次平均值 作为测定值. 1.2.3.2最大强直收缩张力强直收缩张力是在 单收缩刺激后静置10rain以超最大电压,波宽2ms, 串长400ms,频率依次为10Hz,20Hz,40Hz,60Hz, 100Hz每隔2min刺激膈肌条1次.Prezant等研究 表明,在37?时,波宽2ms,持续400ms的电刺激足 以使肌条产生的力达到稳定状态.以100Hz刺激时 产生的强直收缩张力为最大强直收缩张力(Po).其 值与单收缩张力的值均由膈肌肌条的横截面积 (crosssectionalarea,CSA)化后表示(单位:N/ em). 1.2.3.3张力.频率曲线测定根据10Hz,20Hz, 40Hz,60Hz,100Hz刺激下的膈肌张力绘出张力.频 率曲线. 1.2.3.4计算CSA测定完成后,测量肌条长度,去 除肌条的非肌肉组织后用滤纸吸干水分,称重,计算 膈肌条的横截面积(CSA).计算公式:CSA(em)= 肌条重量(g)/肌条长度×膈肌肌肉密度(g/m).膈 肌肌肉密度以1.056g/em计算. 1.2.4生化指标检测取2组大鼠左侧膈肌检测 SOD活力(羟胺法),MDA含量(TBA法),SDH活性 (比色法). 1.2.5电子显微镜结构观察将对照组和阿霉素组 右侧剩余部分膈肌取小块放置于2.5%戊二醛溶液 (安徽省立医院提供)中固定,应用电子显微镜观察 膈肌的超微结构. 1.3统计学方法实验数据以均数?标准差(?s) 表示,实验数据采用单因素方差分析(one-wayANO— va),P<0.05有统计学意义. 2结果 2.1膈肌的收缩特性阿霉素组大鼠膈肌的单收缩 张力(Pt)及最大强直收缩张力(Po)明显低于对照组 大鼠(P<0.O1).阿霉素组大鼠膈肌的峰值收缩时 间,半量舒张时间与对照组无明显差异.阿霉素组大 鼠膈肌张力最大上升速率(+dT/dt)及张力最大 下降速率(一dT/dt)均明显下降(P<0.O1),见表 1. 表1阿霉素对大鼠膈肌收缩功能的影响(?s,n=10) 组别PI(N/cm)P0(N/cm)or(ms)I/2~(ms)+DT/dt一DT/dt 对照组5,5?1.0716.6?3.I732.7?2.0626.8-,-2.38,0?1.124.5:tO.39 阿霉素 ?H3.3?O.90??8.8?2.07??32,2?4.1025.2?4,373,8?O.922.6?O.49’’ 注:与对照组比较,P<n01. 2.2膈肌收缩的张力一频率关系在每隔2min依 次给予大鼠膈肌肌条10Hz,20Hz,40Hz,60Hz,100 Hz刺激时,阿霉素组大鼠膈肌的各频率下的收缩张 力均明显低于正常对照组(P<0.01).见图1. 盅 \ 弓 器 2O 15 10 5 —?一对照蛆 — ?一阿霉素姐 淮海医药》20o8年9月第26卷第5期JHuaihaiMed,Sept.2008.vo1.26.No.5 0.01),MDA含量升高(P<0.01),SDH活性均明显 降低(P<0.01),见表2. 表2阿霉素对大鼠膈肌 SOD,MDA和SDH活性的影响(?s,,l=1O】 组别SOD(u/mgprot)MDA(nmol/mgprot)SDH(u/mgprot) 对照组179.114-7.483.704-0.301.074-0.16 阿霉索组159.54?17.55—4.5O?0.31—0.80?O.O9一 注:与对照组比较,一P<0.01. 2.4电子显微镜下大鼠膈肌超微结构的观察电镜 下观察对照组大鼠膈肌纤维结构完整,z线清晰,线 粒体无肿胀变性.阿霉素组大鼠膈肌肌纤维萎缩,z 线模糊不清晰,线粒体肿胀变性,部分有空泡变和髓 样小体形成. 3讨论 Pt和Po为评价膈肌收缩肌功能的常用指标. 本实验结果表明,应用阿霉素后大鼠膈肌Pt及Po较 正常对照组明显下降,其值的下降提示阿霉素损害了 膈肌的收缩功能.另阿霉素组大鼠膈肌的(+dT/ dt)及(一dT/dt)较正常对照组明显下降,张力一 频率曲线较正常组右移,亦提示了阿霉素对大鼠膈肌 收缩功能的损害. 大鼠腹腔注射阿霉素能升高心肌细胞肌酸激酶 (CK)水平,并提高脂质过氧化水平,增加丙二醛 (MDA)含量..J.阿霉素能干扰细胞内Ca?稳态,激 活肌浆网Ca”释放通道.随着阿霉素作用时间延 长,脂质过氧化加重,氧自由基损伤是膈肌疲劳及收 缩功能损害的主要机制之一_8;而质膜损伤导致 ca?内流失控,细胞内钙进一步升高,细胞内钙超载 影响膈肌收缩及舒张特性,故本实验中阿霉素组大鼠 膈肌Pt,Po,+dT/dt,一dT/dt均明显下降,而钙 超载的结果又可诱发脂质过氧化,使组织中SOD活 力降低,氧自由基生成增多,能损害的主要机制之 一 ,而细胞内钙超载又影响膈肌收缩及舒张特 性,故阿霉素大鼠膈肌Pt,Po,+dT/dt及一dT/dt 均明显下降,张力.频率曲线较正常组右移.本实验 中模型组大鼠膈肌组织的SOD活力明显降低,MDA 含量明显升高,MDA是脂质过氧化过程中的中间产 物,其含量的增加提示脂质过氧化的增强,故可解释 模型组膈肌收缩功能的下降. 另外,质膜氧化损伤导致线粒体膜结构的损伤, 使其功能发生障碍.本实验结果表明阿霉素组大鼠 膈肌组织的SDH活性明显低于对照组,SDH作为氧 化磷酸化过程中重要的酶类,其活性降低影响细胞的 氧化供能,从而损害膈肌的收缩功能. 电子显微镜观察大鼠膈肌超微结构表明,阿霉素 组大鼠膈肌肌纤维萎缩,z线模糊,线粒体肿胀变性, 部分有空泡变和髓样小体形成,这一方面揭示了膈肌 收缩功能损害形态学基础,另一方面又在形态学上支 持了阿霉素对膈肌的毒性损伤作用.其形态学上的 损伤改变,我们认为是由于阿霉素致使膈肌细胞膜产 生脂质过氧化,氧自由基生成增多,造成质膜损伤,同 时阿霉素所致细胞内钙超载加重了这种趋势. 阿霉素能使大鼠膈肌产生脂质过氧化,自由基生 成增多,SDH活性下降,超微结构受到破坏,损伤膈 肌收缩功能. 【参考文献】 [1]关宿东,葛敏.牛磺酸对阿霉素致膈肌毒性的保护作用[J]. 中国药理学通报,2001,17(2):220~22. 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